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PLOS ONE: Expresión de AFP y STAT3 está involucrado en inducida por el trióxido de arsénico La apoptosis y la inhibición de la proliferación en AFP productora de cáncer gástrico Cells


Extracto

alfa-fetoproteína (AFP) -producción cáncer gástrico (AFPGC) , representada por la producción de AFP, tiene un comportamiento más agresivo que el cáncer gástrico común. Los mecanismos subyacentes no se comprenden bien. El trióxido de arsénico (Como
2O
3) se utiliza clínicamente para tratar la leucemia promielocítica aguda (APL) y tiene una actividad
in vitro
contra varias líneas celulares de tumores sólidos, con la inducción de la apoptosis y la inhibición de la proliferación los efectos principales. transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) tiene un papel importante en la tumorigénesis de varios cánceres primarios y células de cáncer por la regulación al alza de células-supervivencia y la regulación negativa de proteínas supresoras de tumores. Aquí, encontramos una disminución de expresión de AFP y STAT3 después de la inducción de la apoptosis de Como
2O
3 en las células AFPGC FU97. Además, el nivel del oncogén objetivo STAT3 Bcl-2 se redujo con Como
2O se aumentó
3, y la del supresor de tumor Bax. Además, la expresión de STAT3 y la profundidad de la invasión y la metástasis de los ganglios linfáticos se asociaron. La supervivencia de los pacientes con cáncer gástrico fue menor con la AFP y STAT3 doble sobreexpresión que con la sobreexpresión de cualquiera de los dos solos. Regulación a la baja de AFP, y la expresión de STAT3 desempeña un papel importante en la medida
apoptosis inducida por 3 2O
AFPGC de las células, lo que sugiere un nuevo mecanismo de As
2O la apoptosis celular inducida por 3
. Como
2O
3 puede ser un posible agente para el tratamiento AFPGC

Visto:. Jia Y, Liu D, Xiao D, Ma X, Han S, Zheng Y, et al. (2013) Expresión de AFP y STAT3 está involucrado en inducida por el trióxido de arsénico La apoptosis y la Inhibición de la proliferación de células AFP productora de cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (1): e54774. doi: 10.1371 /journal.pone.0054774

Editor: Matias A. Ávila, Universidad de la Escuela de Medicina de Navarra y el Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA), España |
Recibido: 4 de noviembre de 2012; Aceptado 14 de diciembre de 2012; Publicado: 30 Enero 2013

Derechos de Autor © 2013 Jia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencia natural Concesión de China (SNCF, N ° 81000869 y 81272588). (Http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

alfa-fetoproteína (AFP) es una proteína plasmática importante producido por el saco vitelino y el hígado durante la vida fetal. En la práctica clínica, la AFP se utiliza a menudo como un marcador tumoral del carcinoma hepatocelular y tumores del saco vitelino. Algunos estudios han demostrado que los otros tumores en humanos también podrían producir AFP y cáncer gástrico fue uno de los más comunes [1] - [8]. AFP productoras de cáncer gástrico (AFPGC) tiene un comportamiento más agresivo que el cáncer gástrico común ya que la enfermedad progresa rápidamente y hace metástasis con frecuencia en los ganglios linfáticos regionales y el hígado [7] - [10]. Por otra parte, AFPGC se asocia con metástasis hepáticas más corto sin intervalo después de la cirugía radical, y la tasa de supervivencia es significativamente más pobre con AFPGC que sin la producción de AFP [1], [9], [10]. Por lo tanto, AFP puede ser un marcador tumoral pasivo y un estimulador de crecimiento de tumor activo. La regulación negativa de la expresión de AFP puede ser un método eficaz para producir AFP-cáncer

trióxido de arsénico (As
2O
3) se ha utilizado con éxito para tratar la leucemia [11] -. [13] y es activa en varios tumores sólidos, incluyendo cáncer gástrico [14]. El mecanismo de acción de Como
2O
3 incluye afectan a las actividades de Akt, quinasas JNK, NF-kB, el glutatión, la señalización de calcio, especies reactivas de oxígeno (ROS) y las caspasas, así como pro- y anti proteínas -apoptotic [15] - [18]. No quimioterapia estándar está disponible para AFPGC, aunque algunos regímenes han demostrado eficacia en un pequeño número de casos [19] - [21]. Además, los efectos y el mecanismo de Como
2O
3 en contra AFPGC siguen sin estar claros.

transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) está implicado tanto en la transducción de señales y la activación de la transcripción y tiene un papel importante en diversos procesos biológicos tales como el metabolismo y la tumorigénesis [22], [23]. STAT3 se activa constitutivamente en una amplia variedad de tipos de cáncer [24], [25]. Orientación de STAT3 puede ser un método eficaz para hacer frente a la progresión del tumor. Este efecto STAT3 es mediada a través de la regulación de varios genes diana STAT3, incluyendo inhibidores de la apoptosis y reguladores del ciclo celular, tales como Bcl-2, MCL-1, survivin, p53, c-Myc, ciclina D1 [26] - [31], y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [32]. Sin embargo, el papel de STAT3 en AFPGC es poco conocida.

A continuación, se analizó el efecto de la medida
2O
3 sobre la proliferación y la AFP y la expresión de STAT3 en células AFPGC FU97. Se evaluaron los eventos aguas abajo de STAT3 señalización, Bcl-2 y la expresión de Bax, para explorar las posibles mecanismos subyacentes a este fenómeno. Además, se evaluó la expresión de AFP y STAT3 por inmunohistoquímica en muestras de cáncer gástrico humano. Regulación a la baja de AFP, y la expresión de STAT3 contribuyeron a medida
2O apoptosis y la inhibición de la proliferación
3-inducida en AFPGC.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

La protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética clínica de prueba andHuman médica del hospital central de Jinan. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.

Cultivo celular y tratamiento de drogas

La línea celular humana AFPGC FU97 se obtuvo de la Colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación (Japón) y se mantuvo en DMEM ( Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS;. Invitrogen), con 1% de antibióticos a 37 ° C en 5% de CO
2 humidificadores de aire


2O
3 ( Sigma) se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 1 mol /L como una solución madre y se almacenó a 4 ° C. Para
vitro
uso en, la solución madre se diluyó a la concentración apropiada en medio de crecimiento sin FBS. Células en crecimiento exponencial se trataron con Como
2O
3 a concentraciones finales de 1, 5 o 10 mmol /L. Los cultivos de control se trataron con PBS destilada a una concentración final de 0.1% en medio de cultivo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.


3 en la inhibición de
in vitro
se determinó el crecimiento de las células FU97 Ensayo de citotoxicidad MTT

El efecto de la medida
2O en mediante la medición de MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolio) teñir absorbancia de las células vivas. FU97 células se sembraron en placas de 96 pocillos a 1,6 × 10
3 células por pocillo en 100 l DMEM conteniendo 10% de FBS durante la noche. Después de la exposición a diversas concentraciones de Como
2O
3 por 24, 48 y 72 h, 20 l (5 g /L) MTT (Sigma, St. Louis, MO) se añadió solución a cada pocillo y las placas se se incubaron durante 4 h adicionales a 37 ° C. Formacina se disolvió en 150 l /sulfóxido así dimetilo (DMSO) y se detectó la absorbancia a 490 nm. tasa de inhibición (%) = (1-A valor en el grupo experimental /A valor en el grupo de control) x 100%. El grupo 0 mmol /L se utilizó como control en blanco.

Análisis de fragmentación de ADN mediante electroforesis

Un total de 10
6 células se raspó suavemente de platos, se lavó dos veces en PBS frío, y se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 min, después se lisaron en 200 l tampón de lisis (1 ml de tampón 1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,2 ml de ácido etilendiaminotetraacético 0,5 M [EDTA], 0,5 ml de 10% de Triton X-100 ). se llevaron a cabo las células lisadas a 4 ° C durante 10 min, y los sobrenadantes se incubaron con 2 l de RNasa A (10 mg /ml en tampón de Tris-EDTA) a 50 ° C durante 30 min, y luego con 2 l de proteinasa K (10 mg /ml en agua destilada) durante 45 minutos a 50 ° C. La solución se mezcló con 5 M de NaCl (20 l) y 2-propanol (120 l), se incubaron a 20 ° C durante 24 h, después se centrifugó a 15.000 rpm durante 20 min. El ADN precipitado se disolvió en Tris-EDTA (5 l) de tampón y se sometió a electroforesis con gel de agarosa al 2% y tampón de Tris-acetato-EDTA a 50 V. El patrón de fragmentación de ADN se visualizó con el uso de un transiluminador de UV.

Hoechst 33258 Análisis tinción de apoptosis de las células
p>

Cuantitativo PCR en tiempo real

Las células fueron cultivadas con Como
2O
3 (5 mmol /L ) durante 72 h. El ARN total se extrajo con el uso del reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se cuantificó por espectrofotometría. Primera línea de cDNA fue preparado con el uso de cebadores aleatorios siguiendo las instrucciones del kit (Takara, Japón). PCR en tiempo real cuantitativa de AFP, STAT3 y sus genes abajo involucrado el 7300 en tiempo real PCR System (ABI, EE.UU.) con reactivos Takara SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, Japón). Los cebadores se diseñaron y validaron por Invitrogen. La información de imprimación es en la Tabla 1. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo por triplicado en un volumen de 20 l durante 2 min a 94 ° C para la desnaturalización inicial, seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 30 s y a 60 ° C durante 45 s. Un gen de control GAPDH limpieza se utilizó como control interno. Cada conjunto de cebadores se ensayó primero para determinar las concentraciones óptimas, y los productos se hicieron correr sobre un gel de agarosa al 1% para confirmar el tamaño adecuado. Posteriormente, ABI software curva de disociación se utilizó para controlar por múltiples especies en cada amplificación PCR. ADNc a partir de células sin FU97 Como
2O se utilizó
3 tratamiento para construir una curva estándar para cada gen.

Análisis Western Blot

Los sedimentos celulares se homogeneizaron en la extracción tampón (50 mmol /L de Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% de SDS, 150 mmol /l de NaCl, 100 mg /L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mg /L de aprotinina, 1% NP-40 y ortovanadato de sodio 0,5%), se incubaron a 4 ° C durante 30 min, y se centrifugaron durante 20 min a 12 000 g /min. La proteína total en el lisado celular se midió con el uso del kit colorimétrico Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Para el análisis de transferencia Western, la proteína total se separó en 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (0,45 m, Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), que se incubaron durante 24 horas a 4 ° C con los anticuerpos para AFP (1 :500, R & amp; D), STAT3 (1:1000), caspasa 3 (1:500), Bcl-2 (1:500), BAX (1:500) y GAPDH (1:1000; toda la tecnología de señalización celular) , a continuación, peroxidasa de rábano conjugada anti-ratón /conejo de anticuerpos IgG (Santa Cruz Biotechnology) después de un lavado final. Las reacciones se desarrollaron con el uso de 4-cloro-1-naftol (Sigma) y H
2O
2. Se detectaron señales con el uso de un kit de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Reino Unido). GAPDH nivel era un patrón interno.

Inmunoensayo de AFP concentración en el sobrenadante

El sobrenadante de FU97 células se recogieron después del tratamiento con As
2O
3 o negativo de control para 24, 48 y 72 concentración h.AFP en el sobrenadante se determinó por de dos sitios de ensayo inmunoenzimométrico en un sistema de TOSOH AIA (Japón). El valor de corte para la AFP fue de 10 ng /ml.

Los pacientes

Hemos examinado los datos de los registros quirúrgicos y patológicos de 24 pacientes con AFPGC y 24 pacientes seleccionados al azar con niveles normales de AFP en suero y adaptado a AFPGC pacientes por estadio del cáncer gástrico. Los pacientes habían sido sometidos a resección quirúrgica en el Hospital Clínico de la Universidad de Shandong, China, desde enero de 1996 a diciembre de 2011. Los pacientes mostraron AFPGC nivel de AFP sérica elevada, pero no hay enfermedades hepáticas concomitantes. presencia histopatológico de AFP positividad fue confirmado por inmunohistoquímica. Se estableció contacto con cada paciente para confirmar la supervivencia o la fecha de la muerte.

La inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica implicado el uso de biotina-estreptavidina-peroxidasa con un kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, CA, USA). Brevemente, las secciones de tejido (4 mm) se prepararon a partir de muestras de tejido embebidas en parafina. Las secciones se desparafinaron con xileno seguido de deshidratación en alcohol graduado. Las secciones se calentaron en un microondas durante 2 min a 900 W para recuperar el antígeno, y después se incubaron con H solución 0,3%
2O
2 en metanol durante 30 min para bloquear la peroxidasa endógena. Después de 3 lavados con solución salina con fosfato (PBS), los portaobjetos se incubaron con suero normal de caballo 10% para bloquear la tinción de fondo no específica, y luego se incubaron con anticuerpos de conejo primario anti-AFP (1:100 dilución) y anti-STAT3 (1:200) en una cámara húmeda a 4 ° C durante la noche. Después de un lavado con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpos anti-ratón-caballo biotinilado durante 30 min, se lavaron 3 veces con PBS, y se incubaron con peroxidasa conjugada con estreptavidina durante 30 min. Las secciones se visualizaron por incubación con 3, solución de 3'-diaminobencidina (0,3% H
2O
2 y 0,05% 3, 3'-diaminobencidina) y contratinción con hematoxilina. La omisión del anticuerpo primario era un control negativo. Cada carrera incluyó un control positivo y un control negativo. Para el control negativo, el anticuerpo primario fue sustituido por PBS.

Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± desviación estándar y se analizaron mediante el uso de SPSS v11.5 (SPSS Inc., Chicago , IL, EE.UU.). La asociación de las variables clínico-patológicas y AFP y la expresión de STAT3 se determinó mediante la prueba de chi-cuadrado, y la corrección de Yate se aplicó en un pequeño número de muestras. prueba de chi-cuadrado o de dos colas se utiliza
t
de Student para evaluar las diferencias entre los grupos. El análisis de la supervivencia consistió en la prueba de log-rank, con curvas de Kaplan-Meier. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa

Resultados

inhibición del crecimiento y la inducción de apoptosis en células FU97 por As
2O
3

FU97 células fueron tratadas con. diferentes concentraciones de Como
2O
3 (1, 5 y 10 mmol /L) a las 24, 48 y 72 h. Como
2O
3 inhibe la proliferación de FU97 concentración y tiempo dependiente de células (Fig. 1A). En las células tratadas con 5 mol /L y 10 mmol /L Como
2O
3 durante 72 h, la inhibición del crecimiento fue 56,27 ± 3,91% y 73,46 ± 4,64%, respectivamente. la fragmentación del ADN es un rasgo característico del proceso apoptótico. escaleras de mano de fragmentación de ADN típico se detectaron en FU97 células tratadas con 5 mmol /L y 10 mmol /L Como
2O
3 (fig. 1B). A continuación, se estudia aún más el cambio morfológico de las células apoptóticas. FU97 células tratadas con 5 mmol /L y 10 mmol /L Como
2O
3 durante 72 h fueron teñidas utilizando Hoechst 33258, y se observaron con resultados mostraron que microscope.The fluorescentes Como
2O
3 inducida FU97 células apoptosis de una manera dependiente de la concentración, como se indica por los núcleos fragmentados y condensados ​​(Fig. 1C). Para dilucidar la influencia adicional de As
2O
3 en la apoptosis de las células, caspase3 se mide por los resultados de la figura blot.The occidentales. 1D demuestra claramente que la caspasa 3 expresión de la proteína aumentó significativamente en FU97 cells.Therefore, Como
2O inhibición del crecimiento celular
3 podría inhibir el crecimiento celular e inducir la apoptosis de las células AFPGC FU97.

(A) medido mediante el ensayo de MTT. Los datos son la media ± SD de 3 experimentos independientes. (B) El análisis en gel de agarosa de la fragmentación del ADN en FU97 células tratadas con As2O3 para 72 h. (C) Apoptosis núcleos teñidos con Hoechst 33258 mostrar intensa fluorescencia correspondiente a la condensación de la cromatina y fragmentación. (D) Análisis de transferencia Western de la proteína caspase3 en total de células extractos de FU97 células tratadas con la concentración indicada de As2O3 para 72 h. expresión de GAPDH sirvió como control de carga.

Efecto inhibidor de As
2O
3 en la expresión de AFP y STAT3 en células FU97

Para dilucidar el papel de AFP y STAT3 en la medida
2O
3 inducida por la inhibición de la proliferación y la apoptosis, el efecto de la medida
2O
3 en la AFP y STAT3 expresión fue examinado utilizando cuantitativa en tiempo real PCR y Western blot. Las células fueron tratadas con 1, 5 y 10 mmol /L Como
2O
3 de 72 h.El ARNm y la expresión de la proteína de la AFP y STAT3 y la fosforilación de STAT3 fueron regulados a la baja de forma significativa con Como
2O
3 tratamiento de una manera dependiente de la concentración (Fig. 2, Fig. 7).

células fueron expuestas a As2O3 a 5 mol /L para 72 h. (A) RT-PCR cuantitativa de la expresión de ARNm. (B) Análisis de transferencia Western y la cuantificación de la expresión de proteínas. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes con resultados similares. * P & lt;. 0,05 en comparación con el 0 mmol /L

AFP de concentración asociado con la inhibición del crecimiento y la apoptosis en la célula FU97 sobrenadante de cultivo

Para confirmar aún más el efecto inhibidor de Como
2O
3 en la AFP, se midió el nivel de proteína AFP en el sobrenadante de células FU97. Como
2O
3 podría disminuir la concentración de AFP nivel de proteína dependiente (Fig. 3, Fig. 7). Este resultado está de acuerdo con la relación de crecimiento celular de inhibición (Fig. 1A), la apoptosis de FU97 células (Fig. 1B, C, D), y la reducción de la expresión de ARNm de AFP y STAT3 (Fig. 2A) y la expresión de proteínas de AFP, STAT3 y pSTAT3 (Fig. 2B).


2O
3 disminución de la concentración de la proteína AFP nivel dependiente. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes con resultados similares. * P & lt;. 0,05 en comparación con el 0 mmol /L

Niveles reducidos de STAT3 Los genes de segmentación, Bcl-2 y Bax, con As
2O
3 de tratamiento en FU97 células

Para explorar la expresión de STAT3 dirigir genes, se analizó la expresión de anti-apoptótica Bcl-2 y pro-apoptótica Bax en las células tratadas con FU97 Como
2O
3. La expresión de mRNA y proteína de Bcl-2 se downregulated en As
2O
3 células tratadas (Fig. 4), pero que de Bax se upregulated, lo que sugiere que el efecto de Como
2O
3 en apoptosis de las células estaba mediada por la inhibición de la constitutivamente activado STAT3 (Fig. 7).

(a) RT-PCR cuantitativa y (B) análisis de transferencia Western y la cuantificación de las células tratadas con Como
2O
3 a 5 mol /L para 72 h. La expresión del ARNm y la proteína de Bcl-2 se downregulated en As

2O 3 células tratadas, sino la de Bax se reguló. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. *
p
. & Lt; 0,05 en comparación con el control

Características clínicas de la Población seleccionada

Había 34 varones (70,8%) y 14 mujeres (29,2% ) pacientes, con una edad media de 66 años (rango, 45-83 años). Las características clínico-patológicas de los pacientes se resumen en la Tabla 2. Hubo 48 pacientes tenían datos completos de seguimiento, y el período de seguimiento fue de 3 meses a 60 meses, con un período medio de 33,7 meses. El tiempo de supervivencia global se definió como los meses siguientes a la fecha de la cirugía a la fecha de la muerte o pérdida de seguimiento.

Expresión inmunohistoquímica de STAT3

Debido a que carecen de información sobre la expresión de STAT3 en AFPGC, se determinó su expresión mediante tinción inmunohistoquímica de tejido del paciente AFPGC. En los 24 tumores primarios AFPGC, 11 fueron positivos (46%) y 13 fueron negativas (54%) para la expresión STAT3. En las muestras de cáncer gástrico 24 AFP-negativas, 8 (33%) tumores primarios fueron positivos y 16 (67%) fueron negativos para la expresión STAT3. Por otra parte, a pesar de un número relativamente bajo de pacientes con datos completos, STAT3 sobreexpresión se asoció significativamente con la profundidad de la invasión y la metástasis de los ganglios linfáticos (p & lt; 0,05). En los grupos AFP-positivos y negativos (Figura 5, Tabla 2, Fig . 7).

(a) La inmunotinción para AFP. (B) inmunotinción STAT3 fuerte con depósitos granulares de color marrón en el citoplasma y núcleos. (C) Negativo tinción inmunohistoquímica para el control de la AFP. (D) Control negativo tinción inmunohistoquímica para STAT3.

Expresión de AFP y STAT3 asocia a peor pronóstico del cáncer gástrico

El tiempo medio de supervivencia de los pacientes positivos a la AFP fue de 23 meses ( intervalo de confianza del 95%, 16-30 meses). que fue significativamente más corto que en los pacientes AFP-negativos, 53 meses (intervalo de confianza del 95%, 47-59 meses) (P & lt; 0,05) .La mediana de supervivencia en el grupo de STAT3-positivo fue de 38 meses intervalo de confianza (95% , 29-47 meses), que fue significativamente más corta que en el grupo de STAT3-negativas, 54 meses (intervalo de confianza del 95%, de 47-61 meses) (P & lt;. 0.05, la figura 6A y B, Fig 7) .Además. , la supervivencia fue menor para AFP y STAT3 pacientes de doble positivos que con la expresión de AFP o STAT3 solo (P & lt; 0,05, Fig 6C y D, Fig. 7).. En los pacientes con AFP y STAT3 expresión de doble positivo el tiempo medio de supervivencia fue de 22 meses (95% intervalo de confianza 11-33 meses). En comparación, en los pacientes con una sola expresión de AFP o STAT3, el tiempo medio de supervivencia fue de 54 meses (95% intervalo de confianza 44-64 meses) y 59 meses (95% intervalo de confianza 47-71 meses).

(A) AFP positividad solo. (B) STAT3 positividad solo. (C) la AFP y STAT3 doble positividad en comparación con la AFP positividad. (D) AFP y STAT3 doble positividad compararon con positividad STAT3 (todos P & lt; 0,05)

La inactivación del gen ATBF1 en AFPGC, a través de la mutación o reducción de la expresión, puede permitir que las células AFPGC para producir la proteína AFP. y sobreexpresan STAT3, lo que contribuye a un comportamiento agresivo y mal pronóstico de AFPGC. As2O3 puede inhibir el crecimiento celular e inducir la apoptosis AFPGC celular. Los mecanismos subyacentes pueden implicar regulación a la baja de AFP y de expresión STAT3 y STAT3 la regulación negativa de la expresión de anti-apoptótica de Bcl-2 y la regulación positiva de la del supresor de tumor Bax. Además, AFP puede dimerizar con otras proteínas tales como receptores nucleares, factores de transcripción y las caspasas, todos los cuales pueden promover el crecimiento de las células tumorales. AFP puede dimerizar con el factor de transcripción STAT3 para promover el crecimiento AFPGC. Por lo tanto, la AFP puede interactuar con STAT3 en la vía de señalización de la eficiencia de los agentes quimioterapéuticos en AFPGC.

Discusión

AFPGC ha sido difícil de tratar, principalmente debido a la propensión a la metástasis y la resistencia a las terapias convencionales. Se necesitan urgentemente terapias alternativas que tratan específicamente estos temas. Como
2O
3 se ha utilizado en ensayos clínicos de APL durante años, y 10 mg /día como
2O
3 fue encontrado efectivo para inducir la remisión completa en pacientes con diagnóstico reciente y la recaída de APL [ ,,,0],33]. Como
2O
3 inhibe la proliferación celular y la apoptosis inducida de la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 [34], que fue apoyado además por un ensayo clínico que muestra como
2O
3 sea eficaz y seguro para los pacientes con carcinoma primario avanzado del hígado [35], la toxicidad era nivel AFP leve y el suero se disminuyó. Por lo tanto, se investigó si Como
2O
3 también indujo inhibición del crecimiento celular y la apoptosis de adenocarcinoma hepatoide de estómago células AFPGC FU97 y que se encuentran las propiedades antitumorales de Como
2O
3 en las células AFPGC.

Ofrecemos pruebas de que cuanto
2O
3 tiene un fuerte efecto anti-proliferativo sobre FU97 células de una manera dependiente de la concentración y el tiempo. El nivel plasmático de arsénico en el manejo clínico de la leucemia promielocítica aguda puede llegar a 5.5 a 7.3 mM [36]. En nuestro estudio, todos los resultados mostraron que el 5 mmol /L Como
2O
3 inhibe eficazmente la proliferación y la apoptosis celular inducida a las 72 h. Esta dosis es clínicamente relevante, lo que sugiere que las células son sensibles a AFPGC Como
2O
3.

AFPGC, como se representa por la producción de AFP, exhibe una mayor actividad proliferativa, apoptosis más débil, y más rico neovascularización que los cánceres gástricos AFP-negativos. Por otra parte, los altos niveles de AFP en hepatocarcinoma completamente desarrollado o en el suero del huésped se asocian con un comportamiento más agresivo, y el aumento de anaplasia [37], [38]. Estudios de AFP desmontables de siRNA encontraron inhibe la proliferación celular en hepatomas [39]. Por lo tanto, AFP puede funcionar en un paso fundamental en la progresión del cáncer de AFP-positivo. Regulación a la baja de la expresión de AFP puede representar una estrategia terapéutica relevante. Se encontró que cuanto
2O
3 podría regular negativamente la AFP mRNA y expresión de la proteína. Además, regulación a la baja de la AFP por cuanto
2O
3 podría inhibir la proliferación celular e inducir la apoptosis celular en las células AFPGC FU97. Por otra parte, la secreción de la AFP en Como
células
3-2O tratados fue la dosis y de forma dependiente del tiempo disminuyeron en el sobrenadante. Regulación a la baja de la expresión de AFP podría contribuir a la inhibición Como
2O
3 inducida del crecimiento celular y la apoptosis. Por lo tanto, estos datos indican que la expresión de AFP es downregulated en respuesta a medida
2O
3 tratamiento. AFP puede desempeñar un papel importante en la proliferación y la apoptosis de AFPGC.

Además de ser un punto de convergencia de numerosas vías de señalización oncogénicas, STAT3 también participa en el crecimiento celular y la supervivencia. En las células de leucemia, As
2O
3 activa numerosas vías de transducción de señales intracelulares, lo que resulta en la inducción de la apoptosis [40]. Como
2O
3 inhibición de la STAT3, antes de inhibición de la proliferación celular, se ha descrito en células de mieloma múltiple [41]. También, como
2O
3 inhibe la proteína tirosina quinasa, por ende, indirectamente la disminución de la activación de proteínas STAT [42] .Por lo tanto, regulación a la baja de STAT3 se ha considerado como uno de los mecanismos de acción de Como
2O
3 en la leucemia promielocítica aguda (APL) .We conocer STAT3 activada en las células AFPGC, y As
2O
3 podría regular negativamente la expresión de ARNm y STAT3 expresión de la proteína STAT3 y pSTAT3. Sobre todo, la expresión downregulated de STAT3 y pSTAT3 fue consistente con la expresión downregulated de la AFP por cuanto
2O
3. STAT3 puede ser inhibida por algún factor durante su activación en respuesta a medida
2O
3. en AFPGC. Independientemente de los posibles mecanismos implicados en la regulación de STAT3, la expresión alta de AFP en AFPGC podría tener implicaciones importantes. Estudios previos han demostrado también que AFP podría dimerizar con otras proteínas, tales como receptores nucleares (es decir, los receptores de retinoico), factores de transcripción y las caspasas, todos los cuales pueden promover el crecimiento de las células tumorales [43], [44]. Esto, a su vez, ha llevado a especular que la AFP puede dimerizar con factores de transcripción STAT3 para promover el crecimiento AFPGC. Se necesitan más investigaciones sobre la regulación de la expresión de STAT3 en relación con la AFP.

STAT3 puede inducir la apoptosis de las células mediante la regulación negativa transcripcionalmente la expresión de Bcl-2 [45]. Bcl-2 es una molécula de efector aguas arriba en la vía apoptótica y un potente supresor de la apoptosis. Puede oligomerize Bax, que posteriormente se despolariza el potencial de membrana mitocondrial a la liberación del citocromo c y de inducir la apoptosis [46]. La relación de Bcl-2 a Bax es importante para determinar si las células se someterán a la apoptosis o la supervivencia. Encontramos reducción de la expresión de Bcl-2, junto con la expresión de STAT3 inhibido con As
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3 tratamiento en las células AFPGC. Por el contrario, se aumentó la expresión de Bax. Junto con los hallazgos en otros sistemas celulares, donde se encontró el nivel STAT3 inhibido para disminuir Bcl-2 expresión e inducir la apoptosis [45] efectos, la medida
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3 inducida por la que encontraron puede ser mediada por la inhibición de activado constitutivamente STAT3
.
Para demostrar aún más si STAT3 desempeña un papel clave en AFPGC, se examinaron los pacientes AFPGC en términos de expresión STAT3. positividad STAT3 en los tumores positivos a la AFP fue del 46% y en los tumores AFP-negativo del 33%. Los pacientes con AFPGC tuvieron una mayor tasa de expresión STAT3, aunque no significativa tal vez debido a un pequeño número de pacientes. Sin embargo, la expresión de STAT3-positiva se asoció con el tejido de cáncer, la profundidad de la invasión y la metástasis de los ganglios linfáticos en AFPGC. Clínicamente, los pacientes con AFPGC tienen mal pronóstico [1], [9], [10]. Se confirmó que el pronóstico era peor para los pacientes con y sin que la AFP, quienes fueron agrupados por la etapa del cáncer. Por otra parte, la supervivencia de los pacientes con positividad tanto AFP y STAT3 fue significativamente peor que aquellos con AFP o STAT3 positividad solo. Así, en este tipo específico de cáncer gástrico, STAT3 parece tener un papel importante en la supervivencia y proliferación celular. expresión de STAT3 en AFPGC puede explicar el comportamiento clínico agresivo de AFPGC, y la expresión de STAT3 puede ser un indicador útil progresión, si se valida por extensos estudios prospectivos de cohortes más grandes. Regulación a la baja de la expresión de AFP y STAT3 puede representar una estrategia terapéutica relevante en AFPGC. En cuanto a la relación entre la producción de AFP y de expresión STAT3, no hay ningún informe disponible que describe los mecanismos subyacentes a date.It ha informado de que la expresión AFP en el cáncer gástrico es debido a la falta del factor de transcripción ATBF1 [47]. Además, ATBF1, como un gen supresor de tumores, enhancesthe supresión de la señalización STAT3 por la interacción con PIAS3 [48] .Por lo tanto, es razonable considerar que la inactivación del gen ATBF1 en AFPGC, a través de la mutación o reducción de la expresión, se puede permitir AFPGC las células para producir la proteína AFP y overexpres STAT3. Para aclarar qué factores están involucrados en la producción de AFP expresión y STAT3, se necesitan más estudios.

En conclusión, como
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3 puede inhibir la línea celular AFPGC FU97 el crecimiento e inducir la apoptosis. Los mecanismos posibles estaban relacionadas con la regulación negativa de AFP y STAT3 y STAT3 la orientación de genes anti-apoptóticos de Bcl-2 y la regulación al alza del gen supresor de tumores Bax (Fig. 7). La expresión de STAT3 en AFPGC juega un papel importante en la invasión tumoral y pronóstico. Como
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3 puede ser un posible fármaco adyuvante en el tratamiento de la nueva AFPGC. El presente estudio proporciona una base teórica para su uso clínico digno de estudio adicional.

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