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PLOS ONE: Evaluación comparativa de la mutación Diagnóstico In Clinical Cancer de pulmón Specimens


Extracto

El tratamiento de
EGFR
-mutant no pequeñas de pacientes con cáncer de pulmón de células con el erlotinib inhibidores de tirosina quinasa o los resultados de gefitinib altas tasas de respuesta y la supervivencia libre de progresión prolongada. A pesar del desarrollo de métodos de detección de mutaciones sensibles, una validación exhaustiva de los mismos en un entorno clínico hasta ahora ha estado ausente. Se realizó, en un entorno clínico, una validación sistemática de secuenciación didesoxi 'Sanger' y pirosecuenciación contra la secuenciación masiva en paralelo como una de las tecnologías de detección de mutaciones más sensibles disponibles. anotación mutacional de muestras de tumores de pulmón clínicos reveló que de todos los pacientes con una respuesta confirmado que
EGFR
inhibición, solamente secuenciación masiva en paralelo detecta todas las mutaciones relevantes. Por el contrario, la secuenciación didesoxi perdió cuatro respondedores y pirosecuenciación se perdió dos respondedores, indicando una dramática falta de sensibilidad de secuenciación didesoxi, que se aplica ampliamente para este propósito. Además, la cuantificación precisa de alelos mutantes reveló una baja correlación (r
2 = 0,27) de las estimaciones histopatológicos de contenido tumor y la frecuencia de alelos mutantes, cuestionando así el uso de la histopatología para la estratificación de especímenes para procedimientos analíticos individuales. Nuestros resultados sugieren que la sensibilidad analítica mejorada se requiere críticamente para identificar correctamente a los pacientes que responden a
EGFR
inhibición. En términos más generales, nuestros resultados ponen de relieve la necesidad de una evaluación exhaustiva de toda la detección de mutaciones planteamientos contra la secuenciación masiva en paralelo como un requisito previo para cualquier aplicación clínica

Visto:. Querings S, Altmüller J, Ansén S, Zander T, D Seidel , Gabler F, et al. (2011) Evaluación comparativa de la mutación de diagnóstico clínico en cáncer de pulmón especímenes. PLoS ONE 6 (5): e19601. doi: 10.1371 /journal.pone.0019601

Editor: Markus Schuelke, Charité Universidad de Berlín, Neurocure Centro de Investigación Clínica, Alemania |
Recibido: 7 de Diciembre, 2010; Aceptado: April 2, 2011; Publicado: 5 Mayo 2011

Derechos de Autor © 2011 Querings et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Ayuda contra el cáncer de Alemania como parte de los centros de excelencia en el programa de Oncología en el Centro de integrado Oncología Köln - Bonn y por el Ministerio Federal alemán de Educación y Ciencia (BMBF) como parte del programa de la Red Nacional de Investigación del Genoma (NGFNplus , otorga 01GS08100 y 01GS08101) a Jürgen Wolf, Peter Nürnberg y romana Thomas. Los donantes no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Romana K. Thomas recibido apoyo para investigación de AstraZeneca y recibidas de conferencias o consultoría honorarios de Roche , Boehringer Ingelheim, Johnson & amp; Johnson, AstraZeneca, Lilly, Merck, Biolabs Atlas y Sanofi-Aventis. Jürgen Lobo recibió apoyo a la investigación y sirvió como consultor para Roche y AstraZeneca. Apoyo a la investigación mencionada en esta sección no se utilizó para la realización de este estudio. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.

Introducción

Inicialmente limitado a tumores poco frecuentes, como crónica leucemia mieloide (CML) o tumores del estroma gastrointestinal (GIST), el éxito del tratamiento de quinasas activadas por mutación con inhibidores de la quinasa ha llegado al grupo de los tumores frecuentes "sólidos" y por lo tanto ha cambiado profundamente la oncología clínica. El tratamiento de los pacientes que sufren de
EGFR
cánceres -mutant con
EGFR
inhibidores lleva a la respuesta objetiva [1], [2], [3], a una duplicación de la supervivencia libre de progresión en comparación a la quimioterapia estándar y para la supervivencia global a largo [4], [5]. pares similares de lesiones genómicas y fármacos dirigidos son
BRAF mutación
y
BRAF
de inhibición [6]
PARP
de inhibición y
BRCA1 /BRCA2
mutaciones [7 ], [8] o
PDGFRA
/
KIT
mutación e imatinib [9]. A la luz de los esfuerzos actuales para secuenciar de forma sistemática los genomas de todos los tipos de tumores grandes (http://www.icgc.org/o www.cancergenome.nih.gov), la lista de los tumores genéticamente definidas que son susceptibles a una terapéutica específica intervención es probable que aumente dramáticamente en los próximos años. En conjunto, estas observaciones sugieren la necesidad de rápido crecimiento para la detección de mutaciones sensibles y precisos en muestras clínicas como parte de la atención clínica de rutina.

Por desgracia, a pesar de parecer trivial, la aplicación clínica de la detección de la mutación se encuentra con dos problemas dependientes de la muestra y metodológicas : en primer lugar, la mayoría de las muestras clínicas disponibles son, fijado en formol e incluido en parafina biopsias de pequeño tamaño (FFPE) o muestras citológicas normalmente produciendo cantidades limitadas de ADN de baja calidad, todos los cuales afectan gravemente la amplificación por PCR y análisis posteriores. Además, la composición del tumor, así como múltiples tipos de células no neoplásicas afectan a la detección de mutaciones somáticas específicas de tumor en un fondo de no mutante, alelos "de tipo silvestre". En segundo lugar, los enfoques de secuenciación convencionales carecen de sensibilidad para la detección de tales alelos raros.

Se establecieron varios métodos para ofrecer detección sensible mutación, todos incluyendo la extracción de ADN, amplificación por PCR y análisis de la mutación por secuenciación posterior o ensayos basados ​​en genotipado [ ,,,0],10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19]. En varios casos, el enriquecimiento de las células tumorales se consigue la detección de mutaciones anterior, por ejemplo, por microdisección asistida por láser de los especímenes tumorales [15], [17]. Por desgracia, hay una falta casi universal de validación de la detección de mutaciones clínicamente relevante se acerca en la práctica clínica en contra de un enfoque estándar de oro sensible.

Hemos introducido recientemente secuenciación masiva en paralelo para la detección de mutaciones en el cáncer de especímenes clínicos [20]. Tales enfoques son ampliamente considerados para proporcionar la más alta sensibilidad actualmente disponibles para este fin debido a la capacidad de probar alelos mutantes raros en un fondo predominante de alelos de tipo salvaje en cualquier espécimen de tumor [20]. Por otra parte, este enfoque no se limita a una selección a priori de las mutaciones que se consideren relevantes. Por lo tanto, la secuenciación masiva en paralelo es ideal para validar otras metodologías de detección de mutaciones.

En este estudio, hemos validado dos métodos de detección de mutación basada en la secuenciación (didesoxi y pirosecuenciación) contra la secuenciación en paralelo en un entorno clínico, teniendo en cuenta el contenido de las células tumorales, así como la calidad y el tipo de tejido (por ejemplo, FF, FFPE) de cada muestra.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Colonia y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. Un subgrupo de pacientes (n = 9) participaron en el ensayo ERLOPET (NCT00568841).

Las muestras tumorales y líneas celulares

En este estudio, se han analizado 24 muestras tumorales obtenidas de 22 pacientes ( Tabla 1). Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética local y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. Un subgrupo de pacientes (n = 9) participó en el ensayo ERLOPET (NCT00568841). Tumor especímenes fueron revisados ​​por un patólogo de referencia para determinar el contenido de células tumorales para la posterior disección de áreas con más alto contenido de células tumorales. líneas celulares de cáncer que albergan diferentes
EGFR
y
KRAS
mutaciones se obtuvieron y se cultivaron como se ha descrito anteriormente (Tabla S1) [21]. El ADN genómico de todas las muestras de tumor y líneas de células se extrajo usando Gentra Kit de Gene Pure Tissue (Qiagen), seguido por la cuantificación de ADN utilizando reactivos Picogreen dsDNA (Invitrogen).

PCR y secuenciación didesoxi Directo

EGFR
exon18-21 y
KRAS
exón 2 y 3 se amplificaron mediante PCR anidada y pares de cebadores externos e internos específicos de genes (Tabla S2). Los cebadores internos están equipadas con la secuencia de M13-cebador para facilitar la secuenciación. Para las reacciones de PCR externos, se utilizó 5-10 ng (40-60 ng de ADN de baja calidad) de ADN genómico. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 50 l (0,2 mM de cada cebador, MgCl 2 mM
2, 200 mM de cada dNTP y 1,25 U HotStarTaq
Plus
KIT ADN polimerasa (Qiagen)) y las siguientes condiciones de ciclo: 95 ° C durante 5 min, 30 ciclos a 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg y 72 ° C durante 1 min y extensión final a 72 ° C durante 10 min. Después ExoSap-IT (USB Corporation) los productos de PCR tratamiento fueron bidireccional secuenciado usando los cebadores de secuenciación M13-Mix y BigDye Terminator versión 3.1 (Applied Biosystems) en el ABI 3730 (Applied Biosystems). electroferogramas de secuenciación se analizaron mediante inspección visual de electroferogramas y por mutación Surveyor 2.03 Software (SoftGenetics). El análisis de longitud de fragmentos de
EGFR
exón 19 se llevó a cabo mediante PCR estándar (Para-Hex-ctggatccagaaggtgaga y Rev-ccacacagcaaagcagaaac) que resulta en amplicones de 118 pb (Ta = 59 ° C) para la de tipo salvaje exón 19 . Los productos de PCR se analizaron en ABI 3700 secuenciador de ADN y se puntuaron por el software GeneMarker (SoftGenetics).

pirosecuenciación ensayos

Hemos diseñado cinco pirosecuenciación diferente [22] ensayos para el análisis de secuenciación de
EGFR
exón 19-21 y
KRAS
exón 2 y 3 (Tabla S3). El ADN molde (6 ng de ADN genómico o de productos de la PCR externos) se amplificó usando HotStarTaq
Plus
KIT ADN polimerasa (Qiagen) y el protocolo estándar (0,2 M de cada cebador, dNTPs 160 mM, 2 U de enzima) y condiciones de ciclación (45 ciclos y Ta = 59 ° C para
EGFR
exón 19, Ta = 60 ° C para
KRAS
exón 2, Ta = 63 ° C para
EGFR
exón 20, Ta = 61 ° C para
EGFR
exón 21 y
KRAS
exón 3 y Ta = 60 ° C para
KRAS
exón 2). cebadores de PCR inversa se biotina para el análisis posterior de pirosecuenciación. Pyrosequencing reacciones se llevaron en el instrumento PSQ HS96A utilizando reactivos PSQ HS96A SNP y software de análisis de pirosecuenciación SNP (Biotage AB, Uppsala, Suecia, ahora llamado PyroMark ™ Q96MD por Qiagen). Para los estudios de sensibilidad, cuantificado productos de PCR de
EGFR
células -mutant o
se diluyeron KRAS
células -mutant con el tipo salvaje
EGFR
o de tipo salvaje
KRAS
amplicones, respectivamente. las señales de datos en bruto pirosecuenciación se normalizaron mediante señales de tipo salvaje conocidas. llamada mutación significativa se determinó a partir ruido experimental mediante el análisis estadístico de los datos en bruto mediante la prueba t (p = 0.05).

secuenciación masivamente paralelo análisis

secuenciación masiva en paralelo se realizó utilizando la Norma GS FLX o GS FLX Titanium química de acuerdo con protocolos estándar (Roche). bibliotecas de amplicones se generaron utilizando productos de PCR externos como plantillas y protocolos estándar y condiciones del sistema de alta fidelidad fastStart PCR (Roche) (Tabla S4). Se utilizó un promedio de 340.000 cuentas de cada procesamiento, obteniéndose 80,000 a 120,000 lee en total y una cobertura de amplicón que van desde 600 a 1500 × × con una longitud media de amplificación de 250-300 pb que cubre la totalidad del exón. Todas las lecturas fueron alineados al cromosoma de 7 y 12 de la referencia del genoma (hg18) usando BWA [23]. Por último, alineado lecturas fueron visualizados y analizados por la Integrativa Genómica Visor (http://www.broadinstitute.org/igv/). Se utilizó la prueba T de Student para la comparación de la frecuencia de lectura relativa entre
EGFR mutado
y los tumores de tipo salvaje. Hemos establecido la tasa de error de secuenciación al 0,1% en las zonas sin homopolímeros [24]. El umbral para la detección significativa de alelos mutados se definió utilizando una distribución de Poisson de la tasa de error conocida teniendo en cuenta la cobertura que lleva a un límite de detección entre 0,3 y 0,5% alelos mutantes.

Resultados

pacientes y muestras tumorales

Entre septiembre de 2008 abril de 2009, hemos analizado los pacientes con CPNM confirmado histológicamente la presencia de mutaciones en los exones 18-21 de
EGFR
y los exones 2 y 3 de
KRAS
. Los pacientes que participaron en este estudio el análisis de mutaciones no son representativos de la prevalencia de tales mutaciones en CPNM, ya que se enriquecen de los casos con una mayor probabilidad de ser
EGFR
mutación positiva basa en características histopatológicas y clínicas (por ejemplo, de pulmón adenocarcinoma de luz nunca o ex fumadores). En este estudio de referencia, se han analizado 24 tumores de 22 pacientes (Tabla 1) para una comparación sistemática de los resultados de la detección de mutaciones didesoxi convencional y pirosecuenciación contra una de las tecnologías de secuenciación más sensible, masivamente paralelo secuenciación [20]. El contenido de células tumorales de cada uno de estos especímenes se estimó por un patólogo con un rango de 5% a hasta un 95%. Las muestras clínicas compuesto (FFPE) los bloques de tejido tumoral incluidos en parafina, así como biopsias (FF) fresco congelado fijado en formalina y se desliza o citológicos obtenidos a partir de los derrames pleurales (Tabla 1).

La detección de mutaciones clínicamente relevantes métodos de diferente sensibilidad

primero realizó la secuenciación convencional basada en la terminación de la cadena didesoxi-nucleótidos ( "Sanger") en todas estas muestras, ya que, a pesar de sus limitaciones, este método es todavía el método más ampliamente utilizado para la detección de mutaciones en muestras clínicas. Se determinó la sensibilidad de esta técnica de secuenciación en un rango de 20-30% de los alelos mutados mediante la mezcla de productos de PCR de
KRAS
líneas de células de tipo salvaje y -mutant (Complementario. Fig S1). Mutación de cribado de 24 muestras tumorales por secuenciación didesoxi reveló cortos deleciones de nucleótidos en marco en
EGFR
exón 19 (Tabla 1, Fig. 1A y 1B) en ocho muestras y sólo una muestra (caso 03) albergaba el L858R mutación puntual en el exón 21 del
EGFR gratis (Tabla 1). Por otra parte, tres muestras de casos (19, 24 y 30) tenían mutaciones en el exón 2 del
KRAS
gen (Tabla 1).

El análisis de secuenciación de
EGFR
exón 19 se realizó por secuenciación didesoxi (electroferogramas en los paneles de la izquierda), la pirosecuenciación (pyrogams en los paneles medio) y secuenciación masiva en paralelo (programas en el panel de la derecha). (A) de tipo salvaje
EGFR
exón 19 detectada por las tres técnicas de secuenciación; (B) L747_A750del, P753S mutación detectada por las tres técnicas de secuenciación; (C) E746_A750del (Del-1A) de mutación identificado por pirosecuenciación y secuenciación masiva en paralelo; (D) E746_A750del (Del-1B) sólo se detectan mediante secuenciación masiva en paralelo. del, borrado; Mut, la mutación; WT, de tipo salvaje. Las flechas indican la posición de las señales específicas de mutación esperados.

A continuación se probó si la pirosecuenciación convencional [22] fue capaz de confirmar las mutaciones encontradas por secuenciación didesoxi y si las mutaciones adicionales podrían ser encontrados por este método en la cohorte de pacientes probado. Pirosecuenciación ofrece detección cuantitativa rentable de las variantes de secuencia y se había demostrado que permitirá sensibles
KRAS
la detección de mutaciones en el cáncer colorrectal [12], [25], [26]. La sensibilidad mejorada para la detección de variantes raras se debe a la generación de señales, que no interfieren individuales para alelos mutantes y de tipo salvaje. Establecimos ensayos sensibles pirosecuenciación (5-10% alelo mutante), reproducibles y lineales de los puntos más destacados de mutación en
EGFR
y
KRAS gratis (complementario Fig. S2, S3, S4, S5 , S6, S7, S8, S9, S10). Pirosecuenciación confirmó todas las mutaciones detectadas por secuenciación didesoxi (Tabla 1). Sin embargo, también se detectaron cuatro mutaciones adicionales en nuestra cohorte muestra que había sido perdidas por secuenciación didesoxi (Tabla 1, Fig. 1C y complementaria. Fig S3A, S6B, S9A). Por ejemplo, hemos detectado la mutación de resistencia erlotinib, T790M, en la muestra de tumor 10 (contenido de células tumorales 80%) obtenido en el momento de la recaída (complementario Fig. S6B) y esta muestra también albergaba la deleción L747_S752del_P753S detectaron inicialmente por secuenciación didesoxi (Tabla 1 y Fig. S4C). Encontramos además una sustitución G12A no detectada previamente en el exón 2 de
Hoteles en KRAS muestra de 11 (50% de contenido de células tumorales, que complementa la Fig. S9A) y confirmó esta mutación por subclonación de
KRAS
exón 2 amplicones y secuenciación didesoxi posteriores (datos no mostrados).
EGFR
exón 19 pirogramas de muestra 27 (células tumorales 40%) y de la muestra 05 (células tumorales 50%) mostraron señales de fluorescencia indicativo de la presencia de mutaciones que fueron significativamente por encima del nivel de ruido experimental (Fig. 1C y complementario Fig. S3A). Fragmento de longitud análisis de
EGFR
exón 19 productos de PCR validados esta supresión en la muestra 27 (Fig complementario. S11).

Finalmente, se empleó masivamente paralela basada en matrices de pirosecuenciación por síntesis [ ,,,0],20] para validar los resultados obtenidos por mutación didesoxi convencional y pirosecuenciación. Hemos secuenciado todas las 24 muestras a un rendimiento medio de 1079 × y una cobertura mínima de 600 × por el exón y el espécimen. Análisis de los datos confirmó la presencia de
EGFR
y
KRAS
mutaciones en 13 muestras inicialmente identificada por tanto, la secuenciación didesoxi y pirosecuenciación (Tabla 1). Por otra parte, la secuenciación masiva en paralelo también la validez de las cuatro mutaciones adicionales que se acaba de detectar pirosecuenciación sensibles:
EGFR
exón 19 supresiones en la muestra 05 y 27, la mutación G12A de
KRAS
en la muestra 11 y la mutación T790M de
EGFR
en la muestra 10 (tabla 1). La naturaleza paralela de este enfoque de secuenciación permitió la cuantificación precisa y la identificación de estas variantes de baja frecuencia. Específicamente, hemos identificado la mutación del exón 19 en la muestra 05 para ser un 9-bp deleción en marco que codifica la eliminación de sustitución de aminoácido E746_R748del_A750, a una frecuencia de 11% de 1315 lee (Tabla 1). Además, se cuantificó una deleción de 12 pb (E746_A750) a ocurrir a una frecuencia de 11% de los 854 lee en la muestra 27 (Fig. 1C). La sustitución G12A en la muestra 11 estaba presente en 21% de 1358 lee y la mutación de resistencia T790M en la muestra 10 se produjo a una frecuencia de 20% de 909 lee (Tabla 1).

Además de la validación de la anteriormente mutaciones detectadas en paralelo secuenciación identificó
EGFR
exón 19 deleciones en la muestra 31 y 13a, que eran indistinguibles de ruido experimental, tanto en didesoxi convencional y análisis de pirosecuenciación. secuenciación paralela habilitado la detección de un E746_A750del en la muestra 31 a una frecuencia de 6% de 1081 lee (Tabla 1 y Fig. 1D). Sorprendentemente, este espécimen se había estimado para contener células tumorales 60% por histopatología (Tabla 1). Del mismo modo, flowgrams de 13a muestra (células tumorales 5%) revelaron una deleción de 12 pb (L747_A750del_T751P) a una frecuencia de aproximadamente 8% de los 658 lee (Tabla 1). Esta mutación fue idéntica a la ya detectado por secuenciación didesoxi en otra muestra del mismo paciente (muestras 13b) con mayor contenido de tumor (70%), obtenidos en el momento de la recaída (Tabla 1). Por lo tanto, más allá de la validación de todas las otras mutaciones que habían sido llamados por secuenciación didesoxi (n = 12) y pirosecuenciación (n = 16), la secuenciación masivamente paralelo identificó dos muestras mutadas, además, que habían sido pasados ​​por alto por los otros dos métodos debido a la insuficiente sensibilidad . (Tabla 1 y el cuadro complementario S5)

a continuación analizaron alta calidad 454 secuenciación lee (puntuación phred & gt; 30) con el objetivo de detectar mutaciones T790M que ocurren a baja frecuencia en las muestras obtenidas antes de la terapia. Exon 20 estaba cubierto con una profundidad promedio de 1018 lee en la región de codón 790. En los pacientes cuyos tumores tenían una deleción en el exón 19 o L858R se observó una significativamente mayor (p = 0,03) número de lecturas que contiene la mutación T790M en comparación con pacientes con tipo salvaje
EGFR gratis (EGFR mut: media = 2,5 /1000; rango 0-7,5 /1000; EGFR en peso:. significa 0,8 /1000 (0-2.3 /1000) Observamos que estas frecuencias de los alelos están en la gama del límite tecnológico de precisión. sin embargo, el número de lecturas con T790M estaba por encima del umbral para la mutación que llama en 27% de las muestras con deleción en el exón 19 o L858R pero en ninguna de las muestras sin
EGFR
mutación (suplementario Fig. S12).

en su conjunto, la secuenciación masiva en paralelo identificó un total de 18 mutaciones en
EGFR
y
KRAS
lo que resulta en una sensibilidad del 67% para didesoxi secuenciación y el 89% para la pirosecuenciación (cuadro 1 y el cuadro complementario S5). a pesar del tamaño reducido de nuestra muestra, estos resultados ponen de relieve la dramática falta de sensibilidad de secuenciación didesoxi en la detección de mutaciones clínica.

la sensibilidad de la detección de mutaciones como una función del contenido de la celda tumor

contenido-célula tumoral es un parámetro crítico para el rendimiento de la detección de mutaciones en el cáncer [20] y es la base para el enriquecimiento de células tumorales a base de microdisección. Por lo tanto, hemos tratado de analizar el rendimiento de los tres métodos de análisis de la mutación como una función del contenido de las células del tumor histopatológico estimado. El contenido medio del tumor de las muestras identificadas como mutantes por secuenciación didesoxi era 78% (rango 35 a 95%) y 71% (rango 35 a 95%) en el caso de pirosecuenciación (Fig. 2A). Todas las muestras, en los que didesoxi de secuenciación había perdido las mutaciones, contenían 80% de células tumorales o menos. Por el contrario, las muestras en las que se había perdido pirosecuenciación mutaciones tenían 60% de contenido de tumor o menos (Fig. 2A).

(A) de correlación entre el contenido de las células tumorales estimada y la frecuencia real de alelos mutados determinado por masivamente , los datos de secuenciación paralela. Negras, las mutaciones detectadas por didesoxi y pirosecuenciación; Verdes, las mutaciones detectadas por pirosecuenciación, pero falló por secuenciación didesoxi; Red, las mutaciones sólo se detecta por secuenciación paralela. (B) La sensibilidad de secuenciación didesoxi, pirosecuenciación y secuenciación masiva en paralelo en los pacientes con respuesta clínica confirmado que el tratamiento con erlotinib.

A continuación se evaluó la correlación entre el contenido de las células del tumor y la frecuencia de los alelos mutados como se determina por secuenciación masiva en paralelo (Fig. 2A). Se ha observado una baja correlación entre la frecuencia de los alelos determinada analíticamente y el contenido de las células del tumor (
r
2
= 0,27,
p = 0,029
). Sorprendentemente, los límites de detección de los diferentes enfoques determinó por recuento de mutante y de tipo salvaje alelos detectados por secuenciación masiva en paralelo en los tumores primarios eran muy similares a las observadas en los experimentos iniciales de mezcla de alelos (Figs suplementarios. S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10): 29% para la secuenciación didesoxi y 11% para la pirosecuenciación (Tabla 1 y Fig 2A).. Las frecuencias de los alelos de mutaciones encontradas por pirosecuenciación pero no secuenciación didesoxi osciló entre 11% y 21% (Fig. 2A). Las mutaciones solamente detectadas por secuenciación masiva en paralelo se produjeron a frecuencias de los alelos de menos de 10% (Tabla 1 y Fig. 2A). Sorprendentemente, el contenido de tumor en estos casos se ha estimado en 60% y 5%, respectivamente. Por lo tanto, las estimaciones histopatológicos de contenido de células tumorales no son predictivos de la frecuencia de alelos mutantes, mientras que la capacidad de detectar mutaciones está limitada por la frecuencia de los alelos, pero no por el contenido de las células tumorales.

mutaciones de EGFR y el resultado clínico

los análisis anteriores de la asociación de
EGFR
mutaciones y beneficios clínicos inducidos por
EGFR
la inhibición de vez en cuando ha arrojado resultados inconsistentes en que algunos estudios han informado de la falta de dicha asociación [ ,,,0],27], [28], [29] Tales inconsistencias podrían resultar de la falta de detección de mutaciones con la suficiente sensibilidad y precisión. Es importante destacar que, en nuestra cohorte, solamente secuenciación masiva en paralelo fue capaz de detectar un sensibilizante
EGFR
mutación en
todos
pacientes que habían experimentado una respuesta parcial (según los criterios RECIST) después del tratamiento con erlotinib ( la Fig. 2B). Por el contrario, sólo 7 de cada 11 pacientes con PR confirmado fueron detectadas por secuenciación didesoxi y 9 de 11 fueron identificados por pirosecuenciación (Fig. 2B). Por lo tanto, a pesar del tamaño limitado de nuestra cohorte de pacientes, estos resultados apoyan la idea de que las grandes diferencias en la sensibilidad sesgan fuertemente la asociación entre la presencia de
EGFR
mutaciones y la respuesta a erlotinib. Los pacientes con
EGFR
tumores de tipo -wild y
KRAS
tumores -mutant que habían recibido erlotinib exhibido enfermedad estable o progresiva (Tabla 1) de acuerdo con los informes anteriores [30].

Discusión

a continuación, se muestra cómo la limitada sensibilidad de los métodos que se aplican ampliamente a los diagnósticos clínicos de mutación podría dar lugar a una inexactitud importante en la estratificación genética del paciente. En particular, la baja sensibilidad de secuenciación didesoxi dio lugar a diagnósticos erróneos en 6 de los 24 especímenes de cáncer de pulmón. Si la presencia de un
EGFR
mutación había sido el criterio de inclusión para el tratamiento con
EGFR inhibidores
, cuatro pacientes no habría recibido el tratamiento adecuado. Por lo tanto, a pesar del tamaño reducido de nuestra muestra, estos resultados ponen de relieve la insuficiencia de secuenciación didesoxi para el diagnóstico de mutación génica del cáncer clínicos. Por el contrario, pirosecuenciación convencional que ofrece una mayor sensibilidad con sólo dos pacientes que están siendo mal diagnosticada. Por otra parte, la secuenciación masiva en paralelo con firmeza y precisión identifica todas las mutaciones presentes en el conjunto de datos. Además, muestran que la secuenciación paralela puede detectar mutaciones T790M preexistentes en una fracción del 27% de
EGFR
pacientes -mutant [31]. Estos resultados apoyan la conclusión de que la secuenciación masiva en paralelo es la tecnología más sensible disponible actualmente en los diagnósticos clínicos de mutación y sugieren que pirosecuenciación podría ser una alternativa a la secuenciación didesoxi.

Mientras que muchas técnicas han surgido en los últimos años para que coincida la siempre creciente necesidad de proporcionar mutación clínico preciso análisis de los oncólogos, ninguno de ellos ha sido referenciado sistemáticamente en contra de secuenciación masiva en paralelo, el método de la más alta sensibilidad para la detección de mutaciones clínica hasta la fecha. Extrapolando diferencias tales como los observados en este estudio para el gran número de pacientes con cáncer en todo el mundo indica que muchos pacientes están siendo mal diagnosticados cada año. Por lo tanto, cuidadosamente desarrollado enfoques de diagnóstico (incluida la validación exhaustiva contra la secuenciación masiva en paralelo) ayudará a la orientación de tratamiento eficaz para la población de pacientes derecha.

microdisección se ha aplicado ampliamente para aumentar la fracción de células tumorales en una muestra dada con el fin para mejorar la sensibilidad de secuenciación didesoxi. Identificación de las áreas de tumor rico es un requisito previo para tal procedimiento. Hemos encontrado, sin embargo, sólo una baja correlación del contenido de las células del tumor y la frecuencia de los alelos mutantes. Asumimos que un estudio sistemático de las secciones histopatológicas no puede estimar con precisión el grado de "contaminación" del alelo mutante por células espectadoras sanos (por ejemplo, el tejido pulmonar normal), que oscurecen la frecuencia del alelo mutante. Por lo tanto, la microdisección sólo puede rescatar en parte la limitada sensibilidad de secuenciación didesoxi y por lo tanto también debe ser validado cuidadosamente frente a la secuenciación masiva en paralelo.

Otro tema ampliamente tratado es la cuestión de si el genotipado o secuenciación podría ser la estrategia óptima para clínica la detección de mutaciones en el cáncer. Aunque nuestros resultados sugieren que la pirosecuenciación es un método sensible, preciso y rentable para analizar la gran mayoría de las muestras con un contenido de tumor de 20 a 70%, otros métodos, incluyendo los basados ​​en el genotipado, podrían realizar igualmente bien. En el caso de mutaciones de puntos calientes ya conocidas de ácido nucleico cerrado (LNA) enfoques son capaces de detectar los alelos mutantes que se producen a frecuencias tan bajas como 0,1% [14], [16]. Otras técnicas que pueden tener valor en la aplicación clínica incluyen inmunohistoquímica utilizando
EGFR anticuerpos
-mutación específica [32] o la aplicación de las balizas moleculares acopladas por imágenes fluorescentes [33]. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la incapacidad intrínseca de los métodos de genotipado para cubrir todas las mutaciones clínicamente relevantes, se suma a cualquier falta de sensibilidad analítica. Basándose en estas consideraciones, favorecemos la detección de mutaciones basados ​​en la secuenciación de más de genotipado. Aunque nuestro tamaño de la muestra es demasiado limitado para el cálculo integral sensibilidad y especificidad de la detección de mutaciones, creemos que la inferioridad sorprendente de secuenciación de Sanger convencional para detectar mutaciones del oncogen terapéuticamente relevantes es de considerable interés para los patólogos moleculares y oncólogos clínicos.

en resumen, hemos demostrado cómo las tecnologías de secuenciación con sensibilidad inferior pueden no detectar las mutaciones del oncogen clínicamente relevantes en pacientes con cáncer. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que cualquier nuevo método para el diagnóstico de mutación clínicos debe ser validado a fondo contra la secuenciación masiva en paralelo con el fin de proporcionar un análisis genético correcta como base para la terapia molecular dirigida.

Apoyo a la Información
Figura S1. estudio
Sensibilidad de secuenciación didesoxi y pirosecuenciación. Se utilizaron diferentes mezclas de productos de PCR de tipo salvaje o mutante líneas celulares de NSCLC G12S para determinar el límite de sensibilidad de la secuenciación didesoxi (~20-30%) y pirosecuenciación (~ 5%). señales específicas de mutación están marcados con un asterisco en electroferogramas didesoxi (paneles de la izquierda) y flechas rojas en programas (paneles de la derecha). Mut, la mutación; . WT, de tipo salvaje
doi: 10.1371 /journal.pone.0019601.s001 gratis (TIF)
figura S2.
de sensibilidad y pruebas de linealidad de la
EGFR
ensayo de pirosecuenciación exón 19. Las mezclas de E746_A750del mutante (Del-1a) y productos de PCR de tipo salvaje de líneas celulares de cáncer se utilizaron para analizar el límite de detección de la mutación y la linealidad del ensayo. El ensayo es sensible a un mínimo de 5 a 10% de los alelos mutados. señales específicas de mutación están marcados por las flechas rojas. del, borrado; Mut, la mutación; . WT, de tipo salvaje
doi: 10.1371 /journal.pone.0019601.s002 gratis (TIF)
Figura S3. El análisis
pirosecuenciación de
EGFR
exón 19 en muestras de tumores de NSCLC. (A)
EGFR
exón 19 de eliminación identificados en la muestra con el contenido de las células tumorales del 50% que anteriormente no fue identificado por secuenciación didesoxi; (B) No detección de la mutación significativa en 13a muestra con un contenido de células tumorales 5%. posición esperada de señales específicas de mutación está marcada por la flecha roja. del, borrado; Mut, la mutación; . WT, de tipo salvaje
doi: 10.1371 /journal.pone.0019601.s003 gratis (TIF)
figura S4.
pirogramas de
EGFR
exón 19 mutantes de líneas celulares tumorales y muestras de NSCLC. (A) la mutación Del-B en HCC827 línea celular; (B-D) muestras tumorales con un contenido celular tumoral elevada que permite una caracterización precisa de la mutación individual;

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