Extracto
Antecedentes
Hemos observado la expresión anormal en HOXB7 esofágico El carcinoma de células escamosas (CECA) anteriormente. Este estudio fue evaluar la importancia pronóstica de HOXB7 y revelar el mecanismo potencial.
Métodos
La inmunohistoquímica se utilizó para confirmar la expresión anormal de HOXB7 en CECA. La importancia pronóstica de la expresión HOXB7 se analizó en dos cohortes independientes. RNAi se utilizó para establecer dos cepas de células HOXB7-desmontables estables. ensayo CCK8, ensayo de curva de crecimiento de las células, el ensayo de formación de colonias, análisis de ciclo de flujo y ensayo de tumorigenicidad en ratones desnudos fueron empleados para investigar el efecto de HOXB7 sobre la proliferación in vitro y in vivo.
Resultados
la inmunohistoquímica confirmó la expresión anormal de HOXB7 en CECA en comparación con la mucosa paracancerous (18/23 versus 9/23, p = 0,039). HOXB7 expresión se correlacionó positivamente con el estadio T, metástasis en los ganglios linfáticos y el estadio TNM. La mediana de supervivencia de los pacientes con una expresión de alto HOXB7 fue significativamente más corta que con una baja expresión (45 meses frente a 137 meses, p = 0,007 para la Cohorte 1; 19 meses frente a 34 meses, p = 0,001 para la cohorte 2). análisis de supervivencia multivariante mostró que la expresión HOXB7 fue otro factor pronóstico independiente (HR [IC del 95%] = 0,573 [0,341-0,963], p = 0,036 para la Cohorte 1; HR [IC del 95%] = 0,543 [0,350-0,844], p = 0,024 para la cohorte 2). Los experimentos in vitro e in vivo mostraron que después de desmontables de HOXB7, la tasa de proliferación se redujo, tasa de crecimiento descendió, la capacidad de colonias de formación reducida, se produjo detención de la fase G1 y la tumorigenicidad reduce notablemente.
Conclusiones
HOXB7 podría promover la proliferación de células cancerosas y podría ser un factor pronóstico independiente para los pacientes con CECA
Visto:. Li H, Shen LY, Yan WP, Dong B, Kang XZ, Dai L, et al. (2015) la expresión desregulada HOXB7 predice mal pronóstico de los pacientes con carcinoma de células escamosas de esófago y regula la proliferación de células cancerosas in vitro e in vivo. PLoS ONE 10 (6): e0130551. doi: 10.1371 /journal.pone.0130551
Editor Académico: Nikki Pui-Yue Lee, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 27 de enero de 2015; Aceptado: 21 de mayo de 2015; Publicado: 15 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:.. los autores no recibieron ninguna financiación específica para este trabajo
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en la actualidad, el cáncer de esófago es una de las neoplasias más comunes en todo el mundo, y el carcinoma de células escamosas de esófago (CECA) es el tipo histológico más frecuente en la población china [1, 2]. Aunque el tratamiento multidisciplinario de cirugía dominada ha avanzado significativamente en las últimas dos décadas en relación con el diagnóstico y tratamiento de la CECA, y el resultado del tratamiento se ha mejorado, la supervivencia a largo plazo sigue siendo insatisfactoria [3]. Una de las medidas eficaces para mejorar la supervivencia global consiste en la identificación de biomarcadores clínicos con significado pronóstico para guiar el tratamiento. genes HOX son un grupo de genes que regulan el desarrollo embrionario. La familia, con 39 miembros, se divide en cuatro grupos, a saber, A, B, C, y D, que están ubicados en cuatro cromosomas diferentes [4, 5]. HOX genes codifican una familia de factores de transcripción, y su expresión anormal se asocia a menudo con enfermedades, atrayendo así una atención creciente en la investigación del cáncer [6, 7]. Estudios previos en la biología del desarrollo han mostrado que HOXB7 normalmente se expresa en el desarrollo de esófago humano [8]. Entre los 39 genes HOX examinados en nuestro estudio anterior, ocho se expresaron sólo en el tejido maligno de pacientes CECA, pero no en los tejidos normales adyacentes apareados, incluyendo HOXB7 con la tasa de expresión positiva 58,3% [9]. Por lo tanto, la hipótesis de que HOXB7 jugó un papel específico en la aparición y desarrollo de la CECA y podría ser un marcador molecular útil para predecir el pronóstico e incluso guiar el tratamiento. A lo mejor de nuestro conocimiento, hay pocos estudios sobre la expresión HOXB7 y el pronóstico en CECA que implican una muestra de gran tamaño, y no in vivo e in vitro de discutir el mecanismo subyacente. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo investigar la importancia pronóstica y el mecanismo funcional de HOXB7 en los tejidos CECA.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todas las investigaciones con seres humanos fue aprobado por los Comités de Ética del hospital de cáncer de Beijing, china, y realizadas de conformidad con la Declaración de Helsinki. consentimientos informados escritos han sido obtenidos a partir de todos los participantes.
Pacientes y muestras de tejidos
Para validar la alta expresión de HOXB7 en los tejidos CECA reportados en nuestros estudios anteriores [9], 23 pacientes fueron reclutados CECA y el tumor y embebido en parafina de tejidos cancerosos emparejado secciones fueron recuperados
Para investigar la asociación de la expresión de proteínas HOXB7 con el pronóstico de los pacientes con CECA, se incluyeron dos cohortes de estudio independiente:.
la cohorte I.
Nuestro grupo de investigación estableció una base de datos prospectiva para el cáncer de esófago desde enero de 2000 y de 1249 casos con esofagectomía realizado por un equipo de un solo cirujano (Dr. Chen KN) han sido recogidos de forma consecutiva. En este estudio, los criterios de inclusión fueron los siguientes: los pacientes que fueron diagnosticados patológicamente con CECA y fueron sometidos a esofagectomía radical sin terapia de inducción antes de la cirugía de enero entre 2000 y 2011 Dic Un total de 177 casos cumplieron los criterios (Tabla 1). La 7ª edición del sistema de estadificación TNM (AJCC y la UICC, 2009) se utilizó para clasificar a los pacientes.
La cohorte II.
La cohorte II incluyó a 103 pacientes que fueron diagnosticados con patológicamente CECA y se sometió a esofagectomía radical por múltiples cirujanos sin terapia de inducción antes de nuestra base de datos establecida prospectivo 1996-2002 (Tabla 1). Los datos se recogieron de forma retrospectiva de acuerdo a los registros médicos de los pacientes sin datos prospectivos. Se utilizó el sistema de estadificación TNM de la UICC, 1987 a evaluar a los pacientes.
métodos de seguimiento
Los datos de seguimiento de cohortes que se recogió de nuestra base de datos prospectiva. Después de la cirugía, pacientes ambulatorios visitas de seguimiento se llevaron a cabo una vez cada 3 meses durante los primeros 2 años, una vez cada 6 meses del 2 al 5 años, y una vez en todos los años después de 5 años. La supervivencia global se definió como el tiempo desde la fecha de la cirugía a la muerte o el último seguimiento. El último punto de control de seguimiento fue de agosto de 2013. La tasa global de seguimiento de nuestra base de datos fue del 96,1%: 80,2% de consultas ambulatorias y el 15,9% teléfono o carta de seguimiento. El teléfono o carta de seguimiento involucrado principalmente aquellos pacientes sin visitar a la clínica para pacientes externos en la fecha prevista. Para pacientes ambulatorios seguimientos involucrados registro de los síntomas y múltiples exámenes incluyendo computarizada, imagen del tracto gastrointestinal superior, ecografía abdominal y supraclavicular bilateral y gastroscopia, si es necesario. Después de 2010, algunos pacientes se sometieron a exámenes de tomografía por emisión de positrones CT (PET-TC).
Los datos de seguimiento de la cohorte 2 se obtuvieron de la revisión de los registros médicos del paciente. La última vez que el seguimiento fue de febrero de 2008 y la tasa de seguimiento fue de 80%.
Los cultivos de células
Las líneas celulares humanas CECA EC109 y KYSE150 se obtuvieron de Banco de Células de la Academia China de Ciencias médicas, Beijing, china. EC109 se cultivó en medio DMEM (Gibco) suplementado con 10% FBS (Gbico) a 37 ° C en una atmósfera de aire con CO2 al 5%. KYSE150 se cultivó en medio RPMI 1640 (Gibco) con 10% de SFB (Gbico) a 37 ° C en una atmósfera de aire con CO2 al 5%.
vectores La construcción y la infección lentiviral
Para la regulación negativa de HOXB7, cuatro de corto horquilla (shRNA) secuencias (GCCGAGTTCCTTCAACATGCA/CGAGAGTAACTTCCGGATCTA/GCCTCACGGAAAGACAGATCA/CGAGAGTAACTTCCGGATCTA/GCCTCACGGAAAGACAGATCA/ACCTGTTCTGTAGCTTTCTGG) fueron clonados en H1-pGLV-GFP-puro. secuencia revueltos (ACTACCGTTGTTATAGGTG) se utilizaron como controles. construcción de vector lentiviral y embalaje han sido realizadas por GenePharma Company (Shanghai, China). Las células se infectaron con 50 ul filtrada sobrenadante lentivirus (1 × 10
9 TU /ml) en cada pocillo de placa de 24 pocillos con la presencia de 8 mg /ml de polibreno (Millipore). cepas de células transfectadas estables que expresan shHOXB7 se seleccionaron con 2 ug /ml puromicina.
extracción de ARN, RT-PCR y PCR en tiempo real
ARN total de las células se extrajo por TRIzol (Invitrogen, Carlsbad , California). RNA se hizo una transcripción inversa a ADNc mediante RT-PCR (Fermentas Life Science). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó utilizando SYBR Green PCR en tiempo real Maser Mix (Applied Biosystems) para detectar los niveles de expresión de mRNA de los genes diana. GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato) se utilizó como control endógeno. La secuencia de los cebadores utilizados son los siguientes: para HOXB7, hacia adelante 5'-TATGGGCTCGAGCCGAGTT- 3 ', 5'-inversa GGCCTCGTTTGCGGTCAGT -3'; para GAPDH, adelante 5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC 3 ', 5'-revertir GGCATGGACTGTGGTCATGAG -3'. Todos los ensayos se realizaron por triplicado bajo 7500 sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems) y se repitieron tres veces de acuerdo con el protocolo del fabricante. Evaluación de la expresión relativa se calculó por el método comparativo CT (ciclo umbral). 2
-ΔΔCt a que se refiere el pliegue de la expresión del ARNm del gen diana en comparación con la expresión de GAPDH en la misma muestra.
Western Blot
extractos de células totales se prepararon en 1 × SDS tampón de carga, separados por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF, entonces inmunorreaccionar con anticuerpo monoclonal de ratón anti-HOXB7 (Abnova) como anticuerpo primario. Cabra de rábano picante anti-ratón conjugado con peroxidasa IgG se utilizó como anticuerpo secundario. La inmunorreactividad se detectó con un kit de reacción de quimioluminiscencia (GE Healthcare). Como control de carga, glyceraldehyde- 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón (Abcam).
Inmunohistoquímica
Después de la desparafinación de rutina y la hidratación, las secciones de tejido se trataron con 3 % de peróxido de hidrógeno y después se calentó en una solución de citrato (pH = 6,0) para la recuperación de antígeno. La reacción antígeno-anticuerpo HOXB7 tuvo lugar durante la noche a 4 ° C después de bloqueo de suero de cabra. El anticuerpo anti-HOXB7 monoclonal de ratón (Abnova) se utilizó a 1 g /ml (1: 1000), y de cabra anti-ratón conjugado con biotina IgG fue utilizado como anticuerpo secundario. Las señales de inmunohistoquímica fueron anotados por dos observadores independientes. Las puntuaciones se calcularon como el número de células teñidas dividido por el número total de células cancerosas. Cinco campos de alta potencia representativos (X400) por portaobjetos fueron calculados y los resultados se promediaron. tinción inequívoca del núcleo en & gt; 25% de las células cancerosas se consideró alta expresión
CCK8 ensayo y el crecimiento celular curva
La proliferación celular se determinó por recuento celular Kit-8 tinción (Dojinodo. , Shanghai, china) según las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad inicial de 5 x 10
3 células /pocillo. En cada punto de tiempo, las células se tiñeron con colorante CCK8 10μl en medio de cultivo 90μl durante 2 horas a 37 ° C. La absorbancia se midió a 450 nm, con 650 nm como longitud de onda de referencia. Los resultados se confirmaron mediante el recuento de células manuales. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad inicial de 5 x 10
3 células /pocillo y recogidos en diferentes tiempo y se contaron usando un hematocitómetro. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Colonia ensayo de formación de
Las células se trataron con tripsina y se sembraron en placas de 6 pocillos (300-500 células /pocillo) y se cultivaron durante 3 semanas. Las colonias se tiñeron con tinción de Giemsa durante 30 minutos después de la fijación con 4% de paraformaldehído durante 15 minutos. Se realizaron tres experimentos independientes.
Análisis del ciclo celular
La distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. 1x10
6 células se recogieron y se fijaron con etanol al 70% frío. Después de la fijación, se añadió la solución de PI-tinción con RNasa A (BD Biosciences). Después de 30 minutos de incubación, las muestras teñidas se ejecutan en la citometría de FACScan (BD Biosciences), y se analizaron los datos utilizando el software FlowJo (Árbol de la estrella).
tumorigénesis en ratones desnudos
Los experimentos con animales eran aprobado por el Comité de Ética del hospital de cáncer de Beijing, china, y realizada de conformidad con la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio. Los ratones se mantuvieron bajo el cuidado de la Unidad de Animales de Laboratorio del Hospital de Cáncer de Beijing, China. Estable células transfectadas shRNA (1 × 10
6) en 100 l de DMEM libre de suero /RPMI 1640 se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de 4 a 6 semanas de edad Balb /c hembra atímicos ratones desnudos. Todos los ratones fueron alojados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos. tumores de xenoinjertos se generaron y los ratones se sacrificaron por dislocación cervical dentro de las 4 semanas. Los tumores fueron extirpados, medida por un pie de rey y ponderado por una balanza analítica electrónica. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la siguiente fórmula:. volumen del tumor = [(longitud) x (ancho) x (anchura)] /2. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices estándar institucionales de la Escuela de Oncología de la Universidad de Pekín para los experimentos con animales
el análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS 19.0. Todos los experimentos in vitro se realizaron al menos tres veces por triplicado. Las comparaciones entre los grupos para la significación estadística se realizaron con la prueba t de Student para datos independientes de 2 colas. Bares y barras de error en los gráficos, así como datos en el texto representan la media ± SD. Las comparaciones entre el cáncer y tejidos normales emparejados fueron probados mediante la prueba de rangos con signo de Wilcoxon. Las relaciones entre la expresión HOXB7 y características clínico-patológicas se analizaron utilizando la prueba de Chi-cuadrado. Las curvas de supervivencia se trazaron por el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. El modelo de riesgos proporcionales de Cox con un procedimiento por etapas se utilizó para el análisis multivariante. P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
La expresión de HOXB7 fue aumentada en comparación con la CECA se combina tejidos cancerosos
lo habíamos informado 8 de 39 genes HOX, incluyendo HOXB7 , anormalmente expresado en los tejidos CECA, pero no en los tejidos no cancerosos usando transcripción inversa-PCR [9]. Para aclarar aún más la expresión de la proteína HOXB7 en CECA, inmunohistoquímica (IHC) tinción se realizó en tumores y tejidos no cancerosos emparejado de pacientes CECA. Se observó que la proteína HOXB7 se localizó principalmente en el núcleo de las células epiteliales del esófago normales en las capas basales y suprabasales, mientras que en los tumores, las células HOXB7-positiva distribuidos ampliamente. Análisis comparativo indicó que HOXB7 se reguló de manera significativa en 23 muestras de tumores examinados (18/23) en comparación con los tejidos adyacentes no cancerosos (9/23) (Figura 1A, P = 0,039).
(A) Muestra representativa de emparejado tejidos normales (a, b) y la CECA (c, d). En el epitelio normal del esófago, la expresión HOXB7 era principalmente limitado al núcleo de las células epiteliales situados en las capas basales y suprabasales, mientras que en la CECA, las células HOXB7-positivas se observaron en términos generales en el tumor (caso no. 53865). (B) Figura A y B, control negativo, con el anticuerpo primario sustituido por PBS (Caso núm. 40146). Figura cyd, baja expresión de HOXB7 en CECA (Caso núm. 42873). Figura E y F, la alta expresión de HOXB7 en CECA (Caso núm. 36840). (C) de Kaplan-Meier curva de supervivencia de 177 pacientes de la cohorte I. El tiempo medio de supervivencia fue de 45 meses para los pacientes altos de expresión, lo cual fue significativamente más corto que los 137 meses para los pacientes de expresión bajos (P = 0,007). (D) la curva de supervivencia de Kaplan-Meier para 103 pacientes de la cohorte II. El tiempo medio de supervivencia fue de 19 meses para los pacientes de alta expresión, que fue significativamente más corto que los 34 meses para los pacientes de baja expresión (P = 0,001).
HOXB7 expresión de la proteína se asoció con características clínicas y la supervivencia global
en la cohorte I, se observó una alta expresión de la proteína HOXB7 en 124 de 177 muestras de tumores (70,1%) (figura 1B). prueba de chi-cuadrado mostró que los niveles de expresión de la proteína HOXB7 correlacionaron significativamente con el estadio TNM (p = 0,034), estadio T (P = 0,036) y la metástasis de los ganglios linfáticos (Tabla 1, P = 0,042). El análisis univariante indicó que los pacientes que tenían niveles de expresión bajo HOXB7 vivían mucho más tiempo (figura 1C, P = 0,007). El tiempo medio de supervivencia fue de 45 meses para los pacientes con alta expresión, que fue significativamente más corto que los 137 meses para los pacientes con baja expresión (Tabla 2). análisis de supervivencia multivariante confirmó que la expresión HOXB7 y el estadio TNM eran dos factores pronósticos independientes para la supervivencia global en pacientes con CECA (Tabla 3, HR [IC del 95%] = 0,573 [0,341-0,963], p = 0,036 para HOXB7 baja expresión).
en la cohorte II, se detectó la alta expresión de la proteína HOXB7 en 61 de 103 (59,2%) casos de muestras de tejido tumoral (figura 1B). prueba de chi-cuadrado mostró que los niveles de expresión de la proteína HOXB7 correlacionaron significativamente con el estadio TNM (p = 0,001), estadio T (P = 0,000) y la metástasis de los ganglios linfáticos (Tabla 1, P = 0,006). El análisis univariante mediante la prueba de log rank mostraron que los pacientes con bajos niveles de expresión HOXB7 tuvieron un mayor tiempo de supervivencia media que aquella con la expresión de alto HOXB7 (34 vs. 19 mons pubis, P = 0,001) (figura 1D, Tabla 2). análisis de supervivencia multivariante indicó que el nivel de expresión HOXB7 y el estadio TNM eran dos factores pronósticos independientes para la supervivencia global en pacientes con CECA (Tabla 3, HR [IC del 95%] = 0,543 [0,350-,844], p = 0,024 para HOXB7 baja expresión) .
el descenso de regulación de la proteína HOXB7 disminución de la proliferación celular in vitro
Para evaluar el posible papel de HOXB7 en la proliferación de células humanas CECA, en primer lugar, que detectó la expresión de HOXB7 en varias células CECA líneas. PCR en tiempo real y análisis de transferencia Western reveló que EC109 y KYSE150 exhiben relativamente alta expresión endógena de HOXB7. Por lo tanto, se optó por líneas celulares EC109 y KYSE150 para el estudio y derribado expresión HOXB7 mediante el uso de ARN de interferencia. De los cuatro lentivirus con ARN de horquilla corta, el mejor fue seleccionado para la cepa celular establecida con la caída estable de la proteína HOXB7. Mientras tanto, se utilizó un lentivirus con scramble shRNA como control. Por último, se establecieron EC109 /Scramble, EC109 /shHOXB7 y KYSE150 /Scramble, KYSE150 /shHOXB7. La eficacia de la precipitación fue examinado por PCR en tiempo real y transferencia Western. HOXB7 ARNm y la expresión de proteínas se redujo eficazmente por 80% a 85% en EC109 y líneas celulares KYSE150 (Fig 2A). ensayo CCK8 mostró que desmontables HOXB7 disminuyó la proliferación de EC109 y KYSE150 comparación con las células control (Figura 2B; P & lt; 0,05). recuentos de células Manual de células confirmaron la disminución de la proliferación observada en el ensayo CCK8. (Fig 2C; P & lt; 0,05). ensayo de formación de colonias reveló que las células /shHOXB7 EC109 /shHOXB7 y KYSE150 formaron colonias mucho menos y más pequeña que la de las células control (Fig 2D; P & lt; 0,05).
(A) Desmontables de HOXB7 endógeno en específico shRNA EC109 -transduced estable y KYSE150 células, se analizaron por PCR en tiempo real y Western Blot. (B) Desmontables de HOXB7 inhibe el crecimiento celular como se determina por el ensayo de CCK8. (C) Derribo de HOXB7 inhibe el crecimiento celular según lo confirmado por el recuento de células manuales. (D) Derribo de HOXB7 inhibe el crecimiento celular como se muestra mediante el ensayo de formación de colonias. Las barras de error representan la media ± SD de 3 experimentos independientes. *, P & lt;. 0,05
El descenso de regulación de la proteína HOXB7 redujo el crecimiento del tumor in vivo
Para confirmar el efecto de HOXB7 sobre la actividad de las células tumorigénicas CECA in vivo, se realizó Los ensayos de tumorogénesis en ratones desnudos. cepas de células con EC109 /Scramble, EC109 /shHOXB7 y KYSE150 /Scramble, se inyectaron células /shHOXB7 KYSE150 en ratones desnudos. Los xenoinjertos de tumores se eliminaron 4 semanas después de la inyección y se midieron y ponderados. Como se muestra en la figura 3A y 3B, los tumores formados por la EC109 /shHOXB7 y células /shHOXB7 KYSE150 fueron significativamente más pequeños que los de control de los tumores de células formadas. El peso medio y el volumen de los tumores en el grupo EC109 /shHOXB7 fueron 869 ± 295 mg y 870 ± 370 mm
3, respectivamente, en comparación con 1.292 ± 453 mg y 1.416 ± 472 mm
3 en el grupo EC109 /Scramble (P & lt; 0,05). El peso medio y el volumen de los tumores en el grupo /shHOXB7 KYSE150 fueron 415 ± 254 mg y 603 ± 362 mm
3, respectivamente, en comparación con 697 ± 253 mg y 1.069 ± 377 mm
3 en el grupo KYSE150 /Scramble (P & lt; 0,05).
tumores (a) generados por la inyección de EC109 /KYSE150 con células de proteínas y de control HOXB7 desmontables estables. (B) El peso y el volumen de los tumores de las células HOXB7-desmontables eran relativamente más bajos que los de las células de control. (C) Histogramas representativos analizados mediante citometría de flujo mostraron los perfiles del ciclo celular de las células CECA. En las células con proteína HOXB7 caída estable, el número de células en las fases S y G2 disminuyó en comparación con las células de control. (D) La proporción de células en diferentes fases del ciclo celular. Las barras de error representan la media ± SD de 3 experimentos independientes. *, P & lt;. 0,05
HOXB7 acelera la progresión del ciclo celular
Para explorar el posible mecanismo de HOXB7 en la promoción de la proliferación celular CECA, hemos probado la distribución del ciclo celular por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 3C, desmontables de proteína HOXB7 resultó en la detención en G1, con un aumento de la proporción G1 y una disminución en S y la proporción G2. El porcentaje de células en las fases S y G2 en el grupo EC109 /shHOXB7 era 30,18% ± 1,16% y 9,51% ± 0,23%, respectivamente, que fue menor que en las células control (31,75% ± 0,55% y 14,36% ± 0,94%, Fig 3D, P & lt; 0,05). El porcentaje medio de células en las fases S y G2 en grupo /shHOXB7 KYSE150 era 37.31% ± 1.09% y 28.70% ± 1.22%, respectivamente, en comparación con el 41.00% ± 1.32% y 30.92% ± 2.21% en el grupo KYSE150 /Scramble (Fig 3D, P & lt; 0,05). Estos resultados indicaron que HOXB7 podría acelerar la transición de G1 a la fase S en las líneas celulares CECA, lo que contribuye a la proliferación de células CECA.
Discusión
biomarcadores tumorales ideales tienen buen valor pronóstico y pueden servir de guía clínica la práctica, y por lo tanto, la búsqueda de una valiosa biomarcador pronóstico ha ganado aspecto principal de la investigación oncológica. Entre estos, la expresión anormal de genes relacionados con la embriogénesis en malignidad siempre ha recibido considerable atención [10]. Por ejemplo, la relación entre el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el cáncer colorrectal y que entre el alfa-fetoproteína (AFP) y cáncer de hígado, que se han aplicado con éxito en el ámbito clínico. Sin embargo, hasta ahora, buenos marcadores tumorales para la CECA no han sido identificados para su uso en la práctica clínica. Nuestros estudios previos han puesto de manifiesto la expresión anormal de los 39 miembros de los genes Hox en el ARNm en el tejido maligno de esófago. Entre ellos, ocho se expresa sólo en el tejido maligno de pacientes CECA, pero no en los tejidos normales adyacentes apareados, incluyendo [9] HOXB7. Otro estudio también demostró que HOXB7 no se expresa en el esófago normal, pero se expresa a niveles más altos en el nivel de mRNA en CECA [11]. El presente estudio confirma estos hallazgos preliminares. Se mostró que la expresión de HOXB7 fue significativamente mayor en 23 muestras de tejido esofágico maligno que en la mucosa normal adyacente emparejado, que ofrece una buena base para considerar HOXB7 como un marcador molecular potencial para la CECA. Desde enero de 2000, hemos establecido un único cirujano (Dr. Chen) prospectivo base de datos de cáncer de esófago y de forma consecutiva reclutaron 1.249 pacientes con cáncer de esófago que fueron sometidos a resección quirúrgica. Las visitas de seguimiento se programaron para todos los pacientes incluidos en la base de datos hasta su muerte. HOXB7 expresión en los extraídos 177 casos que cumplieron con los criterios se examinó y se analizó su relación con el pronóstico. Los resultados mostraron que la expresión HOXB7 se correlacionó positivamente con el estadio TNM (P = 0,034), T etapa (P = 0,036), la metástasis de los ganglios linfáticos (P = 0,042). El tiempo medio de supervivencia de los pacientes con una expresión de alto HOXB7 fue significativamente más corta que la de los pacientes con baja expresión HOXB7 (45 meses frente a 137 meses, p = 0,007). A fin de confirmar este resultado, se realizó un estudio retrospectivo sobre otra anterior cohorte de pacientes con datos prospectivos. Una tendencia similar se observó en los resultados: la expresión HOXB7 en esta cohorte también mostró una correlación positiva con el estadio TNM (p = 0,001), la etapa de T (P = 0,000) y la metástasis de los ganglios linfáticos (P = 0,006). El tiempo medio de supervivencia de los pacientes con una expresión de alto HOXB7 fue significativamente más corta que la de los pacientes con baja expresión HOXB7 (19 meses frente a 34 meses, p = 0,001). Por otra parte, el análisis multivariado con variables como la edad, sexo, localización del tumor, el estadio TNM, el estadio T, la etapa N, y la expresión HOXB7 mostró que la expresión HOXB7 y el estadio TNM fueron factores pronósticos independientes en 177 pacientes reclutados en la base de datos prospectiva (HR [95% IC] = 0,573, [0.341-0.963], p = 0,036) y 103 pacientes reclutados en otra cohorte sin datos prospectivos (HR [IC del 95%] = 0,543, [0,350 hasta 0,844], p = 0,024), lo que indica que tenía HOXB7 valor pronóstico para los pacientes con CECA.
para explorar aún más el mecanismo funcional de HOXB7 en la aparición y desarrollo de la CECA, se analizó la expresión HOXB7 en varias líneas celulares CECA y la lista corta dos líneas celulares que muestran alta expresión de HOXB7 (EC109 y KYSE150) para in vitro e in vivo.
en primer lugar, la técnica de interferencia de ARN fue empleado para establecer las cepas celulares estables HOXB7-desmontables, que luego fueron utilizados para llevar a cabo el ensayo CCK8, ensayo de velocidad de formación de colonias, y análisis del ciclo celular por citometría de flujo para observar el efecto de HOXB7 sobre la proliferación celular en CECA. Nuestros resultados mostraron que la tasa de proliferación celular fue más lenta en cepas de células HOXB7-desmontables, colonia tasa de formación se redujo, detención de la fase G1 se produjo en las células malignas, y la proporción de células en las fases G1 aumentó significativamente. A fin de verificar el impacto de HOXB7 sobre la proliferación celular in vivo, se utilizó cepas de células desmontables para establecer la tumorigenicidad en un modelo de ratones desnudos y se encontró que la capacidad tumorigénico de cepas de células desmontables fue significativamente menor que la de las células de control.
de hecho, la desregulación de la expresión HOXB7 se ha informado en una variedad de tumores, incluyendo cáncer de mama [12 a 14], cáncer de ovario [15], cáncer oral [16], el cáncer colorrectal [17], cáncer de pulmón [18] , el melanoma [19-21] y el cáncer de páncreas [22-24]. La sobreexpresión de HOXB7 se mostró estar relacionada con un mal pronóstico en cáncer de mama [14], cáncer oral [16], el cáncer colorrectal [17], cáncer de pulmón [18] y el adenocarcinoma de páncreas [22, 23]. Sin embargo, la importancia clínica de HOXB7 en CECA rara vez se informó. Había dos artículos que exploran importancia pronóstica de la expresión HOXB7 en ARNm y proteínas en CECA recientemente, pero los tamaños de las muestras eran muy limitadas, y no se confirman sus hallazgos en una cohorte independiente [25, 26]. En comparación con estos estudios, no sólo se verificó la fiabilidad de nuestros resultados en dos cohortes independientes, incluyendo 280 casos, pero también estudiamos más para explorar la posible función de HOXB7 en CECA. Se ha encontrado que HOXB7 podría promover la proliferación de células tumorales en otros tumores sólidos [13-19, 27]. Pero hasta ahora no existían estudios sobre el posible papel de HOXB7 y sus mecanismos subyacentes en la CECA. Con base en los resultados preliminares antes descritas, creemos que HOXB7 es probable que se identifiquen como un biomarcador pronóstico para los pacientes CECA, y la expresión anormal HOXB7 podría afectar a la capacidad proliferativa de las células.
Mientras tanto, observamos un efecto positivo correlación entre una mayor expresión de la proteína HOXB7 y metástasis en los ganglios linfáticos regionales. Así que llevamos a cabo Transwell ensayo de migración y ensayo de invasión de Matrigel, lo que indica que la migración celular HOXB7 desmontables inhibido y capacidad de invasión de EC109 y KYSE150 (S1 figura; P & lt; 0,05). Pero la función de HOXB7 en la invasión celular y la metástasis en CECA siguen necesitando una mayor exploración.
Los mecanismos que subyacen en el papel de HOXB7 en CECA no está claro. La exploración del mecanismo es complicado por la similitud de secuencia entre los genes HOX y redundancia funcional reconocidos en el sistema de gen HOX [7]. Como factor de transcripción, HOXB7 media sus efectos mediante la regulación de la transcripción de genes diana. Aunque muchos genes se han demostrado ser regulada directamente o indirectamente por HOXB7 en otras células cancerosas, sólo unos pocos de ellos han sido identificados como objetivos directos, incluyendo bFGF [13, 22, 28]. HOXB7 podría activar directamente la expresión del factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y promover el crecimiento de diversos tumores, tales como cáncer de mama y melanoma [13, 19, 29]. Y bFGF había sido implicado en diversos procesos biológicos, tales como la proliferación, la diferenciación, la supervivencia y la migración [30]. expresión HOXB7 podría promover el crecimiento celular mediante la activación de crecimiento bFGF vías estimuladoras tanto intracrina y autocrinos en carcinomas de ovario [15]. La expresión de bFGF podría activar vía de Ras-RAF-MAPK a través de cascadas de señalización autocrina en el cáncer de mama [12]. Se demostró que la PI3K /AKT y MAPK vías fueron activadas por HOXB7 en el cáncer colorrectal, lo que puede explicar la aceleración de la transición G1-S inducida por HOXB7 [17]. En conclusión, estos resultados refuerzan nuestros hallazgos y aclararon la importancia de HOXB7 en la tumorigénesis. Más estudios para identificar los mecanismos sobre HOXB7 activadores aguas arriba, abajo objetivos y socios funcionales valdría la pena para entender mejor el papel de HOXB7 en CECA
Este estudio tiene algunas limitaciones:. Se obtuvieron los datos clínicos del centro único, el tamaño de la muestra no era lo suficientemente grande, y los estudios de investigación clínica retrospectiva eran en realidad. Por lo tanto, en futuros estudios, el tamaño de la muestra se debe aumentar, y los pacientes del centro múltiple debe ser incluido para aclarar si HOXB7 puede servir como un marcador pronóstico molecular específica en CECA. Por otra parte, se justifica un estudio en profundidad sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la función de la HOXB7 en la promoción de la proliferación de células CECA.
Apoyo a la Información
S1 Fig. HOXB7 promueve la migración celular humana ESCC y la invasión.
(A) Desmontables de HOXB7 inhibe la migración celular como se determina por ensayo de migración Transwell. (B) Derribo de HOXB7 inhibe el crecimiento celular como se demostró por ensayo de invasión de Matrigel. Las barras de error representan la media ± SD de 3 experimentos independientes. *, P & lt; 0,05
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130551.s001 gratis (TIF)
S1 Archivo.