Extracto
El selenio proteína de unión a 1 (SBP1, SELENBP1, HSP56) es una proteína asociada con selenio demostrado que en los niveles inferiores en los tumores, y sus niveles más bajos con frecuencia son predictivos de un resultado clínico pobres. Distinguir indolente de cáncer de próstata agresivo es un reto importante en el manejo de enfermedades. Las asociaciones entre los niveles SBP1, el grado del tumor, y recurrencia de la enfermedad después de la prostatectomía se investigaron mediante imágenes de inmunofluorescencia dúplex utilizando un microarray de tejido que contiene tejido de 202 pacientes con cáncer de próstata que experimentaron recurrencia bioquímica (PSA) después de la prostatectomía y 202 coinciden con los pacientes de control cuyo cáncer no se repita. Las muestras fueron emparejados por edad, origen étnico, el estadio patológico y el grado de Gleason, y las imágenes se cuantificaron utilizando el sistema de imágenes multiespectrales Vectra. Los marcadores fluorescentes fueron objeto de SBP1 y citoqueratinas 8/18 para restringir de puntuación para las células tumorales, y se realizó la cuantificación de células por celda de SBP1 en el núcleo y el citoplasma. SBP1 niveles nucleares y la relación entre núcleo y citoplasma se asociaron inversamente con el grado del tumor mediante análisis de regresión lineal. Siguiendo la clasificación de las muestras en cuartiles en función de los niveles SBP1 entre los controles, los tumores en el cuartil más bajo eran más de dos veces más probable que se repita en comparación con los de cualquier otra cuartil. expresión ectópica SBP1 inducible redujo la capacidad de las células tumorales humanas HCT-116 para crecer en agar blando, una medida de la transformación, sin afectar a la proliferación. Las células que expresan SBP1 también demostraron una inducción robusto en la fosforilación de la p53 supresor de tumor en la serina 15. Estos datos indican que la pérdida de SBP1 puede jugar un papel que contribuye independiente en la progresión del cáncer de próstata y sus niveles podría ser útil para distinguir indolente de enfermedad agresiva.
Visto: Ansong E, Q Ying, Ekoue DN, Deaton R, Hall AR, Kajdacsy-Balla A, et al. (2015) La evidencia de que el selenio proteína 1 de unión es un supresor tumoral en el cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (5): e0127295. doi: 10.1371 /journal.pone.0127295
Editor Académico: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: 8 Febrero 2015; Aceptado: April 13, 2015; Publicado: 18-may 2015
Derechos de Autor © 2015 Ansong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos nacionales de Salud (Grant#R01CA127943) a AMD y subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant#91229115 y 81272251) a WY
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el tipo más común de cáncer entre los hombres con estimaciones de más de 240.000 nuevos casos de cáncer y 33.000 muertes en los Estados Unidos solamente en 2011 [1]. La enfermedad se encuentra principalmente entre los hombres mayores con aproximadamente el 91% de los que tienen tumores diagnosticados confinadas al sitio primario o ganglios linfáticos locales [2]. La detección temprana del cáncer de próstata ha mejorado de manera espectacular, pero cada vez es más claro que el tratamiento se da a un gran segmento de los pacientes cuya enfermedad era indolente, por lo tanto, tiene poco impacto en la morbilidad o la mortalidad [3]. Dados los efectos secundarios negativos asociados con los tratamientos de cáncer de próstata como la prostatectomía radical, la terapia hormonal, la braquiterapia y otras formas de terapia de radiación, un reto importante en el tratamiento del cáncer de próstata es encontrar medios fiables para distinguir la enfermedad clínicamente significativa de lo que es indolente y mejor no está siendo tratado. Para contribuir a este esfuerzo, nos hemos centrado en el selenio Binding Protein 1 (SBP1, SELENBP1, HSP56), una proteína que contiene selenio que se expresa en una variedad de tipos de tejidos, incluyendo el cerebro, próstata, pulmón y el intestino. La forma de selenio en SBP1 es desconocida como es la naturaleza de su asociación: el selenio permanece unido a la proteína cuando se sometió a electroforesis en geles de acrilamida SDS pero se disocia en los extremos de pH [4]. La función de SBP1 también no se ha establecido, a pesar de que puede estar implicado en el transporte intra-golgi [5], se ha demostrado que regulan HIF-1α [6] y se asocia con dos isoformas diferentes de deubiquitinating proteína von Hippel-Lindau interactuar enzima 1, lo que indica SBP1 puede tener funciones en la degradación de proteínas [6,7].
niveles
bajo SBP1 están asociados con un mal resultado clínico en varios tipos de cáncer. Esto fue mostrado por primera vez para los adenocarcinomas de pulmón, donde los niveles bajos de SBP1 estaban fuertemente asociadas con la supervivencia de los pobres [8]. Posteriormente, los niveles bajos de SBP1 se muestran de manera similar a estar asociado con el mal pronóstico de cáncer de ovario [9], colon [10,11] y carcinoma hepatocelular más recientemente [12]. Se sabe poco sobre el papel de SBP1 en el cáncer de próstata, a pesar de que es altamente expresado en el tejido prostático humano normal [13]. Aquí, se presenta en la evaluación de si los niveles de SBP1 son indicativos de la probabilidad de recidiva bioquímica del cáncer de próstata utilizando microarrays de tejidos resultados, así como los estudios para empezar a comprender la función biológica de SBP1 en el cáncer.
Materiales y Métodos
la Oficina UIC para la Protección de sujetos de investigación ha determinado que este trabajo no cumple con la definición de la investigación con seres humanos. Todos los datos obtenidos a partir de tejido humano se analizó de forma anónima.
La inmunohistoquímica
microarrays de tejidos de cáncer de próstata de resultado se obtuvieron de la Cooperativa de cáncer de próstata de tejidos de recursos (CPCTR), un consorcio multi-institucional para el tejido prostatectomía bancaria , así como los datos del paciente en cuestión junto con datos demográficos, patología quirúrgica y el historial de seguimiento, bajo un conjunto de directrices uniformes. El CPCTR ha recogido más de 6.000 de cáncer de próstata y de control de muestras, la mayor colección de este tipo de tejido disponible en este país con los resultados clínicos y patológicos [14,15]. Las matrices utilizadas en este estudio incluyen núcleos de tejido de 0,6 mm de diámetro, en cuatro ejemplares, de 202 hombres ( "casos") que experimentaron recurrencia bioquímica (un único valor de PSA después de la cirugía por encima de 0,4 ng /ml o dos anuncios de servicio público consecutivos por encima de 0,2 ng /ml) después de prostatectomía y 202 controles emparejados no recurrentes sobre la edad de la cirugía (+/- 5 años), año de la cirugía, la raza, la puntuación de Gleason (primaria y secundaria) y el estadio patológico. Los tejidos en los portaobjetos se bloquearon con H
2O
2 Reactivo bloqueante (Abcam) durante 30 minutos, se trató con una solución de bloqueo de proteína durante 15 minutos a temperatura ambiente, se enjuagaron y se incubaron con anti-SBP-1 anticuerpo de ratón monoclonal (Cat#M061-3, MBL International.) y la CK8 /18 anticuerpo (Research Products americanos), tanto a un título de 1: 100 durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se enjuagaron en TBST durante 5 minutos, y después se trató con anti-ratón de Alexa Fluor 647 y anti-conejo Alexa Fluor 488 de polímero durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las láminas fueron lavadas en agua destilada; núcleos se counterstained con DAPI, deshidratados a través de un gradiente de alcohol y montado con micromount (Leica Microsystems). SBP1 y CK8 /18 se detectaron en los núcleos teñidos por la exploración multiespectral mediante el sistema de imagen cuantitativa Vectra (Perkin Elmer, Hopkinton, MA). Autofluorescencia se eliminó de las imágenes y del epitelio (tumor) áreas de cada núcleo se identificaron por CK8 /18 tinción utilizando inForm (Perkin Elmer) algoritmos de aprendizaje automático. La edición manual retira el epitelio benigno del análisis. DAPI tinción fue reconocido por el software como el núcleo de cada célula, y se obtuvo la señal citoplasmática mediante el muestreo de la zona peri-nuclear. Dentro de las áreas tumorales, exportamos tanto los datos nucleares y citoplásmicos del canal SBP1 en función de cada célula.
El análisis estadístico
Las intensidades fluorescentes de SBP1 nuclear y citoplasmática se evaluó la normalidad y log-transformado para el análisis estadístico. Los pacientes fueron agrupados en tres categorías en función de su grado de Gleason (Categoría 1 = Gleason ≤6, Categoría 2 = Gleason 7 (3 + 4) Categoría 3 = Gleason 7 (4 + 3) o ≥8). Núcleos con puntuaciones de Gleason 4 + 3 fueron asignados a la categoría 3, el grupo de Gleason más alto, debido a que las tasas de mortalidad de los pacientes con cáncer de próstata de Gleason 4 + 3 es tres veces mayor que 3 + 4 cánceres Stark 2009 [16]. La asociación entre los niveles SBP1 y categoría de Gleason se evaluó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcox. tejidos de los pacientes también fueron asignados a los cuartiles basados en la intensidad SBP1 entre los sujetos de control. Los modelos de regresión logística condicional se estimaron las odds ratios y los intervalos de confianza del 95% para el riesgo de recurrencia bioquímica para cada cuartil de SBP1. Los modelos condicionales de ajuste incorporados para las variables de correspondencia de casos y controles; modelos adicionales se ajustaron con PSA pre-quirúrgica como covariable, ya que PSA no es un factor a juego. Todos los datos obtenidos utilizando tejido humano se analizó de forma anónima.
Construcción de plásmidos
Una construcción de expresión inducible por doxiciclina SBP1 se generó mediante la inserción de la
SBP1
marco de lectura abierto que genera la amplificación por PCR utilizando un SBP1 generado previamente construir como la plantilla [17] y la ligadura en el pRetroX-Tight-Pur vector (Clontech, Mountain View, CA). Para la amplificación, un cebador directo (5'-ATAGCGGCCGCTACAGCATGGCTACGA AAT-3 ') se utilizaron (y el cebador 5'-ACGAATTCGCTCAAATCCAGATGTCAGAGC-3) invertir', el producto de amplificación se digirió con
NotI
y
EcoRI
y direccionalmente se ligó en el vector. El sistema de expresión inducible incluye el plásmido pRetroX-Tight-Pur-Teton-avanzada que contiene el gen transactivador Tet-On. El gen Tet-On para una proteína que se une a la región promotora del plásmido pRetroX-Tight-Pur e induce la transcripción del gen aguas abajo del promotor en respuesta a la doxiciclina. El gen SBP1 se insertó aguas abajo de la región promotora sensible doxiciclina en el plásmido pRetroX-Tight-Pur produciendo el pRetroX-Tight-Pur-SBP1.
Cell Cultura y
La célula de carcinoma de colon humano HCT116 se verificó la línea (Genetica ADN Lavoratories, Burlington, Carolina del Norte) y se mantiene en un medio 5a de McCoy (Mediatech, Manassas, VA), y la línea de empaquetamiento retroviral GP2-293 se mantuvo en medio DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA). Todos los medios se complementó con 10% de SFB, 100 U /ml de penicilina, y 100 ug /ml de estreptomicina y se incubó a 37 ° C con 5% de CO
2. La concentración de selenio en el suero utilizado se determinó que era 152 nM por horno de grafito espectrometría de absorción atómica realizado en la Universidad de Texas A & amp; M Laboratorio de Diagnóstico Veterinario en College Station, Texas. Tanto el transactivador Tet-On y las construcciones de expresión SBP1 fueron empaquetados en partículas retrovirales mediante cotransfección de cada plásmido con la expresión de la envuelta retroviral p-VSV-G construcción en la línea celular de empaquetamiento GP2-293, y se utiliza para infectar las células HCT116. Las células infectadas se seleccionaron por clonación en 400 ug /ml de G418 (Sigma) y 1 ug /ml de puromicina (Sigma), se expandieron, y se cribaron para la expresión inducible SBP1 por Western Blot después del tratamiento con 1.0ug /ml de doxiciclina durante 48 horas.
Western Blot
Las células tratadas fueron cosechadas por lisis en 1x Tampón de lisis celular (Señalización celular, Danvers, MA) que contiene 1 mM PMSF (Señalización celular). Los lisados se hirvieron en NuPAGE LDS tampón de muestra (Life Technologies) y 10x agente reductor (Life Technologies) durante 5 minutos y se aplicaron a un gradiente de 4-12% Bis-Tris gel de poliacrilamida desnaturalizante (Life Technologies). Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana Immobilon-FL (Millipore) por medio de electrotransferencia. Se utilizaron anticuerpos contra las siguientes proteínas: SBP1 y GPx-1 (ratón, MBL International, Woburn, MA), p-P53, (conejo, Señalización Celular), P53 (conejo, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), y β -actina (conejo, Abcam, Cambridge, MA).
proliferación celular y crecimiento en medios semisólidos
la proliferación se evaluó mediante la FluoReporter azul fluorométrico de ADN de doble cadena kit de cuantificación (Invitrogen), que se basa en el uso de un Hoescht 33258 tinción fluorescente para medir la cantidad de ADN de doble hebra presente en cada pocillo de una placa de 96 pocillos como un indicador de la cantidad de células vivas presentes en un punto de tiempo dado. 5x10
2 Las células se sembraron en cada pocillo de una placa de color negro, fondo claro de 96 pocillos y se trataron como se ha indicado (48, 96 y 144 horas). El medio de cultivo se eliminó en los puntos de tiempo seleccionados, y las placas se almacenaron inmediatamente a -80 ° C hasta que se completaron todos los puntos de tiempo. Las placas se descongelaron a temperatura ambiente y las células se lisaron usando agua destilada para extraer el ADN celular. Hoechst 33258 tinte se añadió a cada pocillo para teñir el ADN, y la fluorescencia se cuantificó utilizando filtros de excitación y emisión a 360 nm y 460 nm respectivamente. Con el fin de determinar la capacidad de SBP1 para influir en el crecimiento en medios semi-sólido, las células inducidas a expresar SBP1 así como células SBP1 nulos fueron tratados con doxiciclina, mezclado con un medio que contiene 0,4% de agarosa, y cada grupo se sembraron por triplicado en placas de 6 pocillos que contenían 0,6% de agarosa en los medios de comunicación. Cada pocillo contenía 5x10
4 células, y las colonias más grandes de 0,5 mm se enumeraron en el día 15.
Resultados
imágenes fluorescentes de SBP1 en el cáncer de próstata humano indica una fuerte localización nuclear y intraglandular esporádica
expresión
Después fueron excluidos de mala calidad y benigna de sólo núcleos, la cohorte de análisis incluyó tejido de 168 pares de casos y controles. Ejemplos de núcleos de escaneados de los microarrays se presentan en la figura 1. Los niveles muy variables SBP1 nucleares se observaron a menudo entre las células epiteliales de la misma glándula, con las células adyacentes a menudo muestran variando la intensidad de tinción entre las células que eran SBP1-positivas (Fig 1A). Además, el tejido de próstata con también variado con respecto a la tinción citoplasmática y nuclear, como se ejemplifica en la figura 1B & amp; 1C.
Un ejemplo de la imagen de un núcleo obtenido a partir de los resultados de microarrays de tejidos CPCTR teñidas con anti-anticuerpos SBP1 (rojo), seguido de Alexa488 cabra anti-conejo y cabra Alexa647 anti-ratón, respectivamente. Los núcleos se counterstained con DAPI (azul). A es un ejemplo de SBP1 localizada en el núcleo, B muestra SBP1 citoplasmática, y C es un ejemplo de expresión muy bajo SBP1 en el tejido prostático.
La nuclear SBP1 relación núcleo: citoplasma se correlaciona inversamente con el cáncer de próstata Gleason
puntuación
con el fin de evaluar la asociación entre los niveles de SBP1 y puntuación de Gleason, los pacientes se agruparon en tres categorías en función de su grado de Gleason (Categoría 1 = Gleason ≤6, Categoría 2 = Gleason 7 (3 + 4) Categoría 3 = Gleason 7 (4 + 3) o ≥8). Análisis de los niveles de SBP1 en tejidos prostáticos indicó que la media de la señal SBP1 nuclear en cada célula fue significativamente menor en la categoría 3 que en la categoría 2 (Fig 2). Además, la nuclear: citoplásmica proporción de SBP1 fue significativamente menor en la categoría 3 frente a la categoría 1 (figura 3). Citoplasmática y los niveles totales de SBP1 celular no se asociaron significativamente con la puntuación de Gleason, ni hubo una diferencia significativa entre las categorías 1 y 3.
Los pacientes en los microarrays de tejidos resultados cáncer de próstata se distribuyeron en tres categorías (Gleason) Categoría basadas en la puntuación de Gleason (a). Significa SBP1 tejido cuantificada se clasificó para todos los pacientes y se le asigna una puntuación desde 1-368 basado en los niveles relativos SBP1 donde el paciente con el tejido más bajo SBP1 recibió una puntuación de 1, y el paciente con los niveles más altos SBP1 recibieron una puntuación de 368. diagramas de caja y bigotes indican el rango de las puntuaciones de los pacientes en cada categoría (líneas verticales) y el rango del primer y tercer cuartil de cada categoría (cajas). La línea horizontal en el interior de la caja indica la mediana. La asociación entre SBP1 y Gleason Categoría se determinó utilizando SBP1 en el núcleo (B), el citoplasma (C) y el total de células (D).
Los pacientes en el microarray resultado del cáncer de próstata se distribuyeron en tres categorías (Gleason Categoría) basado en la puntuación de Gleason (a). La media de SBP1 tejido cuantificada se clasificó para todos los pacientes y se le asigna una puntuación desde 1-368 basado en los niveles relativos SBP1 donde el paciente con el tejido nuclear más bajo: citoplasma de SBP1 recibió una puntuación de 1, y el paciente con la proporción más alta recibió una puntuación de 368. los diagramas de caja y bigotes indican el rango de las puntuaciones de los pacientes en cada categoría (líneas verticales) y el rango del primer y tercer cuartil de cada categoría (cajas). La línea horizontal en el interior de la caja indica la mediana.
pacientes con cáncer de próstata en el cuartil más bajo de expresión SBP1 son significativamente más probable que se repita después de la prostatectomía radical
Para determinar si había una asociación entre SBP1 y la recurrencia bioquímica, niveles SBP1 en el núcleo, citoplasma, y el total de células se analizaron mediante un primer ensayo t por parejas. No se observaron diferencias significativas entre los casos recurrentes y los controles no presentaron recidiva. Para examinar la posibilidad de una asociación no lineal entre la expresión SBP1 y la recurrencia, las muestras se distribuyen alternativamente en cuartiles basados en los niveles SBP1 tejido entre los controles. Con este enfoque, el análisis de regresión logística de las probabilidades intercuartil de recurrencia del cáncer de próstata indica que los pacientes en el cuartil más bajo de los niveles de SBP1 nucleares fueron significativamente más probable que se repita que los de cualquier otro cuartil (Tabla 1). Todas las estimaciones se ajustaron por PSA, grado de Gleason, estadio, raza, año de la cirugía y la edad al momento del diagnóstico.
Desde muy variable ubicación SBP1 intracelular se observó con frecuencia dentro de los núcleos individuales, se evaluó si la proporción entre nuclear para SBP1 citoplasmática estaba relacionada con la probabilidad de recurrencia bioquímica. Los pacientes fueron asignados a los cuartiles basándose en el nucleares SBP1 relación núcleo: citoplasma, y la razón de momios e intervalos de confianza del 95% para la asociación entre la recurrencia del cáncer de próstata y se obtuvieron cada cuartil. No hubo evidencia de una asociación significativa entre la relación entre núcleo al citoplasma de SBP1 y la recurrencia del cáncer de próstata (Tabla 2). Un análisis de seguimiento del porcentaje de células positivas SBP1 en un núcleo dado reveló una likelyhood reducida de recurrencia entre los pacientes en los cuartiles más altos en comparación con el cuartil más bajo. Porcentaje total de células positividad no se asoció significativamente con la recurrencia (Tabla S1). El umbral de positividad fue definida por la intensidad visiblemente detectable.
La expresión ectópica de SBP1 no afecta a la proliferación de las células HCT116 pero inhibe el crecimiento de anclaje recurrencia
independiente
El cáncer de próstata después de la prostatectomía radical se produce debido primaria tumores ya han hecho metástasis antes de la cirugía. el crecimiento de anclaje independiente ha sido validado como un sustituto fenotipo metastásico de potenciales usando firmas de expresión génica [18]. Con el fin de investigar el impacto de SBP1 en el crecimiento de anclaje independiente, un constructo de expresión inducible por doxiciclina SBP1 se introdujo en células HCT116. Estas células fueron escogidos debido a su falta de expresión SBP1 detectable, la presencia de un p53 de tipo salvaje (véase más adelante) y debido a que se han utilizado previamente en el estudio de la función SBP1 [19]. S1A figura muestra la inducción robusta de SBP1 en las células HCT116 TetSBP1
.
La proliferación de las células HCT116 no se vio afectada significativamente por la expresión SBP1 (figura 4). Se utilizaron células HCT116 que sólo contienen el plásmido pRetroX-Tight-Pur-SBP1 sin el plásmido téton transactivador para controlar los efectos de doxiciclina sobre la proliferación y se cultivaron simultáneamente con las células TetSBP1, utilizando la diferencia de crecimiento entre las células de control con y sin doxiciclina en cada vez para ajustar los datos de proliferación TetSBP1. Con el fin de hacer esto, el fluorescente informó crecimiento de células HCT116 tratados doxiciclina-TetSBP1 (unidades fluorescentes, FU) se dividió por la diferencia en FU visto entre doxiciclina tratadas y las células de control no tratadas. Para determinar la capacidad de SBP1 de impactar en el crecimiento semi-sólido medios de comunicación, se suspendieron las células HCT116 que expresan-TetSBP1 SBP1 (+ Dox), así como células SBP1 nulos (-DOX) en 0,4% de agarosa, se incuban, y las colonias enumeran 15 días después de la siembra. SBP1 redujo significativamente la capacidad de las células de crecer en medios semi-sólido (Fig 5)
células HCT116-TetSBP1 con (+ Dox) y sin (-DOX) SBP1 se cultivaron durante 6 días en un 96 así plato. Las células fueron tratadas con 1 ug /ml de doxiciclina 48 horas antes del punto de tiempo 0 horas. Quinientos células se sembraron por triplicado 24 horas antes del punto de tiempo 0 horas. ADN de doble cadena marcado con fluorescencia de cada pocillo de una placa de 96 pocillos se cuantificó a las cuatro puntos- tiempo 0, 48, 96, y 144 horas, y las barras de error representan las desviaciones estándar en cada punto de tiempo.
La capacidad de HCT116 células con y sin SBP1 de formar colonias en agar blando se midió. Las células inducidas a expresar SBP1 así como células SBP1 nulos se mezclaron con medio que contiene 0,4% de agarosa, y cada grupo se sembraron por triplicado en placas de 6 pocillos recubiertas con 0,6% de agarosa en los medios de comunicación. Cada 5x10 bien contenida
4 células, y las colonias más grandes de 0,5 mm se contaron en el día 15 del crecimiento (A). Las barras de error representan S. D. (* P & lt; 0,05 n = 3) guía empresas
SBP1 no cambia la expresión de glutatión peroxidasas-1 & amp.; 4, tiorredoxina reductasa-1 o NF-ĸB
Una posible explicación para el efecto supresor de SBP1 en el crecimiento independiente del anclaje es que afecta a los niveles de selenoproteins que han sido implicados en la señalización oncogénica a través de la alteración de los niveles de reactivo Las especies de oxígeno (ROS). Para investigar esta posibilidad, los lisados de las células HCT116 TetSBP1 con y sin inducción SBP1 se inmunotransfirieron usando anticuerpos contra TrxRD1, GPx-1, y GPx-4. Estos tres selenoproteins son antioxidantes implicados en la etiología de varios tipos de cáncer [20]. SBP1 no cambió los niveles de cualquiera de las selenoproteínas examinados (S1B y S1C la figura), ni afectó los niveles de ROS el factor de transcripción NF-sensibles ĸB (S1 A la figura).
SBP1 sensibiliza a las células a 5 fluorouracilo
Otra posible explicación para la asociación entre el cáncer de próstata agresivo y baja SBP1 nuclear es que las células tumorales, que normalmente experimentan inestabilidad cromosómica alta, tienen ventaja en la supervivencia cuando hay baja SBP1 nuclear. Con el fin de investigar si SBP1 afectada la respuesta celular al daño del ADN, las células HCT116 se trataron con 5-fluorouracilo (5-FU), que bloquea la síntesis de timidina y conduce al daño del ADN [21,22]. SBP1 se indujo en las células HCT116 TetSBP1 con doxiciclina y se cultivó en placas de 96 pocillos durante 6 días y se tomaron muestras a las 48 horas los puntos de tiempo al mismo tiempo que las células de control SBP1 nulos a la misma concentración 5 uM de 5-FU. Las células que expresan SBP1 eran más sensibles a 5-FU exposición (Fig 6)
.
El crecimiento de las células HCT116-TetSBP1 se midió después de un tratamiento de 6 días con 5 uM 5-FU. ADN de doble hebra se midió como un indicador de crecimiento celular a cuatro veces puntos- 0, 48, 96, y 144 horas, y las barras de error representan la desviación estándar en cada punto de tiempo (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01). Quinientos células se sembraron por triplicado 24 horas antes del punto de tiempo 0 horas, y fluorescentemente etiquetados dsDNA de cada pocillo de una placa de 96 pocillos se cuantificó después se lisaron las células, mientras que todavía unido a la placa.
SBP1 induce la fosforilación de p53 en la serina 15
el trabajo previo ha descrito la implicación de p53 en la respuesta celular a 5-FU [23,24]. Dada la capacidad de SBP1 para sensibilizar a las células a 5-FU, se investigó si SBP1 afecta a la fosforilación de la serina 15 (Ser15) en p53, que es una modificación post-translacional requerido para activar la respuesta al daño de ADN dependiente de p53 [25]. transferencia de Western de extractos preparados a partir de células HCT116 no detectó fosforilada p53-Ser15 (Fig 7A). Sin embargo, la inducción de SBP1 resultó en robusto fosforilación de p53 en Ser15 (Fig 7A). Es evidente que la estimulación de la fosforilación de p53 en Ser15 coincidió con una disminución de p53 total (Fig 7B).
extractos totales de células de doxiciclina tratadas o células HCT116-TetSBP1 no tratados se analizaron mediante inmunotransferencia de cambios en Ser15 fosforilada en p53 (a) y los niveles de p53 total de (B) en respuesta a la inducción de SBP1 usando SBP1 anti-humano, fosfo p53-Ser15, p53, y los anticuerpos beta-actina. β-actina se utilizó como control endógeno.
Discusión
La asociación entre el cáncer de próstata y la agresividad SBP1 fue investigada, ya que, los estudios anteriores mostraron niveles más bajos SBP1 se asociaron con un mal resultado clínico de los pacientes con varios otros tipos de cáncer (revisado en [26]). La asociación entre los niveles SBP1 y varias características clínicas de los tumores se examinó utilizando microarrays de tejidos de cáncer de próstata diseñados para identificar las variables que influyen en la evolución del paciente. Cuando se investigó una posible asociación entre los niveles de SBP1 y puntuación de Gleason, los niveles totales de SBP1 no se asociaron con la puntuación de Gleason, coherente con nuestra anterior examen transferencia Western de las 24 muestras de prostatectomía muestras [27]. Sin embargo, en los datos presentes en este manuscrito, hubo una diferencia estadísticamente significativa menor nuclear SBP1: citoplasma en los tejidos clasificados como de cáncer de próstata de grado superior (Categoría 3) en comparación con los tejidos clasificados como de grado inferior (categoría 1). En el posterior análisis de la recurrencia bioquímica, la localización celular de SBP1 también se utilizó en el análisis de la matriz de tejido, lo que indica que los pacientes en el cuartil más bajo de expresión SBP1 nuclear fueron significativamente más probable que se repita que los de cualquier otra cuartil. La importancia mecanicista de la compartimentación celular de SBP1 sigue siendo desconocida, y conocido ninguna actividad enzimática se ha atribuido a esta proteína. Es posible, sin embargo, que los cambios en SBP1 de reportaron la interacción y la posible modulación afecta en proteínas no nucleares tales como GPX-1 y VDU1, contribuyen a la función biológica de SBP1 (s).
Con el fin de investigar los mecanismos moleculares por el cual SBP1 podría afectar a la agresividad del cáncer, que ectópica expresó en células cultivadas que no expresan ninguna SBP1 detectable. La inducción de SBP1 en estas células reduce su capacidad para crecer en medios semi-sólidos mientras no afectar las propiedades proliferativas de las células. Mientras SBP1 ya ha sido demostrado para suprimir el crecimiento de anclaje independiente en ambas líneas celulares derivadas de tumores de próstata humano LNCaP y PC3, SBP1 inhibió la proliferación únicamente de PC3 y no las células LNCaP [6]. Como parte de nuestros esfuerzos para obtener un entendimiento del mecanismo por el cual SBP1 hizo que los fenotipos observados, una inducción robusto en la fosforilación de p53 en Ser15 se observó (Figura 5). Tan recientemente expandido a, la fosforilación de p53 en Ser15 puede afectar una amplia serie de funciones de p53 mediada, incluyendo la detención del ciclo celular, así como la respuesta al daño del ADN y otros tipos de estrés [28]. Por tanto, es concebible que al menos algunas de las consecuencias de la pérdida de expresión SBP1 que a menudo acompaña a la progresión maligna podría estar mediado a través de una reducción de la fosforilación de p53 en este sitio, y los diferentes efectos de SBP1 sobre HCT116, PC3 y LNCaP puede ser debido a la diferente estado de p53 en las células; HCT116 y LNCaP tienen p53 funcional, mientras PC3 no [29,30]. Del mismo modo, los procesos dependientes de p53 pueden estar implicados en el aumento de la sensibilidad a 5-FU observó cuando las células fueron inducidas para expresar HCT116 SBP1. El uso de esferoides multicelulares para estudiar 5-FU resistencia en células de cáncer colorrectal, Lee et al. informado de que SBP1 se expresó diferencialmente en 5-FU células resistentes y estos autores sugirieron que SBP1 puede ser un nuevo biomarcador de 5-FU quimiorresistencia [31]. Los datos presentados en este documento, junto con estudios previos que han informado sobre los efectos de SBP1 en células cultivadas o la pérdida frecuente de SBP1 en los cánceres humanos, apoyar colectivamente la noción de un papel que contribuye a la pérdida de SBP1 en la progresión del cáncer.
la ingesta dietética de selenio se ha asociado con un menor riesgo de cáncer de próstata en los estudios epidemiológicos en humanos [32], aunque los resultados del estudio SELECT suplementos de selenio establecieron que el suministro de dosis bajas de selenio para los hombres mayores tienen un riesgo promedio en América del Norte no redujo la incidencia de cáncer de próstata [33]. El mecanismo por el cual la ingesta dietética de selenio podría prevenir posiblemente cáncer de próstata sigue siendo desconocida, pero puede implicar el selenio de efectos en las proteínas que contienen selenio, varios de los cuales han sido implicados en el riesgo de cáncer y otras enfermedades debido a la asociación de los polimorfismos genéticos específicos con el riesgo de la enfermedad [34,35]. Los efectos del consumo de selenio en SBP1 o cualquiera de las selenoproteínas que contiene selenocisteína-siguen siendo desconocidos. Sin embargo, la información sobre la probabilidad de los pacientes con cáncer de próstata recurrente después de la prostatectomía es de importancia crítica en el esfuerzo para evitar el tratamiento innecesario para los hombres con tumores indolentes. Los estudios futuros deben considerar la utilidad pronóstica de examinar los niveles SBP1 en el tejido prostático e investigar más a fondo si la pérdida SBP1 está contribuyendo a la progresión de la enfermedad.
Apoyo a la Información
S1 Fig. SBP1 expresión no cambia los niveles de GPx-1, GPx-4, NF-ĸB o TrxRD1.
extractos totales de células de doxiciclina o tratadas se analizaron las células no tratadas HCT116-TetSBP1 mediante inmunoblot para los cambios en NF-ĸB ( a) y los niveles de TrxRD1 (B) en respuesta a la doxiciclina inducción dependiente de SBP1. SBP1 Anti-humano, TrxRD1, NF-ĸB y anticuerpos ß-actina se utilizaron para detectar los niveles de proteína. ß-actina se utilizó como control endógeno. Las células de control sólo contienen el plásmido pRetroX-SBP1 sin transactivador
doi:. 10.1371 /journal.pone.0127295.s001 gratis (TIF)
S1 tabla. pacientes con cáncer de próstata con mayor porcentaje de tinción positiva nuclear y citoplasmática SBP1 en sus tumores de próstata fueron menos probable que se repita.
relaciones ratio (OR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) para la recurrencia del cáncer de próstata en un cuartil de porcentaje de positiva nuclear y la tinción citoplásmica SBP1. Positividad fue definida por la intensidad visiblemente detectable, y se cuantifica utilizando las mediciones obtenidas por el sistema de imagen cuantitativa VECTRA. Todo o estimaciones se ajustan para PSA, grado de Gleason, el estadio del tumor y la edad del paciente al momento del diagnóstico
doi:. 10.1371 /journal.pone.0127295.s002 gratis (DOCX)