Extracto
La sobreexpresión y /o activación de la mutación de quinasa FLT3 juegan un papel motor principal en la patogénesis de la leucemia mieloide aguda (LMA). Por lo tanto, los inhibidores farmacológicos de FLT3 son de potencial terapéutico para el tratamiento de AML. En este estudio, BPR1J-340 fue identificado como un nuevo inhibidor de FLT3 potente por la actividad de quinasa bioquímica (IC
50 aproximadamente 25 nM) (
50 aproximadamente 5 nM GC) ensayos y la proliferación celular. BPR1J-340 inhibe la fosforilación de FLT3 y STAT5 y desencadena la apoptosis en FLT3-ITD
+ células de AML. Se determinaron los parámetros farmacocinéticos de BPR1J-340 en ratas. BPR1J-340 también demostró la inhibición del crecimiento tumoral y regresión pronunciada en FLT3-ITD
+ AML modelos murinos xenoinjertos. El tratamiento de combinación de la vorinostat inhibidor de HDAC (SAHA) con BPR1J-340 induce sinérgicamente la apoptosis a través de Mcl-1 baja regulación en 13 MOLM células de AML, lo que indica que la combinación de inhibidores de quinasa FLT3 selectivos y los inhibidores de HDAC podría exhibir un beneficio clínico en AML terapia. Nuestros resultados sugieren que BPR1J-340, podrán desarrollarse en los estudios preclínicos y clínicos como agentes terapéuticos en tratamientos AML
Visto:. Lin WH, Yeh los conocimientos tradicionales, Jiaang WT, Yen KJ, Chen CH, Huang CT, et Alabama. (2014) Evaluación de los efectos antitumorales de BPR1J-340, una combinación potente y selectivo inhibidor de FLT3, solo o en con un inhibidor de HDAC, vorinostat, en el cáncer de LMA. PLoS ONE 9 (1): e83160. doi: 10.1371 /journal.pone.0083160
Editor: Zhengqi Wang, de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Julio, 2013; Aceptado: 31 Octubre 2013; Publicado: 8 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la leucemia mieloide aguda (LMA) es la neoplasia maligna hematológica más común en adultos con una alta tasa de incidencia y baja probabilidad de supervivencia [1], [2], [3]. AML progresa rápidamente debido al rápido crecimiento de las células blancas de la sangre anormales que se acumulan en la médula ósea e interfieren con la producción de células rojas de la sangre, plaquetas y glóbulos blancos normales. Si no se trata, la LMA suele ser fatal en cuestión de semanas o meses después del diagnóstico. FLT3 (FMS tirosina quinasa 3), un receptor de la superficie celular pertenecientes a la familia de tirosina quinasas receptoras de clase III, juega un papel fundamental en la diferenciación y supervivencia de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea [4], [5].
FLT3
es uno de los genes más frecuentemente mutados en la LMA [6], [7]. La activación de mutaciones de FLT3, FLT3-ITD (una mutación de duplicación en tándem interna en el dominio juxtamembrane) y FLT3-TKD (una mutación sin sentido en el dominio quinasa), se observan con frecuencia en aproximadamente el 30% de los pacientes adultos con LMA [8], [9] , [10], [11]. mutantions FLT3-activación regulan críticamente la transformación leucémica mediante la aceleración de la proliferación y la supresión de la apoptosis y se asocian significativamente con un mal pronóstico [12], [13]. Estos resultados ponen de relieve FLT3-ITD y FLT3-TKD como altamente atractivas dianas terapéuticas para el desarrollo de fármacos en la LMA humana.
Ahora Hay varias clases de inhibidores de moléculas pequeñas FLT3 que han entrado en ensayos clínicos. Sin embargo, los medicamentos eficaces aún no han sido identificados en las clínicas [14], [15], [16]. Aunque estos inhibidores han demostrado actividad contra el cáncer prometedor en
e in vitro
in vivo
modelos preclínicos, respuestas clínicamente positivos en pacientes con LMA tratados con inhibidores de FLT3 como agente único son limitadas debido a la reducción transitoria de blastos periféricos, pero no blastos en la médula ósea o la ocurrencia de mutaciones resistentes a los inhibidores de FLT3 en los pacientes [17], [18], [19], [20]. Por lo tanto, las estrategias combinatorias de los inhibidores de FLT3 y otros agentes quimioterapéuticos pueden ser enfoques beneficiosos para mejorar la terapia con inhibidores de FLT3 y para superar los fracasos del tratamiento [21], [22]. El inhibidor de FLT3 CEP-701 (lestaurtinib) en combinación con agentes quimioterapéuticos convencionales AML tiene el potencial de mejorar los resultados clínicos en pacientes con LMA [23]. Además, los inhibidores de histona desacetilasa (HDACi), una clase de compuestos que pueden inducir la detención del crecimiento de células de cáncer y la muerte celular mediante la alteración del estado de acetilación de las proteínas tanto de las histonas y no histonas, puede aumentar la actividad de los inhibidores de FLT3 en la AML apoptosis celular [ ,,,0],24], [25], [26]. El vorinostat HDACi (SAHA) presenta actividad clínica en la LMA; Sin embargo, su eficacia como agente único es sólo moderada [27], [28]. En este estudio, se presenta datos que caracterizan el perfil farmacológico de un nuevo inhibidor de la quinasa FLT3, BPR1J-340, y elucidar el mecanismo molecular posible de los efectos sinérgicos fuertemente en combinación con SAHA en FLT3-ITD
+ células.
El compuesto BPR1J-340 exhibe una potente actividad inhibidora de FLT3, con una concentración inhibitoria del 50% (IC
50), de 25 ± 5 nm y efectos inhibidores del crecimiento de FLT3-ITD
+ leucemia MOLM-13 y MV4 ; 11 células con un GC
50 valor de 3,4 ± 1,5 y 2,8 ± 1,2 nM, respectivamente. El IC
50 valores fueron de aproximadamente 1 nM frente a FLT3-ITD y 1 nM frente a la fosforilación STAT5 en MV4; 11 células. Además, BPR1J-340 exhibe propiedades farmacocinéticas favorables y la actividad antitumoral significativa en los modelos de xenoinjerto murino FLT3-ITD. La combinación del inhibidor de HDAC SAHA con BPR1J-340 exposiciones fuertemente sinérgico efecto anti-leucemia en-FLT3 ITD + células. Estos resultados ponen de manifiesto el potencial terapéutico de BPR1J-340 y SAHA en la LMA y apoyar su desarrollo preclínico o clínico.
Materiales y Métodos
productos químicos y reactivos
Los inhibidores de FLT3, BPR1J-340 y AC220, fueron sintetizados por nuestro laboratorio. El vorinostat inhibidor de la histona deacetilasa (SAHA) se adquirió de SelleckBio (Houston, TX, EE.UU.). Todos los inhibidores se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de stock de 10 mM. El anti-FLT3 (sc-480, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-pFLT3-Tyr591 (# 3461, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.) anti-STAT5 (# 9363, Cell Signaling Technology ), anti-pSTAT5-Tyr694 (# 9351, Cell Signaling Technology), anti-escinde poli polimerasa ADP-ribosa (PARP) (# 9542, Cell Signaling Technology), anti-MCL-1 (# 4572, Cell Signaling Technology), anti-caspasa 3 (# 9662, Cell Signaling Technology) y anti-β-actina (Gtx110546, GeneTex, Irvine, CA, USA) anticuerpos fueron adquiridos para el análisis de Western blot. La preparación de proteínas recombinantes, FLT3 (residuos Y567-S993), VEGFR1 (residuos R781-I1338) y VEGFR2 (residuos V789-V1356), por ensayo de quinasa bioquímica se describió anteriormente [29]. Los VEGFR3 (residuos M800-Y1363), las proteínas se adquirieron de Upstate (Billerica, MA, EE.UU.)
Cultivo de células
RS4;. 11, MV4; 11, células U937 y K562 se obtuvieron a partir American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). células MOLM-13 fueron adquiridos de la Deutsche Sammlung von Microorganismen und Cultivos Celulares GmbH (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Todas las líneas celulares leucémicas fueron cultivadas en RPMI 1640 (Invitrogen, EE.UU.) con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.). El HEK293T y células HEK293T transfectadas de FLT3 se cultivaron en DMEM (Invitrogen, EE.UU.) medio con 10% de suero bovino fetal (FBS). Los otros 14 líneas celulares no leucémicas, HCC827, H1975, H1650, H2228, NCIH460, A431, HCT-116, MKN45, MiaPaCa-2, RT4, MCF-7, Huh7, Hep 3B, y Detroit 551, se cultivaron en medio de acuerdo a las recomendaciones de la ATCC.
In vitro la actividad de quinasa de ensayo
El FLT3 y ensayos de quinasa VEGFR1 /2 quinasa-Glo se realizaron como se informó por nuestro estudio anterior [30]. El análisis de la actividad VEGFR3 se llevó a cabo utilizando el mismo protocolo descrito en el ensayo de VEGFR1 /2. El perfil de la inhibición de quinasa y la actividad inhibidora de FLT3-D835Y, CSF1R, y TRKA se determinaron por Invitrogen SelectScreen® servicio de perfiles quinasa (Carlsbad, California, EE.UU.).
viabilidad celular y el crecimiento celular ensayos
la viabilidad celular se evaluó con un ensayo MTS como llevado a cabo como el método descrito anteriormente [31]. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células por pocillo durante 16 horas y después se trataron con vehículo o diversas concentraciones de compuesto en el medio. El cambio en las células viables se cuantificó usando el método MTS (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante o por el recuento de células bajo un microscopio. El GC
50 valor se definió como la cantidad de compuesto que provocó una reducción del 50% en la viabilidad celular en comparación con el control tratado con DMSO (vehículo) y se calculó utilizando la versión software Prism 4 (Graph-Pad Software, Inc., San Diego, CA, EE.UU.). Los datos se presentan como la media ± S.D. de tres experimentos independientes. El crecimiento celular se midió por el método de exclusión de colorante azul de tripano. Las células (1 x 10
4 ml
-1) se cultivaron en placas de 12 pocillos durante 24 horas y después se trataron con diferentes cantidades de compuesto de ensayo y los mismos volúmenes de vehículo durante 72 horas. El número de células viables se contó por tinción con azul de tripano colorante usando un hemocitómetro en el punto de tiempo indicado después de tratamiento de drogas. El resultado se expresó como la media ± S.D. de determinaciones por triplicado.
Western blotting
Las células se lisaron en tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS, ortovanadato 1 mM de sodio, PMSF 1 mM, y DTT 1 mM). Proteína lisados se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Las membranas se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos apropiados y detectado usando el reactivo SuperSignal (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.), seguido por la exposición a película de rayos X.
Apoptosis ensayo
El número de células apoptóticas se determinó por fluorescencia de células activadas (FACS) se analizan mediante la tinción con anexina V-FITC. En resumen, las células se centrifugaron después del tratamiento de drogas y se resuspendieron en 1 x tampón de unión que contenía 2,5 mM de calcio (Ca2 +). Se incubaron las células con anexina V-FITC (Biolegend, San Diego, CA) y yoduro de propidio (PI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, las muestras se reconstituyeron con tampón de unión 1 x y se sometieron a citometría de flujo FACS Calibus (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) para analizar la población Anexina V-positiva utilizando CellQuest Pro (BD Bioscience) y FlowJo (TreeStar, Inc., San Carlos, CA).
El análisis farmacocinético de BPR1J-340
los usos de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y uso de los Institutos nacionales de investigación en Salud. Brevemente, ratas Sprague-Dawley macho que pesaban 300 a 400 g cada una se obtuvieron de BioLASCO, Taiwan Co., Ltd., Ilan, Taiwan. Un día antes de la dosificación, las ratas se prepararon quirúrgicamente con una cánula yugular venosa y ayunó durante la noche (~18-20 hr). El agua estaba disponible
ad libitum
. La comida se proporcionó a las 4 horas después de la dosificación. Individual 1,5 mg /kg dosis intravenosa de BPR1J-340, como PEG400 /agua (80/20, v /v) de solución, se administró por separado a grupos de 3 ratas cada uno a través de la cánula de la vena yugular. En 0 (antes de la dosis), 2, 5, 15 y 30 min. y a las 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación, se recogió una muestra de sangre. Se separó el plasma de la sangre por centrifugación (14.000 g durante 15 min a 4 ° C en una centrífuga Beckman Modelo AllegraTM 6R) y se almacena en un congelador (-20 ° C) hasta su análisis. Todas las muestras de plasma se analizaron por LC-MS /MS. datos de concentración de plasma se analizaron con el método no compartimental para la determinación de farmacocinética.
subcutáneamente experimentos de xenoinjertos de tumores
ratones desnudos macho (Nu-Fox1nu) de ocho semanas de edad fueron adquiridos de BioLasco (Ilan, Taiwán ). Los ratones desnudos (n = 5~7 por grupo) se inocularon por vía subcutánea con MOLM-13 (1 × 10
6 células /flanco). Se determinaron todas las células humanas de cáncer de estar libre de Mycoplasma spp antes de la inoculación. Cuando el tamaño de los tumores alcanzó 100~200 mm
3 y un gran tamaño de & gt; 500 mm
3, los animales se agrupan y se tratan con la BPR1J-340 (5 y 20 mg /kg, iv) o vehículo como controlar una vez al día durante 5 días por semana durante dos o tres semanas. tamaños de los tumores se midieron y se calcularon con la fórmula de longitud x anchura
2/2 después de la iniciación de los tratamientos. El tamaño del tumor y peso corporal del animal se midieron dos veces a la semana después de la inoculación de células tumorales. Al final del estudio, los animales fueron sacrificados por inhalación de dióxido de carbono seguido por dislocación cervical. La diferencia significativa entre el control tratado con vehículo y se analizaron mediante el uso de una sola vía
ANOVA
y
Student-Newman-Keuls
prueba. El nivel de significación estadística se estableció en
p
. & Lt; 0,05
Resultados
in vitro quinasa perfiles de BPR1J-340
BPR1J-340 , una urea sustituidos con 3-fenil-1
H
-5-basados pyrazolylamine compuesto, se diseñó mediante la modificación química de la serie de sulfonamida de derivados (BPR1J-097 series) por una relación estructura-actividad (SAR) estudio (Fig. 1) [31], [32]. Para la selección de inhibición especificidad quinasa, BPR1J-340 se ensayó frente a 59 proteínas quinasas que cubren las principales quinasas oncogénicas de kinome proteína humana. Este perfil de inhibición de quinasa reveló que BPR1J-340 es un inhibidor de quinasa altamente selectiva y la mayoría de las cinasas probadas no se inhibió significativamente a la concentración de 100 nM (Tabla S1). Posteriormente, se evaluaron adicionalmente los más potentes quinasas de la proyección 59 quinasas. Como se muestra en la Tabla 1, BPR1J-340 inhibió potentemente de tipo salvaje FLT3 (IC
50 = 29 ± 5 nM, en comparación con ABT869 con una CI
50 de 38 ± 3 nM,), mutante FLT3-D835Y (IC
50 = 19 nM), CSF1R (FMS) (IC
50 = 78 nM), KDR (VEGFR2) (IC
50 = 28 ± 9 nM), y FLT4 (VEGFR3) (IC
50 = 29 ± 7 nM). Además, BPR1J-340 inhibió TRKA, que se asocia con el crecimiento y la metástasis de los cánceres de mama, con una CI
50 valor de 8 nM. Dada la gran similitud de los bolsillos de unión de ATP de FLT3 y las quinasas Aurora, se midió la actividad inhibidora hacia Aurora A y B de Aurora. El IC
50 años de BPRJ-340 se determinó que 1.040 nM y 1.344 nM para Aurora quinasa A y Aurora quinasa B, respectivamente. Tomados en conjunto, BPRJ-340 es un inhibidor de quinasa selectivo con
in vitro
actividad contra los receptores de tirosina quinasas FLT3, VEGFR2, VEGFR3 y TRKA
BPR1J-340.:
N
1-(3-4-[([(5-ethyl-3-isoxazolyl)amino]carbonylamino)methyl]phenyl-1
H
-5-pyrazolyl)-4-[(4-methylpiperazino)methyl]benzamide. BPR1J-097:
N
1-(3-3-[(phenylsulfonyl)amino]phenyl-1
H
-5-pyrazolyl)-4-(4-methylpiperazino)benzamide.
BPR1J-340 inhibe la proliferación de FLT3-ITD
+ células
Después de que los efectos inhibidores del crecimiento selectivos y potentes de BPR1J-340 fueron demostrados en FLT3-ITD-teniendo células leucémicas, la actividad inhibidora de la proliferación celular se puso a prueba en una panel de células leucémicas y no leucémicas. BPR1J-340 inhibe la proliferación celular de FLT3-ITD
+ células (MOLM-13 y MV4; 11 líneas de células FLT3-dependiente) con un GC
50 de aproximadamente 5 nM. Las células que no eran dependientes de FLT3 de señalización para el crecimiento, incluyendo RS4; 11, células leucémicas U937, y K562 [33], [34], [35], y las líneas de células no leucémicas probadas fueron ya sea débilmente inhibido o no se inhibieron por BPR1J-340 (Tabla 2). El crecimiento de la RS4 FLT3-independiente; línea celular que contiene 11 de tipo salvaje FLT3 fue sólo débilmente inhibido por BPR1J-340 con un GC
50 valor de 770 ± 360 nm. La sensibilidad hacia BPR1J-340 varía entre las células FLT3-dependiente MOLM-13 /MV4; 11 y las células FLT3-independiente RS4; 11, lo que sugiere que la vía de señalización de FLT3 en-FLT3 ITD + células es casi completamente perturbada por BPR1J-340. Por otra parte, nuestros resultados sugieren que BPR1J-340 podría inhibir la actividad de la FLT-ITD por
in vitro
ensayos bioquímicos y celulares. En general, BPR1J-340 es un inhibidor potente y altamente selectivo para la proliferación de células FLT3-conducido.
BPR1J-340 inhibe FLT3-STAT5 señalización
Para resolver si BPR1J-340 fue capaz de inhibir la vía de señalización FLT3 en las células FLT3-conducido, MV4; 11 células se trataron con diferentes concentraciones de BPR1J-340 durante 1 hora, y el estado de fosforilación de FLT3 y STAT5 (transductor de señales y activador de la transcripción 5), una modulador crítico down-stream que juega un papel importante en la transducción de señal de FLT3-ITD para la expansión celular y la supervivencia, se examinó por análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Figura 2A, BPR1J-340 suprime la fosforilación de FLT3 y STAT5 de una manera dependiente de la dosis con una CI
50 valor de aproximadamente 1 nM. Para investigar la diferencia de sensibilidad entre FLT3-WT y los mutantes de activación FLT3-ITD y FLT3-D835Y a BPR1J-340, células HEK293T ingeniería genética para expresar FLT3-WT o mutantes FLT3 (FLT3-ITD, FLT3-D835Y) fueron analizados [31 ]. Las células HEK293T-FLT3 se trataron con BPR1J-340 a diversas concentraciones durante 1 hora, y se añadió (50 ng /ml) FLT3 ligando para 5 min para preparar el lisado de células para la detección de cambios en la fosforilación de FLT3 mediante análisis de Western. Como se muestra en la Figura 2B, la fosforilación de todo el FLT3-WT, FLT3-ITD y FLT3-D835Y fue inhibida por BPR-1J340, con IC
50 valores de 10 a 100 nM. Tomados en conjunto estos datos demuestran que BPR-1J340 inhibe la fosforilación celular FLT3 y modula la vía de señalización FLT3, en particular la vía de FLT3-ITD
(A) MV4;. 11 células fueron tratadas con BPR1J-340 a las concentraciones indicadas durante 1 hora. El estado de fosforilación de FLT3 y STAT5 se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. (B) células HEK 293T fueron transfectadas con FLT3-WT, FLT3-ITD-, o plásmidos FLT3-D835Y que expresan durante 24 horas y después se incubaron con varias concentraciones de BPR1J-340 durante 1 hora. El estado de fosforilación de FLT3 en las células transfectadas se evaluó mediante análisis de transferencia Western.
BPR1J-340 induce la apoptosis en FLT3-ITD que expresan las células
A medida que la inhibición de la señalización de FLT3 resultados en una pérdida de potencial de crecimiento y una inducción de la apoptosis en FLT3-ITD células que expresan, se investigó los efectos de BPR1J-340 en células apoptóticas en respuesta FLT3-ITD
+ células. El MOLM-13 y MV4; 11 células se trataron con BPR1J-340 a diferentes concentraciones durante 24 horas y se analizaron para la inducción de la apoptosis mediante caspasa-3 activa y PARP escindida (polimerasa poli-ADP-ribosa) análisis. La capacidad de BPR1J-340 para inducir la apoptosis es evidente como se muestra en la Figura 3 donde se observó escisión significativa de la caspasa-3 (caspasa-3 activa) y PARP (activo PARP) en MOLM-13 y MV4; 11 células tratadas con BPR1J- 340 a 10 nM.
Western Blot reveló que BPR1J-340 fue capaz de inducir la apoptosis en impulsado por FLT3-ITD de FLT3 ITD
+ células de AML. MOLM-13 (A) y MV4; 11 células (B) fueron tratados con BPR1J-340 a las concentraciones indicadas durante 24 horas, y los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia de Western usando anticuerpos contra la caspasa-3 y PARP (poli polimerasa ADP-ribosa). (De longitud completa de la caspasa-3 (FL-caspasa-3), la escisión de la caspasa-3 (CL-caspasa-3), lleno de poli longitud (ADP-ribosa) polimerasa (FL-PARP), la escisión de PARP (CL-PARP) ).
SAHA en combinación con BPR1J-340 mejora la citotoxicidad frente a FLT3-ITD
+ células que expresan
Algunos inhibidores de la histona deacetilasa (HDACI) mejorará la actividad citotóxica de FLT3 inhibidor de FLT3-ITD
+ celular a través de la degradación de FLT3-ITD y STAT5 [24], [26], [36], [37]. Para determinar si SAHA, un HDACi, puede sinergizar con BPR1J-340 para mejorar la citotoxicidad en FLT3-ITD que expresan las células al interferir con el eje de FLT3-ITD y STAT5, se examinaron los efectos combinados de SAHA y BPR1J-340 sobre la citotoxicidad. La tasa de crecimiento de las células de MOLM-13 y MV4; 11 con SAHA y BPR1J-340 de tratamiento combinatorio se redujo en comparación con el tratamiento con un solo fármaco (figura 4A.). A continuación, se analizó el efecto del tratamiento SAHA sobre la apoptosis inducida por BPR1J-340 en las células FLT3-ITD-expresan. tratamiento único con SAHA (a 300 nM) durante 48 horas no aumentó la tasa de células apoptóticas en la población de control de 10%, mientras que SAHA /BPR1J-340 co-tratamiento resultó en una mayor inducción de la apoptosis (aumento de 20% en MOLM-13 y 12% en MV4; 11 células, respectivamente) en comparación con el tratamiento BPR1J-340 fármaco solo (Fig 4B y Fig 4C)... Estos datos sugirieron que SAHA potenciar la apoptosis inducida por BPR1J-340 en FLT3-ITD
+ células. Hemos dilucidado aún más los niveles de proteína de FLT3-ITD y STAT5 en este SAHA /BPR1J-340 mejorado co-tratamiento citotoxicidad. Se han tratado MOLM-13 celdas con SAHA, BPR1J-340, o su combinación durante 20 horas. En comparación con el tratamiento con un solo fármaco, la combinación de SAHA y BPR1J-340 disminuyó remarkedly los niveles de proteína de FLT3-ITD y STAT5 (Fig. 4D). Además, el tratamiento BPR1J-340 /SAHA reduce profundamente los niveles de proteína de Mcl-1 (célula de leucemia mieloide-1, un miembro anti-apoptóticos de la familia Bcl-2) en FLT3-ITD
+ células (Fig. 4D). Este resultados de la reducción de Mcl-1 pueden explicar el aumento de la citotoxicidad incluso la fosforilación STAT5 en Tyr694 se bloquea completamente por BPR1J-340 (Fig. 4D) MCL-1 juega un papel esencial en la resistencia a la quimioterapia en las células de AML [38]. Por lo tanto, la orientación MCL-1 utilizando SAHA /BPR1J-340 puede ser una estrategia prometedora para superar la resistencia a fármacos en la LMA FLT3-ITD-positivo. Nuestros resultados sugieren que la reducción en el total de los niveles de proteína de FLT3-ITD, STAT5 y MCL-1 mediante la adición SAHA proporciona un posible mecanismo para explicar la citotoxicidad mejorada con SAHA /BPR1J-340 coadministración.
MOLM-13 o MV4; 11 células se sembraron a una concentración inicial de 1 × 10
5 ml de células
-1 durante 24 horas y después se trató con BPR-1J340 ya sea solo o en combinación con SAHA en las concentraciones indicadas. Las células viables (A) se contaron después de la tinción con colorante azul de tripano al indicado punto de tiempo (B) A las 48 horas después del tratamiento, las células fueron teñidas con anexina V marcada con FITC y yoduro de propidio y porcentajes de células apoptóticas fueron analizadas por citometría de flujo. (C) El flujo representante histogramas de citometría de ensayos de anexina positiva células apoptóticas a las 48 horas de tratamiento de drogas (D) MOLM-13 células fueron tratadas con fármacos durante 20 horas, y luego seguido por el análisis de Western blot para evaluar los cambios en los niveles de proteína con el anticuerpos indicados. El análisis estadístico se realizó utilizando de Student
t-test
. * Indica diferencia significativa en comparación con el control del vehículo (* p & lt; 0,05, * * * p & lt; 0,01). Los datos mostrados son representativos de varios experimentos independientes.
Los parámetros farmacocinéticos de BPR1J-340
Para evaluar las propiedades farmacocinéticas de BPR1J-340, que mide la concentración plasmática de BPR1J-340 sobre un período de 24 horas después de una única administración intravenosa (Fig. 5 y en la Tabla 3). Después de una dosis intravenosa de 1,5 mg /kg se administró a ratas Sprague-Dawley, BPR1J-340 alcanzó una concentración plasmática máxima de 7,9 M (4,296 ng /ml) en 2 min después de la dosificación. La concentración plasmática excede 80 ng /ml durante 6 horas y se mantuvo estable en 9,9 ng /ml (C
24 horas, 18 nM) después de la administración 24 horas. Por lo tanto, la concentración plasmática de BPR1J-340 alcanza un nivel suficiente para inhibir la proliferación e inducir la apoptosis de FLT3-ITD
+ células sobre la base de los experimentos celulares. El aclaramiento total fue de 20,4 ± 5,2 ml /min /kg y el volumen de distribución en el estado estacionario (Vss) fue de 10,3 ± 2,5 l /kg para BPR1J-340 en ratas. El plasma vida media aparente fue de aproximadamente 8,8 horas.
Una sola dosis intravenosa en bolo (1,5 mg /kg) de BPR1J-340 se administró a ratas macho adultas Sprague-Dawley (n = 3). Los datos ilustran los valores medios (n = 3) ± S.D. de las concentraciones plasmáticas de BPR1J-340 en cada punto de tiempo
actividad supresora El crecimiento del tumor de BPR1J-340
FLT3-ITD
+ MV4;. 11 y MOLM- 13 xenoinjertos han sido ampliamente utilizados para evaluar la
in vivo
eficacia de los inhibidores de FLT3 contra AML [39], [40]. Nosotros y otros grupos hemos encontrado el MV4; modelo de xenoinjerto 11 es notablemente más sensible a los inhibidores de FLT3 [30], [31], [39], [41]. Para evaluar la capacidad de BPR1J-340 para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de AML, por lo tanto, seleccionamos el modelo de xenoinjerto de tumor MOLM-13. BPR1J-340 se administró por vía intravenosa (5 mg /kg una vez al día) en los días 1-5 de cada semana durante 3 semanas; para el final de este período, los tumores MOLM-13 habían alcanzado un volumen promedio de 200 mm
3. El tratamiento a través de este régimen dio lugar a la regresión completa del tumor en todos los animales por día 22; regresión completa (CR) se produjo en 4 de 6 animales tratados dentro de los 31 días de observación post-tratamiento (Fig. 6A). En este estudio de eficacia, los ratones con tumores de mayor tamaño (volumen tumoral medio de 630 mm
3, n = 3) se les dio una dosis intravenosa única de 20 mg /kg BPR1J-340 en los días 1-5 de cada semana durante 2 semanas, que dio lugar a la regresión completa del tumor y durable sin tumores palpables detectados durante el 48-día de seguimiento (Fig. 6B). No se observó pérdida de peso corporal o la mortalidad en animales tratados con cualquier dosis de BPR1J-340 (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que BPR1J-340 reduce eficazmente el tamaño del tumor a dosis intravenosas de 5 y 20 mg /kg /día; BPR1J-340 es bien tolerado en ratones a estas dosis eficaces.
BPR1J-340 (iv) es activa contra la leucemia aguda humana MOLM-13 tumores de crecimiento por vía subcutánea y puede reducir el tamaño de los tumores incluso después de los tumores se se dejaron crecer hasta un tamaño de & gt; 630 mm
3. (A) El efecto antitumoral in vivo de BPR1J-340 en el modelo de xenoinjerto de ratones desnudos MOLM-13. El crecimiento del xenoinjerto de tumor fue inhibida por BPR1J-340 [5 mg /kg, i.v.]; p & lt; 0,05 en comparación con el tratamiento con vehículo. (B) El crecimiento de un tumor por vía subcutánea MOLM-13 de gran tamaño (& gt; 630 mm
3) en ratones nude podría ser revertido significativamente por BPR1J-340 [20 mg /kg, iv]
Discusión
Dado que la expresión anormal de quinasa FLT3, incluyendo amplifica o aberrante activa FLT3, que se observa con frecuencia en las células blásticas de pacientes con LMA, FLT3 representa una atractiva diana terapéutica de elección para el desarrollo de fármacos en AML. Hasta la fecha, varios inhibidores potenciales de FLT3 se han desarrollado y se examinó en pacientes con AML, incluyendo lestaurtinib (CEP701) y midostaurina (PKC412), en ensayos clínicos de fase III y malato de sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar®), quizartinib (AC220), y crenolanib (CP-868,596), en ensayos de fase II. Sin embargo, la orientación quinasa FLT3 por mono-terapia con agentes experimentales actuales no produce beneficios terapéuticos en pacientes con LMA. Se indicó que la activación aberrante de FLT3 y /o FLT3 resistente a los medicamentos, incluyendo los mutantes preexistentes y adquiridas resistentes a los medicamentos, en raras ocasiones podría estar completamente inhibida por el tratamiento con un solo fármaco. Por lo tanto, hay una necesidad para la identificación de inhibidores más eficaces de FLT3 y el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos, incluidas las estrategias de combinación de fármacos que se dirigen no sólo FLT3 sino también moléculas relevantes para la vía de supervivencia FLT3 para anular resistencia a fármacos actual. En este estudio, hemos demostrado la eficacia del nuevo inhibidor de FLT3 BPR1J-340 en varios
e in vitro
in vivo
modelos de LMA y un conjunto de efectos sinérgicos con HDACi SAHA sobre la citotoxicidad de FL3 -ITD células que expresan en
in vitro
análisis.
Anteriormente, hemos identificado H
compuestos elaborados a base de pyrazolylamine -5 una serie de sulfonamida de 3-fenil-1
como potentes inhibidores de FLT3 como BPR1J-097 [31]. En la continuación de nuestros esfuerzos para desarrollar inhibidores potentes de FLT3, la intención de buscar otra serie de inhibidores que no sólo aumentó el
in vitro
efecto inhibidor del crecimiento de células de AML en sino que también prolonga la duración de la acción
In
vivo. A través del diseño racional, descubrimos BPR1J-340, que es una serie de urea de 3-fenil-1
H
-5-basados pyrazolylamine inhibidor de FLT3, con inhibe eficazmente la actividad de FLT3-ITD de FLT3-WT o
in vitro
y
in vivo
. Debido a múltiples vías de señalización influyen en el crecimiento y el potencial metastásico de las células tumorales, muchos de los inhibidores en el desarrollo clínico están diseñados como inhibidores de objetivos múltiples que bloquean un número limitado de quinasas oncogénicas. Por lo tanto, se llevó a cabo el perfilado quinasa selectividad de BPR1J-340 para identificar objetivos adicionales en un panel de 59 quinasas oncogénicas probadas. En otras ensayo bioquímico, BPR1J-340 demostró una potente inhibición (20-190 nM) en contra de las quinasas angiogénicos VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3, todos los cuales juegan un papel importante en el microentorno del tumor (Tabla 1). Además, BPR1J-340 inhibió la actividad TRKA con una CI
50 valor de 8 nM. Tomados en conjunto, BPRJ-340 se caracteriza como un inhibidor de objetivos múltiples selectivo con actividad de inhibición potente contra FLT3-WT, FLT3-D835Y, VEGFR2, VEGFR3, y TRKA. Este perfil de inhibición puede permitir BPRJ-340 para inhibir el crecimiento tumoral directamente mediante el bloqueo de la vía de señalización FLT3 aberrante e indirectamente por la orientación de la angiogénesis tumoral. BPR1J-340 también puede tener potencial clínico en el tumor impulsado por receptores TRKA expresadas anormalmente, que puede ocurrir en el cerebro, de próstata, de páncreas y cáncer de mama [42], [43], [44], [45].
BPR-1J340 inhibe la fosforilación de FLT3 celular y modula la vía de señalización de FLT3, que resultó en la inhibición de la proliferación y la inducción de apoptosis. BPR1J-340 demostró la inhibición del crecimiento potente, predominantemente en células FLT3-dependiente (MOLM-13 y MV4; 11) pero no en células FLT3-independiente. BPR1J-340 inhibe la proliferación de mutantes FLT3-ITD
+ células con un GC
50 de 2-6 nM inhibió la fosforilación y FLT3-ITD con una CI
50 de 10 nM; incluso las células transfectadas con el mutante de FLT3-D835Y también fueron inhibidos por BPR1J-340 con una CI
50 de aproximadamente 100 nM. De acuerdo con estos resultados, BPR1J-340 indujo eficazmente la apoptosis en FLT3-ITD
+ células.
inhibidores de HDAC pueden exhibir actividad de inhibición del crecimiento contra células de AML y mejorar significativamente la eficacia terapéutica de los inhibidores de FLT3 [24], [46]. Un estudio reciente informó que HDACi LBH589 más un inhibidor de FLT3 tratamiento de combinación (PPKC412, AC220) podría inducir sinérgicamente la apoptosis a través de FLT3-ITD y la degradación STAT5 [26]. También demostró que activa la caspasa-3 (CL-caspasa 3) contribuye a la degrdation de FLT3-ITD y STAT5 [26]. la degradación de FLT3-ITD También se informó de secundaria a la inducida por HDACi sobre regulación de UbcH8 y baja regulación de HSP90 [36], [47]. MCL-1, una proteína anti-apoptótica que promueve la supervivencia de FLT3-ITD
+ células a través de la activación de STAT5, es el regulado por la inhibición de FLT3 [25]. El HDACi SAHA también indujo la regulación por disminución de MCL-1 [48]. Además, la proteína de Mcl-1 es un sustrato de escisión directa de caspasa-3 activada [49]. Hemos observado que la cantidad de MCL-1 correlaciona con iuduction de caspasa-3 (Figura 4D).