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PLOS ONE: Evaluación de la Actividad quimiosensibilizantes de TAT-RasGAP317-326 en la Infancia Cancers

2014/8/22


Extracto

A pesar de que los protocolos actuales contra el cáncer son los efectos secundarios, razonablemente eficaces asociados al tratamiento a largo plazo, inducidos por la falta de especificidad de los procedimientos contra el cáncer, siguen siendo un problema difícil en oncología pediátrica. TAT-RasGAP
317-326 es un péptido de células permeable derivado de RasGAP que actúa como un sensibilizador a diversos tratamientos contra el cáncer en las células tumorales de adultos. En el presente estudio, se evaluó el efecto de TAT-RasGAP
317-326 en varias líneas celulares de cáncer de la infancia. La muerte celular inducida por el péptido derivado de RasGAP se analizó en varios neuroblastoma, sarcoma de Ewing y líneas celulares de leucemia (así como en los linfocitos normales). La muerte celular se evaluó mediante citometría de flujo métodos en la ausencia o en la presencia del péptido en combinación con diversos genotoxinas utilizados en las clínicas (4-hidroperoxiciclofosfamida, etopósido, vincristina y doxorrubicina). Todos probados tumores pediátricos, en respuesta a al menos una genotoxina, fueron sensibilizados por TAT-RasGAP
317-326. El péptido derivado de RasGAP no aumentó la muerte celular de los linfocitos normales, solo o en combinación con la mayoría de las quimioterapias probadas. En consecuencia, TAT-RasGAP
317-326 puede beneficiar a los niños con tumores mediante el aumento de la eficacia de las terapias contra el cáncer en particular permitiendo reducciones en la dosis de medicamento contra el cáncer y los efectos secundarios inducidos por fármacos asociados.

cita: Chevalier N, N bruto, Widmann C (2015) Evaluación de la Actividad quimiosensibilizantes de TAT-RasGAP
317-326 en cánceres pediátricos. PLoS ONE 10 (3): e0120487. doi: 10.1371 /journal.pone.0120487

Editor Académico: Salvatore Papa, Instituto de Hepatología - Birkbeck, Universidad de Londres, Reino Unido

Recibido: 3 de octubre de 2014; Aceptado 23 de enero de 2015; Publicado: 31 Marzo 2015

Derechos de Autor © 2015 Chevalier et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Los datos relativos a los perfiles de CGH array de las líneas de células de neuroblastoma derivadas NB1 se obtuvieron de un tercero: el Dr. Aurélie Coulon (aurelie.coulon@gmail.com) de la Unidad de Investigación de Oncología pediátrica del hospital Universitario Centro (CHUV), Lausana, Suiza) donde los lectores pueden enviar solicitudes de datos

Financiación:. La financiación proporcionada por la fuerza fundación - http://www.force-fondation.ch/(NC GN); comunión MD-doctorado de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (n ° 158116) (Carolina del Norte). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer representa la segunda causa de muerte en los niños después de los accidentes en los países industrializados [1, 2]. Nuestra comprensión de los cánceres infantiles se ha beneficiado de los avances significativos en las cuatro últimas décadas. Los tratamientos estándar para curar tumores pediátricos son la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia intensiva de múltiples agentes tales como etopósido, vincristina, doxorrubicina y ciclofosfamida [3].

En los países desarrollados, el ochenta por ciento de los niños que son diagnosticados con cáncer se espera que sobrevivir dentro de los 5 años siguientes al tratamiento. Sin embargo, la mayoría de ellos sufren de enfermedades crónicas por 40 años de edad [4]. vigilancia especial de los sobrevivientes de cáncer pediátrico muestra un alto riesgo de efectos tardíos que amenazan la vida de los segundos cánceres, enfermedades cardíacas y enfermedades pulmonares [5, 6]. El riesgo de mortalidad temprana se determina principalmente por factores de tratamiento específico tal como la dosis acumulativa de la quimioterapia [7]. Por lo tanto, los efectos secundarios a largo plazo asociados al tratamiento inducida por el daño a células no tumorales son un problema difícil y permanecen en gran medida sin resolver. Como los niños son por definición los supervivientes a largo plazo, hay una fuerte necesidad de desarrollar baja toxicidad, mejor orientada y eficientes nuevas estrategias terapéuticas para todos los tipos de cáncer infantil [8]. Las estrategias para sortear estos obstáculos incluyen la mejora de la sensibilidad contra el cáncer de drogas y especificidad hacia las células del cáncer [9-11].

En este contexto, hemos informado anteriormente de que un péptido que penetra en las células derivado de la proteína p120 RasGAP , llamado TAT-RasGAP
317-326, es un tumor de sensibilizador a varios fármacos contra el cáncer. De hecho, a pesar de que no muestra ninguna toxicidad para las células por sí misma, sensibiliza de manera eficiente y específicamente a las células tumorales adultos
in vitro
y
in vivo
a varias terapias contra el cáncer, incluyendo la quimioterapia [ ,,,0],12,13], y la terapia fotodinámica [14]. Es importante destacar, que muestra especificidad para las células cancerosas, ya que no sensibiliza células no tumorales la apoptosis inducida por genotoxina en [12, 14]. TAT-RasGAP
317-326 parece tener actividad contra el cáncer adicionales a la sensibilización de las células tumorales, ya que ha sido recientemente demostrado que este péptido puede obstaculizar la migración celular y la invasión
in vitro
[15, 16] y que esta actividad puede inhibir el proceso de metastatización
in vivo
[17]. Esto indica que el péptido derivado de RasGAP tiene la capacidad de actuar como un compuesto anti-metastásico en la parte superior de sus efectos de sensibilización tumor. Recientemente, se ha demostrado que las propiedades anti-cáncer de TAT-RasGAP
317-326 dependen de dos residuos de triptófano en la posición 317 y 319 [16]. Sin embargo, el modo de acción de TAT-RasGAP
317-326 no se caracteriza completamente. Se ha demostrado anteriormente que este péptido no favorece la muerte de células tumorales mediante la modulación de la actividad de Ras, las rutas de señalización de MAPK, la actividad transcripcional de NF-kappa B, los niveles de proteína Akt y estado de fosforilación [18, 19]. Por otra parte, los miembros de la familia Bcl-2, que regulan la muerte celular mitocondrial dependiente, se mostró a ser individualmente prescindible para la actividad de sensibilización del péptido [20].

El efecto de este péptido en el cáncer infantil es sin embargo no conocida. La biología molecular de los tumores pediátricos es distinto de los cánceres en adultos en muchas maneras. A medida que la génesis de la mayoría de los cánceres infantiles parece provenir de trastornos del desarrollo temprano normales, se acumulan menos mutaciones que los tumores adultos. Por otro lado, parece que el desarrollo de los tumores pediátricos dependen en gran medida modificaciones epigenéticas [21-23]. En el presente estudio, por lo tanto, hemos investigado si TAT-RasGAP
317-326 fue capaz de hacer que los tumores infantiles más sensibles a los fármacos antitumorales clínicamente relevantes.

Métodos

Las líneas celulares y células de cultivo

el CCRF-CEM [24], THP-1 [25] y A673 [26] líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) (referencias CRL-8436, TIB-202 , CRL-1598, respectivamente). La LAN-1 [27] y M-07e [28] líneas celulares se obtuvieron del Instituto Leibniz Colección DSMZ-Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (referencias ACC655, ACC104 respectivamente). El EW-11 [29], TC252 [30] y NB1-derivan [31] líneas celulares fueron descritos anteriormente. Todas las líneas celulares se cultivaron en 5% de CO
2 a 37 ° C. Las líneas celulares de neuroblastoma (LAN-1, NB1-FBS, NB1-FBS-Re) y la línea celular de sarcoma EW-11 Ewing se cultivaron en Dulbecco modificada de Eagle (DMEM) (Gibco, Paisley, Reino Unido) que contiene 10% de bovino fetal suero (FBS) (Gibco). Las células tumorales del neuroblastoma primarios NB1-NBM se mantuvieron en medio básico neural hecho de DMEM /F12 (Gibco) suplementado con 2% B27 suplemento libre de suero (Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 ng /factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano ml ( bFGF) (Peprotech), y factor de 20 ng /ml recombinante humano de crecimiento epidérmico (EGF) (Peprotech). células de sarcoma El THP-1 líneas celulares de leucemia aguda CCRF-CEM y, y de la A673 y TC252 Ewing, se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco) que contiene 10% de FBS. M07E, una línea celular de leucemia mieloide aguda, se mantuvo en mínimo alfa Medio Esencial (MEMα) (Gibco) suplementado con 10% de FBS y 5 ng /ml recombinante de granulocitos humanos macrófagos, factor estimulante de colonias (GM-CSF) (Peprotech). linfocitos de sangre periférica humana (PBL) se aislaron por centrifugación de densidad sobre un gradiente de Ficoll-Paque (Lymphoprep; StemCell Technologies) de capas leucocitarias de donantes humanos sanos, obtenidos a partir del estado de servicio de transfusión sanguínea Vaud. Los donantes dieron su consentimiento por escrito para el uso potencial de la sangre para la investigación médica. PBL se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 8% de suero humano combinado y suplementado con 100 U /ml de interleucina-2 recombinante humano (Proleukin, Roche Pharma AG).

Químicos

los fármacos utilizados fueron vincristina (Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU.), etopósido (Sigma-Aldrich), 4-hidroperoxiciclofosfamida (4-HC) (Niomech, Bielefeld, Alemania) y la doxorrubicina (Pfizer AG, Zurich, Suiza). La tinción utilizada para realizar citometría de flujo fueron 7-aminoactinomicina D (7-AAD) y Anexina V-FITC (kit de Anexina V-FITC /7-AAD, Beckman Coulter, Miami, EE.UU.).

Síntesis de péptidos

TAT-RasGAP
317-326 (GRKKRRQRRRGGWMWVTNLRTD), TAT
48-57 (de ahora en adelante referido como TAT) (GRKKRRQRRR), TAT-revueltos (GRKKRRQRRRGGWLDMTTVNRW) y TAT-mutado (GRKKRRQRRRGGAMWVTNLRTD ) fueron sintetizados en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Lausana, Suiza, como se describe anteriormente [12].

citotóxica ensayo

Para las células que crecen en suspensión (THP-1, M07E, CCRF-CEM , y linfocitos), trescientos mil células se sembraron en placas de 6 pocillos y directamente tratados con las dosis indicadas de 4-HC, etopósido, vincristina, o doxorrubicina en presencia o en ausencia de 10 mM TAT-RasGAP
317-326, TAT, TAT-TAT codificado o mutado. Para las líneas de células adherentes (NB1-NBM, NB1-FBS, NB1-FBS-Re, LAN-1, EW-11, TC252, y A673), se permitió a doscientos mil células se adhieran durante 48 horas en placas de 6 pocillos y se luego fueron tratadas igual que las células que crecen en suspensión. Veinticuatro horas después de la incubación de drogas, las células se sometieron a citometría de flujo para evaluar la muerte celular. Brevemente, las líneas celulares adherentes se desprendieron con tripsina-EDTA (Gibco) y las suspensiones de una sola célula se procesaron y se tiñeron con 1 mg /ml 7-AAD y 50 ng /ml anexina V-FITC en 500 l de tampón de unión. Se analizaron un mínimo de diez mil células. La señal de colorante derivado de 7-AAD no se podría utilizar cuando las células se trataron con doxorrubicina debido 7-AAD y doxorrubicina tienen propiedades fluorescentes similares (7-AAD de longitud de onda de emisión: 525 nm; longitud de onda de emisión de doxorrubicina: 530 nm [32]).

El análisis estadístico

A menos que se indique lo contrario, todos los experimentos se obtuvieron a partir de tres o más experimentos independientes. Los resultados se expresaron como los intervalos de confianza medios ± 95%. La significación se evaluó mediante pruebas t realizados con Microsoft Excel 2010 seguido de correcciones de Bonferroni (es decir, se consideraron diferencias significativas cuando los valores de & lt; 0,05 p /n, donde n es el número de comparaciones realizadas). Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas. En la última figura, la significación se evaluó mediante ANOVA de una vía seguido de Bonferroni (Dunn) t pruebas post-hoc utilizando el software SAS 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.).

Resultados

En este estudio, se analizaron tres tipos de cánceres infantiles: neuroblastoma, la leucemia y el sarcoma de Ewing. Entre los tumores malignos infantiles, neuroblastoma es el cáncer sólido extracraneal más frecuente. Las muertes debidas a la cuenta del neuroblastoma el 15% de todas las muertes relacionadas con el tumor en los niños [33]. resistencia a múltiples fármacos, adquirida durante la exposición a las quimioterapias, juega un papel importante en este mal resultado [34, 35]. La leucemia es el tipo de cáncer infantil más común y representa un tercio de todos los tumores pediátricos [36]. Aunque menos frecuente que la leucemia, sarcoma de Ewing es un cáncer agresivo con un mal pronóstico y una alta tasa de recaída con enfermedad metastásica [37]. Los fármacos utilizados aquí se utilizan todo en las clínicas. Sus propiedades se presentan en la Tabla 1.

TAT-RasGAP
317-326 sensibiliza linfoblástica aguda y células de leucemia mieloide a varios agentes quimioterapéuticos sin mostrar ningún efecto hacia las células tumorales por sí mismo

para investigar el efecto de sensibilización de TAT-RasGAP
317-326 en células de leucemia, tres líneas celulares diferentes se sometieron a concentraciones crecientes de agentes citostáticos en ausencia o en presencia de 10 mM TAT-RasGAP
317 -326. Etopósido, vincristina, doxorrubicina y 4-hidroperoxiciclofosfamida (4-HC), la forma activa de la ciclofosfamida, fueron los medicamentos que se utilizan aquí y son cada uno actualmente empleado en la clínica. La muerte celular se evaluó mediante 7-AAD que etiqueta las células muertas que han permeabilizadas membrana plasmática y con Anexina V que se une a la fosfatidilserina expuesta en las células muertas. Algunos de los fármacos anti-cáncer que se usan aquí indujo una aparición concomitante de las señales 7-AAD y anexina V (Fig 1A muestra el caso representativo de 4-HC). En otras palabras, tan pronto como una célula se convirtió en Anexina V-positivo también recogió el tinte 7-AAD. Por lo tanto, en nuestras manos, fármacos contra el cáncer, tales como 4-HC inducen un tipo de necrosis parecido a la muerte. En las siguientes figuras, se reportan los datos de 7-AAD, ya que encontramos a estar asociados con una variación inferior a los obtenidos con Anexina V tinción (Figura 1B). La única excepción fue cuando se utilizó doxorrubicina. De hecho, este colorante emite fluorescencia a longitudes de onda similares a los de 7-TDA. En este caso, por lo tanto, se presentan los datos de Anexina V. Estos experimentos revelaron que TAT-RasGAP
317-326 sensibiliza a las células de leucemia significativamente a las drogas casi todos analizadas (Figura 2A). Sin embargo, en algunas condiciones (por ejemplo, cuando las células THP-1 se tratan con vincristina) las células tumorales no responden bien a TAT-RasGAP
317-326. Un efecto de sensibilización limitada del péptido derivado de RasGAP no es necesariamente una consecuencia de la resistencia intrínseca a un fármaco como la línea celular CCRF-CEM, que es resistentes a vincristina, se sensibilizó eficazmente por TAT-RasGAP
317-326. Este punto es de especial relevancia clínica ya que indica que TAT-RasGAP
317-326 puede ejercer un efecto de sensibilización en las células resistentes a la quimioterapia.

A. Tres cientos de miles de células CCRF-CEM se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron directamente con 50 M 4-HC. La muerte celular se evaluó después de varios puntos de tiempo (0, 3, 6, 12 y 24 horas) utilizando 7-AAD y tinción con anexina V-FITC. células B. CCRF-CEM se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron directamente con las dosis indicadas de 4-HC, etopósido o vincristina en presencia o en ausencia de 10 mM TAT-RasGAP
317-326. Después de 24 horas de incubación de drogas, 7-AAD y la tinción con anexina V-FITC se realizó para evaluar la muerte celular. 4-HC, 4-hidroperoxiciclofosfamida.

A. Dos líneas de leucemia mieloide aguda de células (THP-1 y M-07e) y una línea linfoblástica de células de leucemia aguda T (CCPR-CEM) se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron directamente con 4-HC, etopósido, vincristina o doxorubicina en el concentraciones indicadas en presencia o en ausencia de 10 mM TAT-RasGAP
317-326. Después de 24 horas de incubación de drogas, 7-AAD o tinción con anexina V-FITC se realizó para evaluar la muerte celular (últimos cuatro columnas). Alternativamente (primera columna), las células se trataron con concentraciones crecientes de TAT o TAT-RasGAP
317-326 solo. Después de 24 horas, la evaluación de la muerte celular se realizó mediante tinción con 7-AAD. B. linfocitos aislados de tres sujetos sanos distintos fueron tratados como se describe en la Fig. 2A. Las dosis de agentes quimioterapéuticos utilizados para tratar los linfocitos sanos de los tres sujetos son similares a los utilizados para tratar las células T-ALL CCRF-CEM. Tenga en cuenta que las gráficas se derivan de experimentos individuales, donde los linfocitos se utilizan inmediatamente después de su aislamiento (si se cultivan
in vitro
, que experimentarían los altos niveles de apoptosis espontánea que impedirían la medición precisa de las drogas contra el cáncer y el péptido muerte inducida). LLA-T, leucemia linfoblástica aguda T-; LMA, leucemia mieloide aguda; 4-HC, 4-hidroperoxiciclofosfamida. * P & lt;. 0,05 t-test después de la corrección de Bonferroni

TAT-RasGAP
317-326 por sí sola no indujo la muerte celular en las líneas celulares de leucemia probadas, incluso en una de dos veces mayor concentración (20 mM) que el utilizado para inducir un efecto de sensibilización (10 M) (Fig 2A).

TAT-RasGAP
317-326 no muestra toxicidad hacia los linfocitos no tumorales de sujetos sanos .

se ha demostrado anteriormente utilizando no tumoral inmortalizada queratinocitos humanos (HaCaT) y el endotelio vascular umbilical (HUV-EC-C) células que TAT-RasGAP
317-326, en combinación con diversos genotoxinas, no sensibilizar a las células no tumorales [12]. En el presente estudio, hemos utilizado linfocitos aislados de sangre entera de pacientes sanos para investigar la selectividad del péptido derivado de RasGAP hacia las células cancerosas. Se utilizaron las mismas dosis de agentes quimioterapéuticos para tratar linfocitos sanos como los utilizados para tratar la línea CCRF-CEM-T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) de células (Figura 2A). Figura 2B muestra la respuesta de linfocitos de sangre periférica (PBL) derivados de tres sujetos sanos diferentes (somete A-C) para el péptido derivado de RasGAP en combinación o no con las genotoxinas utilizados en la figura 2A. El péptido derivado de RasGAP por sí mismo no presenta ninguna toxicidad para los PBL. La sensibilidad de los linfocitos no tumorales para las quimioterapias probados solos era similar a la sensibilidad de la línea celular CCRF-CEM (incluso aumentó ligeramente en el caso de doxorrubicina para los sujetos sanos A y C). La observación de que el cáncer y normales linfocitos fueron igualmente sensibles a genotoxinas fue de alguna manera sorprendente ya que la razón para utilizar una quimioterapia administrada es que tendrá como objetivo preferentemente las células malignas. Sin embargo, la información importante dibujado en la figura 2B es que TAT-RasGAP
317-326 no PBL sensibilizar a etoposide-, la muerte vincristina y doxorrubicina mediada. El péptido sin embargo no a veces sensibilizar PBLs de 4-HC (Fig 2B), lo que sugiere que TAT-RasGAP
317-326 puede afectar a la viabilidad de las células normales en algunas combinaciones de tratamiento.

TAT-RasGAP
317-326 puede potenciar la muerte celular inducida por genotoxin en el sarcoma de Ewing

Para ampliar la investigación sobre TAT-RasGAP
317-326 en el cáncer infantil no la leucemia, la eficacia de TAT-RasGAP
317-326 también se ensayó en las células del sarcoma de Ewing. Los resultados muestran que el péptido derivado de RasGAP también es capaz de sensibilizar a estas células a diferentes genotoxinas, aunque en un grado menor que en las leucemias (Fig 3). En algunos casos, no se observó sensibilización (por ejemplo, cuando se utilizó la vincristina en las líneas celulares A673 y TC252). Una vez más, TAT-RasGAP
317-326 sola no mostró ninguna toxicidad hacia las células del sarcoma de Ewing (Fig 3).

Tres líneas celulares de sarcoma de Ewing (EW-11, A673 y TC252) se sembraron en placas de 6 pocillos y después de 24 horas se trataron con 4-HC, etopósido, vincristina, doxorrubicina o a las concentraciones indicadas en la presencia o en ausencia de 10 mM TAT-RasGAP
317-326. Un día después, se evaluó la muerte celular. 4-HC, 4-hidroperoxiciclofosfamida. * P & lt;. 0,05 t-test después de la corrección de Bonferroni

Las líneas de células de neuroblastoma derivadas NB1 mueren directamente por TAT-RasGAP
317-326

quimio-resistencia adquirida es una importante causa de fracaso de tratamiento del neuroblastoma. Para evaluar el efecto de TAT-RasGAP
317-326 en las células que fueron expuestas a altas dosis de quimioterapia y, por tanto, que potencialmente han adquirido resistencia a estos agentes citotóxicos, se seleccionaron las células de tumor primario de un paciente en diferentes etapas de la enfermedad. Las células NB1 son 4 células de neuroblastoma de alto riesgo en las fases primarias derivadas de muestras de médula ósea que se establecieron en el diagnóstico inicial (NB1-NBM y NB1-FBS) y en la posterior recaída después de múltiples agentes de quimioterapia (NB1-FBS-Re) (Figura 4A ). NB1-FBS y NB1-FBS-Re líneas celulares fueron cultivadas en suero bovino fetal al 10% (FBS) que contienen medio DMEM, mientras que las células se establecieron NB1-NBM en medio básico neuronal (NBM). NBM es una célula madre sin suero permisiva, bFGF, EGF y medio suplementado-B27 para apoyar el crecimiento de las células de la cresta neural, el tejido de origen del neuroblastoma [38, 39].

A. La flecha gruesa de color gris claro en la parte superior de la figura representa el régimen de tratamiento administrado al paciente del cual se establecieron las tres líneas celulares derivadas de NB1. Las células NB1 se derivan de muestras de alta primarios de la médula ósea de neuroblastoma de riesgo. NB1-NBM y NB1-FBS se establecieron en el diagnóstico inicial y se cultivan en medio DMEM y NBM, respectivamente. NB1-NBM-Re fue establecida en una posterior recaída y se cultivaron en DMEM. Las tres líneas celulares derivadas de NB1 fueron tratados como se describe en la figura 3. B. La línea celular LAN-1 se deriva de una alta neuroblastoma riesgo. células LAN-1 se trataron como se describe en la figura 3. M, meses; BM, la médula ósea; 4-HC, 4-hidroperoxiciclofosfamida. * P & lt;. 0,05 t-test después de la corrección de Bonferroni

La figura 4A muestra que las líneas celulares NB1-NBM y NB1-FBS no muestran la misma sensibilidad hacia las quimioterapias probadas. Por otra parte, la eficacia de la TAT-RasGAP
317-326 para mejorar la eficiencia matanza de 4-HC varía entre estas dos líneas celulares: se encontraron las células NB1-FBS que ser muy sensibles al efecto de sensibilización del péptido, mientras las células NB1-NBM no se vieron afectados por la presencia de TAT-RasGAP
317-326. Como la única diferencia entre las líneas celulares NB1-NBM y NB1-FBS es el medio en el que se cultivan, se podría hipotetizar que el metabolismo de las células NB1 varía de una condición de cultivo a la otra y que esta modula diferencialmente la sensibilidad de las células tumorales a TAT-RasGAP
317-326.

Para investigar si el efecto de sensibilización de TAT-RasGAP
317-326 todavía era eficiente en células de neuroblastoma en recaída, se comparó su eficacia entre el células NB1-FBS y la NB1-FBS-Re células. Ambas líneas celulares se cultivan en el mismo medio de cultivo. El régimen de tratamiento que se usa para tratar el paciente se ilustra en la figura 4A. El paciente, las células recaída de los cuales se deriva, se expuso a los cuatro fármacos (4-HC, etopósido, vincristina y doxorrubicina) probados en este estudio. Sin embargo, a excepción de las condiciones tratadas con 4-HC en el que podemos observar una ligera resistencia a este fármaco en el NB1-FBS-Re células, las células recaída no son más resistentes al etopósido, vincristina y doxorrubicina que las células derivadas de diagnóstico inicial (Fig 4A). Por el contrario, NB1-FBS-Re células muestran un aumento de la sensibilidad a la doxorrubicina en comparación con las células NB1-FBS. Sin embargo, TAT-RasGAP
317-326 sensibiliza a las tres líneas celulares derivadas de NB1 primarias, aunque a un nivel diferente de la eficacia de acuerdo con la línea celular y la quimioterapia probado (Figura 4A).

En la mayoría casos, TAT-RasGAP
317-326 no induce la muerte de células tumorales por sí mismo. Sin embargo, nos dimos cuenta de que las tres líneas de células derivadas NB1 se pueden matar directamente por el péptido derivado de RasGAP (figura 4A). La dosis necesaria para inducir la muerte celular (20 M) es sin embargo superior a la dosis utilizada para sensibilizar a las células para genotoxinas (10 m).

Para completar la investigación del efecto de TAT-RasGAP
317 -326 en el tipo de tumor neuroblastoma, también a prueba el péptido de LAN-1, otra línea celular de neuroblastoma derivada de un neuroblastoma en estadio 4 agresiva. Fig 4B muestra que el péptido derivado de RasGAP muestra un efecto de sensibilización leve hacia esta línea celular. A diferencia de las líneas de células derivadas NB1, TAT-RasGAP
317-326 por sí sola no era capaz de matar las células LAN-1 (Figura 4B), lo que significa que TAT-RasGAP
317-326 inducida por la muerte celular no es una especificidad compartida por todos los neuroblastomas.

la actividad de sensibilización de TAT-RasGAP
317-326 se realiza por la secuencia derivada de RasGAP

Para evaluar la especificidad de la actividad de la quimioterapia sensibilizante TAT-RasGAP
317-326, se ensayaron tres péptidos de control diferentes: un péptido compuesto de la secuencia TAT solamente (TAT), un péptido en el que se revueltos la secuencia de RasGAP (TAT-codificado), y un péptido en el que el primero triptófano de la secuencia de RasGAP fue sustituido en un resto de alanina (TAT-mutado). Este triptófano ha demostrado recientemente que es esencial para la actividad de sensibilización de TAT-RasGAP
317-326 en tumores adultos [16]. El efecto de TAT-RasGAP
317-326 y los tres péptidos de control se puso a prueba en las células CCRF-CEM en combinación con varios fármacos contra el cáncer a dosis que permitió detectar la mayor actividad de sensibilización. Se utilizaron células CCRF-CEM porque esta línea celular de leucemia fue el más eficiente sensibilizadas por el péptido derivado de RasGAP. La figura 5A muestra que los tres péptidos de control tenían una tendencia a favorecer ligeramente la muerte de las células CCRF-CEM cuando se combina con los diferentes fármacos contra el cáncer, pero en la mayoría de los casos esto no alcanzó significación estadística. Por el contrario, TAT-RasGAP
317-326 notablemente, y siempre de manera significativa, sensibiliza estas células a los fármacos. El ligero efecto de sensibilización de los péptidos de control es más probable debido a la penetración de la actividad de células de la fracción de TAT, que tiene el potencial de afectar negativamente la homeostasis celular [40]. Se obtuvieron resultados similares cuando se utilizaron la línea celular de sarcoma de Ewing TC252 y la línea celular de neuroblastoma NB1-FBS: TAT-RasGAP
317-326 aumentado significativamente su sensibilidad a la 4-HC, mientras que los tres péptidos de control no o sólo mínimamente (Fig 5B y 5C). Estos datos indican que la actividad de sensibilización de tumor de TAT-RasGAP
317-326 basa sólo marginalmente en su capacidad para penetrar en las células a través de la secuencia de células permeable TAT. Por lo tanto, se puede concluir que la actividad de sensibilización de TAT-RasGAP
317-326 se realiza principalmente por la secuencia derivada de RasGAP.

A. células CCRF-CEM se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron directamente con 10 mM TAT-RasGAP
317-326, TAT, TAT-revueltos o TAT-mutado en ausencia o en presencia de 4-HC, etopósido, vincristina o doxorubicina a las concentraciones indicadas. Después de 24 horas de incubación de drogas, 7-AAD o tinción con anexina V-FITC se realizó para evaluar la muerte celular. ANTES DE CRISTO. Las líneas celulares TC252 (B) y NB1-FBS (C) se trataron de manera similar pero en combinación con solamente 4-HC. P10, TAT-RasGAP
317-326; TAT-S, TAT-revueltos; TAT-M, TAT-mutado; 4-HC, 4-hidroperoxiciclofosfamida. Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.

Discusión

Las terapias que se aplican actualmente para el tratamiento de cánceres sólidos infantiles, como el neuroblastoma y sarcoma de Ewing, tienen que ser más eficiente y específica mejorar el resultado clínico. La leucemia tiene por lo general una mejor tasa de supervivencia a 5 años que los tumores sólidos pediátricos, pero los efectos a largo plazo de la terapia siguen siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad. Por otra parte, la resistencia adquirida a los tratamientos convencionales es responsable de las recaídas y un mal resultado. De acuerdo con ello, la búsqueda de agentes terapéuticos menos tóxicos y más eficaces para el tratamiento de cánceres pediátricos es una necesidad para disminuir los efectos secundarios perjudiciales inducidas por fármacos y la mortalidad asociada [3].

En el presente estudio, se evaluó el efecto de TAT -RasGAP
317-326 en varias líneas celulares de cáncer de la infancia. Este péptido derivado de RasGAP ya era conocido por sensibilizar a las células tumorales de adultos
in vitro Opiniones y
in vivo
a varias terapias contra el cáncer [12]. Nuestros resultados muestran que TAT-RasGAP
317-326 sensibiliza significativamente las células de cáncer infantil en la mayoría de las condiciones ensayadas. Sin embargo, en algunos casos, las células tumorales no lo hicieron, o mínimamente, responden al péptido. El efecto sensibilizante-tumor pediátrico se ilustra en este estudio se alcanzó usando un medio de la concentración de péptido utilizado anteriormente para sensibilizar a las células de cáncer de adultos (10 M TAT-RasGAP
317-326 en este estudio en lugar de 20 mM en el papel de Michod et al. [12]). Posiblemente, la dosis de TAT-RasGAP
317-326 podría duplicarse para aumentar la eficacia de sensibilización del péptido en las condiciones en las que era menos eficiente. Dado que las células de tumor primario representan una condición más clínicamente relevante, también a prueba el péptido en células de neuroblastoma primarios derivados de muestras de médula ósea de un único paciente (las tres líneas celulares derivadas de NB1 mostraron en la figura 4). Los resultados muestran que el péptido derivado de RasGAP sensibiliza a las células de tumor primario, lo que sugiere que podría ejercer su actividad anti-cáncer en los tumores en un
in vivo contexto
.

El mecanismo de acción de TAT -RasGAP
317-326 queda por determinar precisamente [18-20]. Inicialmente se asumió que el trabajo con un gran panel de líneas celulares y agentes citotóxicos nos permitiría trazar un patrón que se podría utilizar para predecir qué tipo de tumores infantiles mostrar sensibilidad a TAT-RasGAP
317-326 en respuesta a una determinada droga. Dicha información sería útil para descifrar el modo de acción de TAT-RasGAP
317-326. Para este propósito, se analizaron cómo el medio de concentración inhibitoria máxima (IC
50) para cada agente quimioterapéutico se modificó por la presencia de TAT-RasGAP
317-326 para una línea celular dada (Tabla 2). El péptido derivado de RasGAP disminuyó la IC
50 para la mayoría de genotoxinas en la mayoría de líneas celulares. Sin embargo, hay un patrón específico en función del origen del tumor o el tipo de fármaco podría deducirse de los datos que se presentan en la Tabla 2. También se analizó si existían algunas mutaciones específicas comunes en oncogenes conocidos o genes supresores de tumores (por ejemplo, HRAS, KRAS, las ANR, HDM2, N-MYC, C-MYC, TAL1, FLI-1, MLL, p53 y Rb1) en las líneas celulares analizadas. Una vez más, ninguna asociación se pudo encontrar entre la presencia de mutaciones específicas en una línea celular de cáncer y su capacidad para ser sensibilizados por el péptido derivado de RasGAP.

Un aspecto interesante de esta investigación es que la sensibilización efecto de TAT-RasGAP
317-326 puede ser diferencialmente modulada por las condiciones de cultivo celular. Esta característica se ilustra por el hecho de que las células NB1-FBS, pero no las células NB1-NBM, son sensibles al efecto del péptido. Estas dos líneas celulares se derivan de la misma tumor neuroblastoma en el diagnóstico inicial (véase la figura 4), pero que se cultivaron en diferentes medios. Estas dos líneas celulares parecen tener las mismas alteraciones genómicas. De hecho, poseen perfiles de CGH-array idénticas con las mismas alteraciones cromosómicas segmentarias neuroblastoma típicos asociados (datos no publicados). Así que si estas dos líneas celulares tienen perfiles de CGH-array idénticos, lo que podría explicar su diferente sensibilidad a TAT-RasGAP
317-326? Una posibilidad es que el medio en el que se cultivan modular su metabolismo diferencialmente. Esto podría a su vez afectar su sensibilidad a los tratamientos contra el cáncer. Hay evidencia acumulada de que de hecho el estado metabólico de las células cancerosas juegan un papel importante en la manera en que responden a los fármacos contra el cáncer [41]. Otra hipótesis es que diferentes poblaciones de células se seleccionan en pasajes en diferentes medios.

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