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PLOS ONE: Evaluación preclínica de carboplatino en la eficacia del tratamiento del cáncer de pulmón mediante 18F-ICMT-11-Tomografía por Emisión de Tomography

2013/2/15


Extracto

La respuesta tumoral a la terapia se evalúa principalmente en la clínica por las reducciones de vigilancia en el tamaño del tumor. Sin embargo, este enfoque carece de sensibilidad ya que en muchos casos varias semanas puede transcurrir antes de que haya evidencia de la reducción del tumor. Por tanto, existe una necesidad de desarrollar técnicas de imagen no invasivas para la respuesta al tratamiento de monitorización de tumores en la clínica. A continuación, se evaluó la utilidad de pre-clínico de la tomografía por emisión
18 F-11-ICMT positrones - un método para detectar la caspasa 3/7 de activación - en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
18 F-11-ICMT absorción se comparó con las medidas bioquímicas moleculares de muerte celular en células de NSCLC A549 PC9 y después del tratamiento con carboplatino
in vitro
y
in vivo
. la apoptosis inducida por carboplatino en el ERCC1 baja /mutante
EGFR
células PC9 se caracterizó por el tiempo y el aumento de la caspasa-3/7 de activación relacionada con la dosis, poli-ADP-ribosa polimerasa y la escisión Anexina V tinción.
18 F-11-ICMT captación fue por consiguiente, aumentó hasta 14 veces en 200 mM carboplatino en comparación con las células tratadas con vehículo (
P Hotel & lt; 0,01). Por el contrario, la necrosis fue el mecanismo predominante en la muerte ERCC1 alta /p
se detectó EGFR
células A549 y ningún cambio en
captación de 18F-ICMT-11.
In vivo
, el análisis histológico de xenoinjertos tumorales PC9 indicadas alta de necrosis de pre-tratamiento. Un aumento de 4,6 veces en la caspasa-3 escindido /7 se midió en las regiones no necróticas de tumores PC9 en terapia de carboplatino poste 48h. Media de tumor derivado de PET
18F-ICMT-11 de absorción fue insensible a los cambios en la apoptosis en presencia de necrosis pre-existente sustancial. voxel intensidad a base de PET de clasificación sin embargo, identificados regiones intra-tumorales de alta
18 F-11 ICMT-absorción, lo que permite una evaluación precisa de la apoptosis y por lo tanto la respuesta al tratamiento. En los tumores A549 que carecían de necrosis alta antes del tratamiento, la inhibición del crecimiento inducida por carboplatino que fue sólo mínimamente asociado con la apoptosis y por lo tanto no detectable por
18 F-11 ICMT-PET

Visto:. Witney TH, Fortt RR , Aboagye EO (2014) Evaluación preclínica de carboplatino la eficacia del tratamiento en el cáncer de pulmón
18 F-ICMT-11-Positron Emission Tomography. PLoS ONE 9 (3): e91694. doi: 10.1371 /journal.pone.0091694

Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón

Recibido: December 20, 2013; Aceptado: 12 de febrero de 2014; Publicado: 11 de marzo 2014

Derechos de Autor © 2014 Witney et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. La investigación dando lugar a estos resultados ha recibido el apoyo de la empresa común para la iniciativa sobre medicamentos innovadores (www.imi.europa.eu) con el número 115151 acuerdo de subvención, los recursos de los cuales se componen de contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7 /2007-2013 ) y las empresas EFPIA 'contribución en especie. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) es responsable de la mayor mortalidad relacionada con el cáncer [1]. la asignación al azar de adaptación de los pacientes a diferentes tratamientos sobre la base de perfiles de tumor por biopsia informada subraya el potencial beneficio de biomarcadores para predecir la respuesta al tratamiento (prueba de la batalla [2]). La existencia de diversos mecanismos de resistencia en el CPNM incluidos los impulsados ​​por
EGFR
,
ELM-ALK
, y
AXL
productos génicos (mutante), sin embargo, implica que estratificación de los pacientes por adelantado para la terapia es problemático [3]. La terapia puede conducir a una rápida extinción de los clones sensibles pero la expansión subclón igualmente agresiva conduce a la remisión transitoria y la recurrencia [4]. En este contexto se han identificado varios mecanismos de resistencia que implican vías de la apoptosis desregulados [3]. Con un número limitado de "prolongar la vida" terapias y una comprensión incompleta de los mecanismos de resistencia a los medicamentos, es posible que la evaluación temprana de la eficacia puede permitir que el interruptor más oportuna a las terapias alternativas. Sin embargo, hay escasez de biomarcadores de eficacia primeros. En cuanto a los biomarcadores de eficacia de formación de imágenes, una revisión por Zhao y compañeros de trabajo puso de relieve la utilidad de la imagen molecular incluyendo la tomografía por emisión de positrones (PET) cuando se combina con imágenes anatómicas, como una forma de evaluar la eficacia en las lesiones de biopsia-inaccesible [5], y superior a la clínica evaluación por los Criterios de evaluación de Respuesta en tumores sólidos (RECIST) solos [6].

Uno de los biomarcadores de la vía que han sido descritos tanto debido a la resistencia innata y adquirida en el CPNM es la vía de la apoptosis [3]. La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso esencial requerido para la homeostasis del tejido, el desarrollo embrionario y la eliminación de células perjudiciales en el cuerpo. Durante la génesis tumoral de los mecanismos que regulan la apoptosis de las células normales se convierten en desregulado. Algunos de los genes más comúnmente mutado que se encuentran en el cáncer, p53 y Bcl-2, dictan si /cuando viven las células mueren o [7], [8]. Para superar la resistencia tumoral intrínseca a los estímulos normales de muerte, citotóxico tradicional, radioterapia y terapias basadas en mecanismos se han diseñado para inducir la muerte celular por apoptosis específica de tumor a través de numerosos mecanismos divergentes. Estos mecanismos divergentes convergen con la activación de la caspasa efectora, caspasa-3, durante la fase de ejecución de la muerte celular por apoptosis, con la consiguiente compromiso de la degradación del ADN, la ruptura del citoesqueleto celular, formación de ampollas en la membrana, formación de cuerpos apoptóticos y la eliminación de la célula por el sistema inmune [9].

biomarcadores en sangre de la muerte celular han sido explorados en el cáncer de pulmón a través de la medición de la caspasa-soluble escindido citoqueratina 18 producto M30 [10], aunque esta metodología no proporciona información sobre la respuesta de la lesión heterogénea ni es capaz de distinguir entre la respuesta tumoral y la toxicidad tejido normal. Teniendo en cuenta la aparición casi universal de la caspasa-3/7 de activación en la muerte celular programada, su detección mediante formación de imágenes podría ser un prometedor biomarcador de la eficacia del tratamiento. Recientemente hemos desarrollado una sonda de caspasa 3/7-específica,
18F - (
S
) -1 - ((1- (2-fluoroetilo) 1H- [1], [2] , [3] triazol-4-il) metil) -5- (2 (2,4-difluorophenoxymethyl) pirrolidin-1-sulfonil) isatina (
18 F-ICMT-11), para el
in vivo
de formación de imágenes de la apoptosis tumoral inducida por el tratamiento.
18F-ICMT-11 se ha demostrado por nosotros y otros para ser una medida sensible de tanto la muerte tradicional célula citotóxica inducida por [11] - [13], y la apoptosis del tumor después del tratamiento con un activador de molécula pequeña de la caspasa [11] . Automatizado, fácil del radiomarcaje
18 F-ICMT-11 a las normas GMP se ha descrito [14], con una primera vez en humanos estudio que informó el perfil dosimetría favorable [15]. NSCLC puede presentar como una lesión compleja que incluye componentes necróticos pre-terapia; una evaluación detallada de la especificidad de
18 F-ICMT-11 en dirección a la muerte celular por apoptosis en comparación con la necrosis inducida por el tratamiento no se ha informado anteriormente. En este artículo, se presenta una nueva estrategia para la detección de la eficacia del tratamiento con
18 F-11 ICMT-PET en modelos preclínicos de NSCLC con diferentes respuestas a carboplatino, vinculados a los pre-únicos determinantes genéticos de la respuesta.

Materiales y Métodos

Cell Cultura y las células PC9 y A549
eran de las Normas LGC (Teddington, Middlesex, Reino Unido). células PC9 se mantuvieron en medio RPMI 1640, con A549s cultivadas en DMEM. Ambos medios se complementaron con suero de ternera fetal al 10%, 2 mM L-glutamina, 100 U.mL-1 penicilina y 100 ìg.mL-1 estreptomicina (Invitrogen, Paisley, Refrewshire, Reino Unido) y las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. La muerte celular se indujo por la adición de carboplatino (Acuerdo de Healthcare Ltd., Middlesex, Reino Unido; 0-200 mM).

Crecimiento Ensayo de inhibición de

Las concentraciones de fármaco que inhibe el 50% del crecimiento celular ( GC
50) se determinaron utilizando la técnica de un sulforodamina B (SRB) como se describe en otra parte [16]. Todas las líneas celulares fueron tratados durante 72 h, 24 h después de la siembra, a menos que se indique lo contrario

Las mediciones de citometría de flujo de la muerte celular

Las células se tripsinizaron (0,25% de tripsina, EDTA 1 mM). Y se cosechan por centrifugación (1.300 g, 3 min). células presentes en los medios de comunicación independiente antes de la tripsinización se retuvieron y se agruparon con las células tripsinizadas. Los sedimentos celulares (1 × 10
6 células) se lavaron en HEPES solución salina tamponada con enfriado con hielo (HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM
2, pH 7,4) y se resuspendieron en 100 l de la misma buffer. Se añadió Anexina V, Alexa Fluor 488 (Invitrogen) (5 l /100 l de suspensión de células) en combinación con 7-aminoactinomicina D (7-AAD; 20 ìg.mL
-1; Invitrogen), antes de la incubación durante 10 min a 20 ° C. La mezcla resultante se lavó una vez, se mantuvo brevemente en hielo, y después se analizó en un citómetro LSRII (BD Biosciences, Rockville, MD), con 20.000 células contadas por evento. restos celulares residual, identificado en adelante (FS) y la dispersión de la luz lateral (SS) perfiles, se excluyó del análisis mediante la selección selectiva.

transferencias Western
polimerasa
PolyADP-ribosa (PARP) y caspasa-3 escisión se evaluaron utilizando un protocolo de transferencia Western estándar [17]. Las membranas se probaron utilizando policlonal de conejo anti-anticuerpo PARP1 (Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, Reino Unido; 1:1000), un monoclonal anticuerpo de conejo anti-ERCC1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.; 1:1000) y un conejo policlonal anticuerpo anti-escindido de la caspasa-3 (Cell Signaling Technology; 1:1000). Un anticuerpo anti-actina de conejo (Sigma-Aldrich Co. Ltd; 1:2000) se utilizó como control de carga. Las manchas se escanearon (Bio-Rad GS-800 calibrada densitómetro; Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y la señal de cuantificación se realizó por densitometría usando software de análisis de barrido (Cantidad Uno; Bio-Rad)


18 F-11-ICMT Radiosíntesis


síntesis 18F-ICMT-11 y el radiomarcado se realizó de acuerdo a la metodología descrita anteriormente [14]. La pureza radioquímica fue & gt;. el 98% al final de la síntesis con una actividad específica de 35,1 ± 7,9 GBq /mmol (
n
= 8)


in vitro

-18F-11 ICMT célula de captación

las células (1 × 10
5) se sembraron en placas de 6 pocillos la noche antes del tratamiento (vehículo /carboplatino). En el día del experimento, el medio de cultivo fresco que contenía 0,74 MBq
18F-ICMT-11 se añadió a pocillos individuales. la captación celular se midió tras la incubación a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 para 60 min. A continuación, se tripsinizaron las células (tripsina al 0,25%; EDTA 1 mM) y se recogieron por centrifugación (1.300 g, 3 min). células presentes en los medios de comunicación independiente antes de la tripsinización se retuvieron y se agruparon con las células tripsinizadas. Las células se lavaron 3 veces con PBS enfriado en hielo (1 ml, 1,300 g, 3 min), con 20 l posteriormente tomado para la evaluación de la actividad de caspasa-3/7 (ver más abajo), antes de la granulación de las células restantes y la lisis en RIPA tampón (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EE.UU., 1 ml, 10 min). El lisado celular se transfirió a tubos de recuento y la radiactividad descomposición corregida se determinó en un contador gamma (contador Cobra II Auto-Gamma, Packard Biosciences Co, Pangbourne, Reino Unido). Las alícuotas se congelaron rápidamente y se utiliza para la determinación de proteínas después de la desintegración radiactiva usando un ensayo de placa de 96 pocillos BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EE.UU.). Los datos se expresan como porcentaje de la radiactividad total por mg de proteína, calibrado utilizando estándares 10 l de los 0,74 MBq /ml
18 F-11-ICMT solución madre.

caspasa-3/7 Ensayo de actividad

actividad de la caspasa-3/7 se determinó usando la caspasa-3 ensayo /7 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de Promega. Las células se incubaron durante 1 h con el reactivo de la caspasa-Glo, y la actividad enzimática de /7 se midió utilizando un contador de microplacas TopCount NXT luminiscencia 3 caspasa-(PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.) y se normalizaron al contenido de proteína (BCA). Los datos se expresaron como un pliegue-aumento de la actividad caspasa-3 sobre las células de control del vehículo.


En vivo
modelos tumorales

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo por investigadores autorizados de conformidad con el Ministerio del Interior Reino Unido orientación sobre el funcionamiento de los animales (Procedimientos científicos) Act de 1986, bajo licencia de proyecto 70/7177, y dentro de las directrices publicadas para el bienestar y el uso de animales en la investigación del cáncer [18]. Las células tumorales (2 × 10
6 y 5 × 10
6 de PC9 y A549, respectivamente) fueron inyectados por vía subcutánea en la parte posterior de desnudos Balb /c hembras de ratón (de 6-8 semanas; Charles River), con los animales tratados con vehículo o carboplatino cuando los xenoinjertos alcanzaron ~ 100 mm
3 (ver más abajo para el programa de tratamiento). las dimensiones de los tumores se midieron periódicamente usando un calibrador y del tumor volúmenes se calcularon por la ecuación:. volumen = (π /6) × a × b × c, donde a, b, y c representan tres ejes ortogonales del tumor

TEP Estudios

Dynamic
18 F-11 ICMT-escáneres de imágenes se llevaron a cabo en un pequeño escáner PET de animales dedicado (módulo de Siemens Inveon PET, Siemens Medical Solutions EE.UU., Inc.) siguiendo un bolo
iv
inyección de ~3.7 MBq de radiotrazador en ratones portadores de tumores [19]. exploraciones dinámicas fueron adquiridos en formato modo de lista de más de 60 min. Los datos obtenidos fueron luego clasifican en barras sinogram 0,5 mm y 19 marcos de tiempo para la reconstrucción de la imagen (4 × 15 s, 4 × 60 s, y 11 × 300 s), el cual fue hecho por la reconstrucción iterativa (2D-OSEM). El software de Siemens Inveon Investigación del lugar de trabajo se utiliza para la visualización de la captación del radiotrazador en el tumor; Se emplearon 30-60 min imágenes acumuladas de los datos dinámicos para definir regiones (3D) 3-dimensionales de interés (ROI). Las densidades de recuento fueron promediados para todas las regiones de interés en cada punto de tiempo para obtener un tiempo de radiactividad frente a la curva (TAC). TAC tumorales se normalizaron a dosis inyectada, medida por una dosis calibrador VDC-304 (Veenstra Instruments), y se expresaron como porcentaje de dosis inyectada por tejido ml, usando el factor de calibración determinada para el escáner Inveon PET. Para la visualización de la imagen, 3D-OSEM reconstrucción se llevó a cabo y se presenta como 30-60 marcos sumadas min.


En vivo
carboplatino pauta de tratamiento

Para los estudios de tratamientos y respuestas, ratones con el tamaño de concordancia de aproximadamente 100 mm ip
3 xenoinjertos de tumores fueron tratados con vehículo (solución salina; 0,012 ml /g de peso corporal) o carboplatino (Acuerdo de Healthcare Ltd .; 120 mg /kg; 0,012 ml /g de peso corporal). 24 h después de la inyección, los ratones tratados con carboplatino y control de vehículos fueron fotografiadas por
18 F-11 ICMT-PET. Una segunda cohorte de ratones recibieron dos dosis de vehículo o carboplatino, con la segunda inyección se administra 24 h después de la dosis inicial. Estos ratones fueron imágenes posteriormente por
18 F-ICMT-11 PET 48 h después de la dosis inicial.

basados ​​en PET Voxel Intensidad Ordenando histogramas

Las intensidades de todos los voxels dentro de las regiones de interés tumorales se computaron y ordenados según su frecuencia de intensidad para dar la intensidad del voxel basada en la clasificación de PET (PVIS) histogramas [11]. Para cada retorno de la inversión, todos los voxels, 30-60 minutos después de la adición del radiotrazador y se extrajeron su intensidad asociada (~ 300 voxels por retorno de la inversión). Las distribuciones de intensidades de voxel se procesaron a través de un análisis estadístico (software v5.0 Prism, GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Dentro de la gama estrecha de la apoptosis visto, nos arbitraria seleccionamos la 95
percentil de corte para biológicamente describen los 5% más altos voxels-probables intensidad para contener células apoptóticas - en lugar de, por ejemplo, sobre la base de características operativas del receptor el análisis.

caspasa-3 activa y TUNEL La inmunohistoquímica Ensayo

Después de los estudios de imagen PET, los tejidos tumorales fueron extirpados, se fijaron en formalina, embebido en parafina, se seccionaron (5 micras rodajas) y se procesaron para activos caspasa-3 y el ADN degradación desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) ensayos de detección fluorescentes utilizando el exfoliados caspasa-3 (Asp 175) anticuerpo monoclonal (Cell Signaling Technology), junto con la Alexa Fluor 594 de cabra anti-conejo (Invitrogen) y el Kit de detección in situ muerte celular (Roche), respectivamente. Se añadió la solución de montaje prolongar oro Antifade (Invitrogen) que contiene 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para secciones de tejido antes del montaje de cubreobjetos. El ensayo TUNEL se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante, con la caspasa-3 tinción realizado de acuerdo con [11], [13]. secciones alternativas se contratiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción. 10 campos al azar 'no necróticas' por sección (a 400 aumentos) se capturaron usando un microscopio de fluorescencia Olympus BX51 para cada tumor y las intensidades de tinción (% de tinción por total de FOV) se determinaron utilizando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud) . Para secciones PC9, al azar FOV fueron seleccionados de las regiones que carecen de una extensa necrosis.

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (SD). La importancia de la comparación entre los dos conjuntos de datos se determinó mediante la prueba t de 2 colas de Student. ANOVA se utilizó para comparaciones múltiples (software v5.0 Prism para Windows, GraphPad Software). Las diferencias entre grupos se consideraron significativas si P £ 0,05.

Resultados

Muerte mecanismos diferenciales de carboplatino inducida en PC9 y A549 células

Se seleccionaron las células de NSCLC PC9 y humano A549 por sus únicas pre-determinantes genéticos de la respuesta: El primero se caracteriza por el daño de ADN baja expresión de proteína de reparación ERCC1 y una mutación en
EGFR gratis (15 pb del exón 19), con las dos características de forma independiente, capaces de sensibilizar las células a las terapias basadas en platino [20], [21]. En contraste, las células A549 tiene una expresión de alto ERCC1 (de baja y alta expresión de PC9 y A549, respectivamente; recursos en línea 1) y tienen peso
EGFR
. Se indujo la muerte celular
in vitro en células de NSCLC
PC9 y humano A549 después del tratamiento con carboplatino (0-200 mM). inhibición del crecimiento dependiente de la dosis evaluada a las 72 h después del tratamiento mediante un ensayo de sulforrodamina B (SRB) mostró una inhibición del crecimiento semimáxima (GC
50) de 71,6 ± 9,5 M y 136 ± 31,6 M durante PC9 y A549, respectivamente (
n
= 3; Fig. 1A). La muerte celular apoptótica se evaluó mediante Western Blot. Los niveles de caspasa-3 escinde y la escisión de su sustrato aguas abajo, PARP, mostraron un aumento dosis-dependiente en las células PC9, mientras que no se observaron cambios con el A549 (fig. 1B). mediciones de citometría de flujo confirmó un mecanismo apoptótico de muerte celular en PC9s (figura 1C.), con necrosis del mecanismo principal de muerte en A549s (Figura 1D).

R:.-inhibición del crecimiento inducida por carboplatino en el PC9 y A549 células por medio de un tratamiento de ensayo de 72 h post sulfordamina B. B: Análisis de transferencia Western de los niveles de PARP escindida, PARP escindida y se escindió de la caspasa (activo) 3 72 h post-tratamiento carboplatino (0-200 mM) en las células PC9 y A549. Actina se utilizó como control de carga. C, D: Análisis de citometría de flujo de PC9 (C) y las células A549 (D) tratados con carboplatino (100 M) o vehículo. Las células apoptóticas se identificaron por Anexina V-Alexafluor488 (λ Ex /Em = 495/519 nm) y células necróticas en un 7-AAD (λ Ex /Em = 546/647 nm). Q4 población representa células viables, mientras que Q3 población representa células apoptóticas que tienen baja fluorescencia 7-AAD y la tinción con anexina V. Q2 población representa células apoptóticas /necróticas secundarias.


18 F-ICMT- 11 captación celular se correlaciona con la activación de la caspasa-3
in vitro

cambios dependientes de la dosis.

la muerte celular inducida por carboplatino se evaluó inicialmente con
18 F-ICMT- 11
in vitro gratis (Fig. 2A). tratamiento Carboplatino de células PC9 resultó en una activación dependiente de la dosis de la caspasa-3/7 actividad (ensayo de caspasa-Glo; Fig. 2B), hasta 87 ± 19 veces a 200 M (
P = 0,001
,
n
= 3). Estos datos también apoya los resultados obtenidos por Western blot y citometría de flujo (fig. 1B y C, respectivamente). Los cambios en la actividad de caspasa-3/7 no se detectaron en el A549 en las concentraciones de fármacos similares (Figura 2B).

A:. Estructura química de
18 F-ICMT-11. B: Los cambios de dosis-dependientes de caspasa 3/7 actividad después del tratamiento con carboplatino. C: cambios dependientes de la dosis en
captación de 18F-ICMT-11 en las células después del tratamiento con carboplatino. D: Correlación entre la actividad de caspasa 3 y
18 F-11-ICMT captación en las células PC9

La adición de 0,74 MBq (20 Ci)
18 F-ICMT-11 a las células 72 h después. el tratamiento con carboplatino (0-200 mM) dio como resultado la captación detectable y la retención del radiotrazador tras 1 h de pulso-persecución con el marcador radiactivo. Un aumento en la absorción celular, proporcional a la dosis de carboplatino se midió en las células PC9; alcanzar significación estadística a 100 mM, pasando de 28,8% ± proteína de 6,7% radiactividad /mg para los controles tratados con vehículo al 414,4% ± proteínas 20,1% de radioactividad /mg en 200 M (
n
= 3; p & lt; 0,01 ), un aumento de 14,4 veces (Fig. 2C). Había una excelente correlación entre la actividad celular de la caspasa-3/7 y
18 F-11-ICMT captación en esta línea (Figura 2D;. I
2 = 0,954). Ningún cambio significativo en
18 F-ICMT-11 se detectó la absorción con células A549 después de la adición de carboplatino (Fig. 2C).

Evolución temporal de la muerte celular por apoptosis.

El curso temporal de muerte celular por apoptosis se evaluó adicionalmente en 50 mM carboplatino, una dosis cerca de la GC
50 de las células PC9 (Fig. 1A). El inicio de la apoptosis en PC9s fue detectable a las 48 h después del tratamiento, medido por un aumento de 7,8 ± 4,6 veces en la caspasa-3/7 actividad (
P
= 0,03;
n = 4
; Fig. 3A), con la caspasa-3 y la escisión de PARP también evidente por Western blot (Fig 3B (ii.)). Un aumento temporal en la caspasa-3 escindida se detectó hasta 96 h post-tratamiento en las células PC9 sin embargo, hubo una reducción en la actividad de la caspasa-3 entre 72 h y 96 h, pasando de 19,1 ± 3,4 veces a 11,1 ± 0,8 veces aumentar con el inicio del estudio, respectivamente (
n
= 4;
P = 0,036
). La magnitud de la respuesta apoptótica fue 7,9 veces menor con las células tratadas con 50 mM durante 96 h en comparación con una concentración de 200 mM en el mismo punto de tiempo.
18 F-ICMT-11 acumulación intracelular refleja el aumento temporal de la caspasa-3 escinde en esta línea celular (Fig. 3B, C), al pasar de 15,8% ± proteína de 4,2% radiactividad /mg a 64% ± 8,1% de radioactividad /mg de proteína en las células tratadas en 50 mM durante 96 h en comparación con las células control no tratadas (
P
= 0,009). A pesar de una excelente correlación entre celular escindida y
18 F-ICMT 11-absorción de la caspasa-3 en esta línea celular, la correlación entre
18 F-ICMT-11 la captación y la actividad caspasa-3/7 fue muy bien definida (Fig. 3D ; R
2 = 0,3314). A pesar de la detección de bandas débiles correspondientes a exfoliados caspasa-3 y PARP con células A549 tratadas ya sea 48 h o 72 h (Fig. 3B (ii)), no hubo aumento en detectable caspasa-3/7 actividad (Fig. 3A) . Al mismo tiempo, no hubo ningún cambio significativo en
18 F-ICMT-11 sobre la totalidad de este curso del tiempo (Fig 3C.)

A:. Evolución temporal de los cambios en la actividad de la caspasa 3/7 siguiente carboplatino tratamiento. B: Análisis de transferencia Western de los niveles de PARP escindida, PARP escindida y se escindió de la caspasa (activo) 3 después de 50 mM tratamiento carboplatino (0-96 h) en el PC9 (i) y células A549 (ii). C: Los cambios temporales en
captación de 18F-ICMT-11 en las células después del tratamiento con carboplatino. D: Correlación entre la actividad de caspasa 3 y
18 F-11-ICMT captación en las células PC9


18 F-ICMT-11 es capaz de distinguir apoptótica de la muerte celular necrótica
in vivo.

cambios temporales en la respuesta al tratamiento.

tumores PC9 y A549 se cultivan como xenoinjertos, con las mediciones de la pinza de tamaño del tumor medidos después de vehículo, 24 horas, y el tratamiento con carboplatino 48 h (120 mg /kg ip diariamente) y en comparación con la línea base. Para ambos tumores, el tratamiento carboplatino resultó en la detención del crecimiento. Para los tumores PC9, una diferencia significativa en el volumen del tumor se midió 48 h post-tratamiento carboplatino en comparación con los controles del vehículo, lo que aumentó a 143 ± 18% de volumen de línea de base, con los tumores tratados con carboplatino restantes en 96 ± 13% de volumen de línea de base (
P = 0,013
;
n
= 4; Fig. 4A). Un retraso significativo en el crecimiento del tumor se midió tanto 24 h y 48 h de tratamiento post carboplatino en tumores A549 en comparación con los controles de vehículo (Fig 4B.); los puntos más adelante no se midieron

A, B:. volúmenes de los tumores registrados por las mediciones de la pinza de PC9 (A) y los tumores A549 (B) de tratamiento pre y post-carboplatino como se indica. Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de volumen% en comparación con la línea base (
n
= 4). *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01. C, D: Imágenes representativas axial PET-CT (30 a 60 min de actividad resumió) para PC9 (C) y los tumores A549 (D). márgenes tumorales, indicados imagen de CT, se resumen en rojo. La media ± desviación estándar (
n
= 4-6 animales por grupo). E, F: El TAC del tumor que representa recuentos promedio de un análisis dinámico de 60 minutos para el PC9 (E) y xenoinjertos A549 (F) después del tratamiento con carboplatino (vehículo, 24 h o 48 h-tratada carboplatino;
n =
4-6 animales por grupo).

a continuación evaluó
18 F-ICMT-11 como un marcador sensible de la muerte de células tumorales
in vivo
. Asociadas al tumor
18 F-11-ICMT radiactividad se determinó mediante imágenes PET de 60 minutos dinámico. imágenes axiales representativos que representa de asociados con tumores
18 F-ICMT-11 se ilustran en las figuras 4C y 4D para los tumores PC9 y A549, respectivamente. regiones 3D de interés se definen para ambos tumores PC9 y A549, con recuentos promedio utilizan para obtener un tiempo de radiactividad frente a la curva (ROI; Fig 4E y 4F, respectivamente.). Para ambas líneas tumorales, no hubo diferencia significativa en un promedio de tumor-asociados
18F-ICMT-11 radiactividad en 24 h y 48 h de tratamiento post carboplatino en comparación con los controles del vehículo tal como se define por el área bajo la TAC (30-60 min) o valores de captación normalizado después de la inyección del radiotrazador 60 min (% ID /ml
60).

confunde de heterogeneidad tumoral.

Las imágenes axiales de la actividad 30-60 min resumió revelaron un patrón heterogéneo de
distribución 18F-ICMT-11 en tumores PC9 (Fig. 4C), mientras que la radiactividad A549 fue más homogénea en su distribución (Fig. 4D). Aunque el efecto de volumen parcial puede contribuir a esta aparente heterogeneidad, análisis voxel-sabia de los datos de PET por PVIS (30-60 min) confirmó la distribución no uniforme de
18F-ICMT-11 radiactividad tumor (Fig. 5A y 5B para PC9 y A549, respectivamente). Para PC9s, hubo un claro cambio en PVIS histogramas en el transcurso de tiempo de 48 h, con un aumento promedio del grupo de 1,5 veces en el número de voxels con alta intensidad en ROIs tumorales PC9 de ratones carboplatino inyectada en comparación con el vehículo, como se representa por la 95
percentil (
P
= 0,01; Fig. 5C). No se observaron intensidades o distribución diferencia voxel significativas en los tumores A549 a lo largo tiempo de tratamiento (Fig. 5D).

se calcularon las intensidades de todos los voxels dentro de las ROIs tumorales y se expresan como histogramas de intensidad normalizada frente voxel el número de voxels. A, B: Los datos típicos de tres animales representativos (vehículo, 24 h o 48 carboplatino tratados con h) para PC9 (A) y A549 (B) se muestran. C, D: La comparación estadística de 95
º percentil intensidades de voxel de PC9 (C) y A549 (D) se realizó utilizando el software v5.0 Prism (GraphPad). La media ± desviación estándar (
n
= 4-6 animales por grupo) *,
P
. & Lt; 0,05; **,
P
. & Lt; 0,01

H & amp; E tinción de los tumores fijados con formalina confirmado la heterogeneidad del tumor PC9, que se caracteriza por extensas regiones de necrosis preexistente antes del tratamiento ( la Fig. 6A), en consonancia con la de muestras humanas de cáncer de pulmón de pacientes [22]. En las regiones no necróticas "sanos" de tumores PC9, el tratamiento carboplatino aumentó significativamente la apoptosis, que se define por un aumento de la caspasa-3 escindido y la tinción TUNEL (Fig. 6B y 6C, respectivamente). Exfoliados caspasa-3 tinción de secciones de tumores PC9 fue 5,4 veces más alta después del tratamiento con carboplatino, desde 0,76% ± 0,22% en los controles del vehículo, a 4.11% ± 0.88% de tinción 24 h post-tratamiento carboplatino (
P = 0,002
); 3,5% ± 0,70% exfoliados caspasa-3 tinción se midió 48 h post-tratamiento, significativamente mayor que los controles del vehículo (aumento de 4,6 veces;
P = 0,0003
; Fig. 6B). En comparación con los tumores de control PC9 tratados con vehículo, la tinción de TUNEL fue 3,5 veces mayor tratamiento post 24 h, pasando de 0,49% ± 0,17% a 1,74% de tinción ± 0,17%, (
P = 0,047
; fig. 6C). Ningún cambio significativo en la tinción de TUNEL se midió 48 h después del tratamiento debido a las grandes variaciones en las FOV seleccionados al azar. En los tumores A549, el tratamiento carboplatino resultó en la pérdida de celularidad, definido por H & amp; E de la tinción, y las células TUNEL positivas superiores; pasando de 0,14% ± 0,05% a 0,87% ± 0,02% en los tumores tratados con carboplatino vehículos y 24 h, respectivamente (
P = 0,0015
; Fig. 6A & amp; 6C). Una pequeña elevación en exfoliados caspasa-3 tinción se midió 48 h post-tratamiento carboplatino en tumores A549, pasando de 0,34% ± 0,07% en los tumores tratados con vehículo a 0,70 ± aumento del 0,13% (2 veces;
P
= 0,02;. la Fig. 6B)

tejidos tumorales se retiraron después de la exploración de formación de imágenes PET, procesada para el análisis histológico y se tiñeron para la actividad (escindido) caspasa-3 y la fragmentación del ADN (ensayo TUNEL) de detección, en conjunción con H & amp ; E tinción. se muestran imágenes representativas de secciones histológicas del tumor: a. Tinción intensidades para la caspasa 3 escindida (B) y TUNEL (C) se determinaron utilizando el software ImageJ y expresan como porcentaje de tinción por campo. Los datos son la media ± SD. *,
P Hotel & lt; 0,05; ***,
P Hotel & lt; 0,001.
n = 3
secciones tumorales con 5 FOV al azar por sección. Las imágenes fotográficas de H & amp; E-manchado secciones fueron adquiridas a 100 ×, con todas las demás imágenes adquiridas en 400 ×. Barra de escala = 200 micras. Abreviaturas: N, necrótico; V, viable.

Discusión

La terapia basada en platino sigue siendo el régimen terapéutico más eficaz para el CPNM avanzado con tasas de respuesta del 15-30% en pacientes no seleccionados (mediana de supervivencia, 10- 12 meses) [23]. Varios mecanismos se han descrito para subrayar la resistencia innata y adquirida a la terapia basada en platino que implica alteraciones en la reparación por escisión de nucleótidos [21]. expresión ERCC1 juega un papel central en estos ADN mediada dañado vías de reparación [24]. Más recientemente, otros mecanismos que implican
EGFR
se han descrito. En particular, las interacciones epistatic entre FANCD2 y mutante
EGFR
células han demostrado afectar la reparación de recombinación homóloga y sensibilizar a las células a la terapia basada en platino [20].

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