Extracto
Hemos probado la hipótesis de que (i) las variaciones sinónimos dentro de las regiones codificantes y (ii) las variaciones dentro de las regiones no codificantes del VPH, influyen en la patogénesis del cáncer de cuello de útero (CaCx) bajo el impacto de los genomas de HPV16 intactas. Todo el análisis de la secuencia del genoma de HPV16 aísla dentro de los 70 casos CaCx y 25 muestras no malignas revelaron que las variaciones sinónimas, genes E5 (p = 0,001) y L2 (p = 0,0002) de los aislados de HPV16 fueron significativamente mayores dentro de la E6 (p = 0,014) dentro de los casos, en comparación con los aislados dentro de las muestras no malignas. Todos de los 25 (100%) codones humanizados identificados dentro L2 ORF de las muestras analizadas, los albergaba casos CaCx, mientras que 8 de cada 25 (32%) fueron albergado por HPV16 muestras no malignas positivas (p = 3.87105E-07 ). L2 (ARNm y proteína) expresión fue evidente sólo entre los casos con genomas virales episomales y la expresión de ARNm de L2 significativamente correlacionado con el número de copias del gen E2 que sugieren la expresión de todos los genomas episomales. Entre estos casos, Asian American (AA) Aislado de retratado todos los codones humanizados (100%; 4-6 /muestra) grabada dentro de L2, que fue significativamente mayor (p = 2.02E-7) en comparación con el europeo (E) de los aislamientos (22,8%; ninguno o 1-2 /muestra). Además, la mayoría de la variante E aísla dentro de los casos (54/57; 94,7%) representado una variación (T4228C) dentro de la corta región no codificante (NCR2) entre los genes E5 y L2, que representa una actividad de promotor débil específico para la expresión L2 mRNA . Esto dio lugar a la pérdida de 9 de los 14 sitios de unión miARN (HSA-miR-548 familiares), a pesar de la sobreexpresión significativa de miR548a-5p y miR548d-5p entre tales casos (28.64 y 36.25 pliegues, respectivamente), en comparación con el VPH negativo muestras de control. Los resultados ejemplifican la importancia biológica de variaciones de la secuencia en el genoma de HPV16 y HPV16 destacan que episomal en casos CaCx emplean múltiples mecanismos para sostener expresión L2, lo que justifica el papel potencial de L2 en tales tipos de cáncer, a diferencia de los que alberga la integración viral.
Visto: P Mandal, Bhattacharjee B, D Das Ghosh, Mondal NR, Roy Chowdhury R, Roy S, et al. (2013) Expresión diferencial de HPV16 L2 de genes en cánceres de cuello uterino que albergan episomal HPV16 Genomas: influencia de las variaciones Región sinónimos y no codificantes. PLoS ONE 8 (6): e65647. doi: 10.1371 /journal.pone.0065647
Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Puerto Oncología, Portugal
Recibido: April 2, 2013; Aceptado: April 26, 2013; Publicado: 6 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Mandal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Departamento de Biotecnología (Grant No. BT /PR8014 /Med /14/1220/2006), Gobierno de la India, y en parte por el Instituto indio de estadística (intramuros), y el Instituto Nacional de Genómica Biomédica (núcleo de subvención). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La asociación del virus del papiloma humano genital (VPH) con el cáncer de cuello de útero (CaCx) es fuerte e independiente de otros factores de riesgo, como se desprende de los hallazgos consistentes registrados a partir de estudios epidemiológicos llevados a cabo en varios países [1]. Aproximadamente el 50% de los casos están causados por CaCx HPV16 [2], [3]. También en la India, la infección por VPH 16 es el tipo más predominante asociado con CaCx [4] - [6] y es también el tipo más frecuente identificado en la población general sobre la base de los datos disponibles de algunas regiones de la India [5] - [9].
Durante la fase de la infección transitoria, forma episomal de HPV se replica junto con los diferenciación de las células epiteliales de la membrana basal a la zona superficial, y las partículas virales están en él arrojar fuera junto con las células epiteliales descamadas-off [10] . Sin embargo, la neoplasia cervical de alto grado parece estar caracterizado por la expresión de genes virales desregulado y el ciclo de vida abortiva del virus [11]. Por lo tanto, el potencial de transformación de los VPH es probable que se correlaciona con el potencial de la desregulación de la expresión de proteínas virales clave [12] - [14], así como, con la capacidad de evitar el ataque inmunitario por el anfitrión con el fin de persistir dentro de el anfitrión epitelio cervical [15].
la integración de los genomas virales en el genoma del huésped, principalmente en sitios frágiles [16], [17], afecta a varias vías celulares de la maquinaria del ciclo de la célula huésped. Esto conduce a la interrupción del gen E2 viral, más comúnmente en la región que codifica para la región bisagra de la proteína HPV16 E2. En ausencia de represión impulsada por el E2, E6 y E7 están sobreexpresados, impulsando así a las células infectadas hacia la transformación. Por el contrario, nuestro estudio [18], así como algunos otros [19], han identificado que una considerable proporción de individuos con CaCx puerto intacta gen E2 [20]. Esto podría ser o bien puramente intacta (episomal) o concomitante, es decir, una mezcla de intacta (episomal) y formas alteradas (integrado). Tales observaciones, apuntan hacia la plausibilidad biológica de la carcinogénesis cervical bajo el impacto de HPV16 E2 gen intacto o genomas virales intactas, en oposición a la interrupción o la integración E2.
En una mayor exploración de nuevos paradigmas de HPV16 relacionados CaCx patogénesis bajo el impacto de los genomas virales episomales con genes E2 intactos, se realizó genoma amplia secuenciación de genomas virales tales casos dentro CaCx y muestras no malignas, excluyendo inicialmente el gen E1 [21] y, posteriormente, la incorporación de E1 en este estudio. Por lo tanto, se generaron datos de la secuencia de todo el genoma HPV16. La variante europea (E, 86.32%) fue el más prevalente en nuestra población, tanto entre los controles, así como de los casos, seguido de variantes de origen asiático (AA, 13,68%), lo que hemos grabado sólo entre los casos.
polimorfismos de nucleótido único (SNP) nonsynonymous se consideran funcional porque dan lugar a cambios en el nivel de aminoácidos que podrían influir funcionalmente las proteínas. Nuestro análisis anterior [21] se centró en tales variaciones dentro de la E variante haplotipo más común E-12, basado en la base de datos SIFT. Este estudio reveló que las variaciones perjudiciales poco comunes en los genes implicados en la infección productiva (L1, L2, E2 y E5), el E-12 de fondo haplotipo de HPV16 intacta aísla, podrían ser de relevancia causal para el desarrollo CaCx. variaciones sinónimas, por otro lado, también podrían influir en la expresión de genes virales mediante la modulación de los patrones de uso de codones [22].
Estudios anteriores de nuestro grupo también han proporcionado una idea de la importancia biológica de las regiones no codificantes del HPV16, tales como la participación de variación de nucleótidos dentro de E2BSIV en el LCR [18], la metilación de CpG dentro de E2BSI /II en el LCR [23] y de la repetición expansiones dentro de NCR-2 [21] en la patogénesis de los cánceres cervicales albergar HPV16 intacta genomas. Nuestro objetivo era el presente documento para volver a investigar los polimorfismos de nucleótido único (SNP) dentro de todo el genoma de HPV16, incorporando el gen E1, entre HPV16 episomal aísla dentro de las muestras no malignas y casos CaCx. En particular, destacamos en la determinación de la asociación de variantes sinónimo de en el genoma de HPV16 intactos en su caso, con CaCx patogénesis y la identificación de los genes que albergaba tales variaciones, en vista de su importancia biológica. Además, exploramos la posibilidad de que el nucleótido variaciones dentro de las regiones no codificantes, específicamente las regiones no traducidas de los genomas de HPV16 son biológicamente relevantes, así, aparte de los que dentro de las regiones codificantes.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Todas las muestras, malignas y no malignas, se obtuvieron de los sujetos con el consentimiento informado por escrito aprobado por el comité ético institucional para la experimentación humana del Instituto de estadística de la India, Calcuta, India.
las muestras y los sujetos
los detalles relativos a los sujetos, muestras, aislamiento de ADN, la detección del VPH y la determinación del VPH 16, se describen número de copias de E2 y el estado de interrupción en detalle en nuestros estudios anteriores [8], [18], [20] , [21], [23], [24]. Se analizaron muestras de ADN que comprenden de un panel de HPV16 casos positivos malignos (n = 94) y controles citológicamente normales positivos HPV16 (n = 29), que se denota aquí como HPV16 muestras no malignas positivas. De estos, 70 muestras malignas y 25 muestras no malignas se han incluido de nuestro informe anterior sobre los datos de secuencia de HPV16 y sin los datos en el gen E1 [21]. Las muestras malignas se caracterizan por la edad mediana de 50 años (rango = 27-60 años) y las muestras no malignas por edad mediana de 34 años (rango = 27-80 años).
Todas las muestras malignas (histopatológico confirmó los carcinomas de células escamosas invasivos y con diagnóstico clínico de fase III del tumor y por encima según la clasificación de la FIGO y la mayoría fueron diagnosticados de carcinoma de células escamosas como moderadamente diferenciado patológicamente) se derivaron de los sujetos casados. Las muestras no malignas fueron raspados cervicales normales confirmados por la prueba de citología vaginal y derivados de las mujeres casadas y no embarazadas (o, 6 meses después del parto) sin antecedentes de displasia cervical /malignidad. Algunas de las muestras de este grupo fueron confirmados histológicamente las biopsias cervicales normales derivadas de las mujeres sometidas a histerectomía por diversos motivos distintos de cánceres como el prolapso uterino, fibroma, quistes, etc., y sin ningún tipo de antecedentes de displasia cervical /malignidad.
re-secuenciación del genoma HPV16
la re-secuenciación de los genomas de HPV16 se limita a personas de muestras (no malignas y los casos) que albergan genomas virales intactas en base a (i) gen E2 intacto tal como se determina en el ADN nivel por PCR de todo el gen E2 [18] y (ii) de ensayo Taqman para la estimación del número de copias de genes E2 y E6 (episomal, cuando E2 /ratio≥1 E6 y mezclado o concomitante, cuando 0 & lt; E2 /relación de E6 & lt; 1 ) [20].
Quince conjuntos de cebadores superpuestos se utilizaron para la re-secuenciación del genoma HPV16. De estos, las secuencias de cebadores y condiciones de PCR para once juegos se describieron anteriormente de nuestro laboratorio [21]. Además de estos, se utilizaron cuatro conjuntos de cebadores superpuestos que abarca toda la región del gen E1. Los detalles de las secuencias de cebadores y condiciones de PCR para el gen E1 se describen en la Tabla S1. Re-secuenciación de los genomas intactos HPV16 se realizaron como se describe anteriormente [21] en un secuenciador automático ABI Prism ™ 3100 utilizando la química de terminación de colorantes. Las secuencias de ADN se analizaron utilizando el paquete de PolyPhred (http://droog.mbt.washington.edu/PolyPhred.html) y la secuencia HPV16R se utilizó como referencia en las alineaciones [25]. La identificación de variantes raras y eliminación de las posibilidades de errores de secuenciación se realizaron de acuerdo con el informe previo de nuestro grupo [21].
identificación de variaciones sinónimo biológicamente relevantes dentro de las regiones del genoma que codifica HPV16
La variaciones sinónimos dentro de los ORFs de HPV16 se determinaron a partir de análisis de datos de secuencia. La frecuencia de uso de codones y aminoácidos debido a las variaciones sinónimas se identificó basa en el programa "gráfica de uso de codones Analyzer (gCua) disponible en http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html y finalmente codones humanizado dentro del HPV16 se identificaron los ORF.
identificación de las variaciones biológicamente relevantes dentro de las regiones no codificantes del genoma HPV16 (corto región no codificante NCR2 entre E5 y L2)
Nucleótido variaciones en la región no codificante importante de HPV16, es decir, la LCR se analizaron y se informó anteriormente [18]. En la presente comunicación, nuestra atención se centró en la región no codificante corta, NCR2, entre las regiones E5 y L2 de HPV16 en vista de la posible participación de esta región en la regulación de la expresión de L2 [26]. Se ha identificado recientemente que los miRNAs de acogida son capaces de afectar a los ciclos de vida virales, tropismo viral y la patogénesis de las enfermedades virales [27]. Por lo tanto, el uso de software RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/), se identificaron los genes miARN sitios dentro de la NCR2 del HPV16 aísla y pérdida de tales sitios de unión de unión, en su caso, bajo el impacto de las variaciones de nucleótido único. Nosotros confirmamos aún más la pérdida de dicha unión, empleando miRBase [28].
aislamiento de ARN y ADNc preparación
Total de ARN, se aislaron a partir de las muestras de tejido cervical, se purificó y se trató con DNasa I usando el kit Qiagen RNeasy siguiendo el protocolo del fabricante. Un microgramo de ARN total de cada muestra se transcribió de forma inversa usando el cebador (dT) 17-P3, es decir, un oligo (dT) 17-primer acoplado a una secuencia de engarce (5'GACTCGAGTCGACATCGA TTTTTTTTTTTTTTTTT 3 ') [29] en un 20 l de mezcla de reacción. En breve, cada muestra de ARN se mezcló con 400 ng de oligo (dT) -P3 imprimación y se incubó a 70 ° C durante 10 minutos. La mezcla (10 l) fue rápidamente enfriada en hielo y luego se mezcla con un volumen igual de una mezcla de 2X tampón de transcriptasa, dNTPs mM 8 (con DTT), inhibidor de 20 U de RNasa y 50 U MultiScribe ™ transcriptasa inversa (de alta capacidad de cDNA inversa inversa kit de transcripción, Applied Biosystems) y transcripción inversa a 42 ° C durante 60 minutos, seguido de inactivación a 70 ° C durante 10 minutos. reacción de transcripción inversa, con el ARNm y todos los reactivos, pero no la transcriptasa inversa, se realizó para las muestras como controles negativos.
análisis basado en PCR cuantitativa de la expresión de mRNA L2
La expresión L2 ARNm se determinó por PCR cuantitativa (QRT-PCR) en la plataforma ABI 7900 HT PCR, siguiendo la cuantificación relativa de la expresión ACTB. Para este ensayo, se usó 100 ng de ADNc en una mezcla de reacción 10 l con
Potencia
SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) y 25 ng de ambos hacia adelante (L2 (3) F: 5 'TAT GGA AGT ATG GGT GTATTT T 3 ') y atrás primers (L2 (1) R: 5' ATC TGG GGG AAT GGA AGG T 3 '). expresión ACTB también se cuantificó mediante PCR en tiempo real en un volumen de reacción de 10 l que incluye 100 ng de cDNA y 25 ng de avance (ACTB RTF: 5 'ATCCGCCGCCCGTCCACAC 3') y los cebadores (ACTB RTR: 5 'TGCCGTGCTCGATGGGGTACT 3') revertir. expresión ACTB sirvió como control interno para asegurar la integridad de la muestra total de ARN. se realizó análisis de la curva de disociación, con el fin de descartar la aparición de amplificación no específica y la formación de dímeros del cebador. El PCR-controles fueron NTC (control no molde), así como partes alícuotas separadas de reacciones de transcripción inversa con (i) todos los reactivos excepto mRNA, (ii) mRNA y todos los reactivos, pero no la transcriptasa inversa, y (iii) HPV-negativos celular ARNm
El análisis por inmunotransferencia de expresión L2
Las muestras de tejido (aproximadamente 10 mg) se homogeneizaron en 100 l de hielo frío tampón de lisis de proteínas (30 mM Tris HCl;. pH = 7,5, MgCl 1 mM
2, mM EGTA 1, 0,67% β-mercaptoetanol, 0,5% de CHAPS, 10% de glicerol y 0,5% de Triton X100) que contiene cóctel inhibidor de la proteasa (Roche). Después de la incubación durante la noche a 4 ° C con agitación, y posterior centrifugación a 12.000 rpm a 4 ° C durante 20 minutos, se recogió el sobrenadante y se estimó por el ensayo de Bradford (Biorad Hercules, CA) según el protocolo del fabricante. Treinta microgramos de todas las muestras de proteínas se hicieron correr sobre SDS PAGE 12,5% por duplicado y después se transfirió a membranas de PVDF. Después del bloqueo no específica, la membrana se trató con 3:5000 dilución de ratón L2 anticuerpo primario (Santa Cruz Biotechnology, sc-65709; producido contra los aminoácidos 40-150 de HPV16 L2) la noche a 4 ° C. Después del lavado, la membrana se trató de nuevo con anti-ratón anticuerpo secundario (dilución 1:5000, cabra anti-IgG de ratón-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) a 37 ° C durante 2 horas y 30 minutos. La expresión de la proteína L2 se detectó mediante ensayo basado en quimioluminiscencia, después de lavar la membrana. Expresión de la proteína ACTB se determinó como control interno. Ratón monoclonal ACTB anticuerpo primario (dilución 2:5000, Abcam, ab6276) y anti-ratón anticuerpo secundario (dilución 1:5000, cabra anti-IgG de ratón-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) se utilizaron para los análisis de expresión de la proteína ACTB . El análisis densitométrico de cada banda de L2 y ACTB se realizó con el programa J IMAGEN (http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/index.html). expresión de la proteína L2 se representa en términos de densidad relativa de cada banda de L2 normalizaron con la banda de proteína correspondiente ACTB (área de la banda de proteína L2 /área de la banda de proteína ACTB).
Cuantificación relativa de miRNAs maduros por TaqMan miARN PCR en tiempo real
se llevaron a cabo ensayos para TaqMan miRNA miR-548A-5p y miR-548d-5p, empleando ADNc preparadas a partir de muestras de ARN total, usando cebadores específicos de los genes miARN TaqMan miRNA ensayos y reactivos de TaqMan® Mirna transcripción reversa Kit (ABI; Cat#4366596). Los 15 l reacciones de transcripción inversa consistieron en 10 ng de RNA total, 5 U de la transcriptasa inversa MultiScribe, 0,5 mM de cada dNTP, 1 x tampón de transcripción inversa, 4 inhibidor de la U de RNasa, y agua libre de nucleasa. Esto se realizó a 16 ° C durante 30 min y a 42 ° C durante 30 min, terminado en 85 ° C durante 5 min. Por PCR en tiempo real de TaqMan MiRNA ensayos, se utilizó 0,5 l de 20 × TaqMan Mirna Ensayo Primer, 1,33 l de cDNA diluido, 5 l 2 × TaqMan PCR Universal Master Mix y 3,17 l de agua libre de nucleasa. El programa de PCR en tiempo real incluye desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 segundos y recocido a 60 ° C durante 1 minuto. Los controles de PCR fueron NTC (control sin plantilla). Cada ensayo se realizó al menos dos veces, con tres repeticiones por muestra en cada ensayo, en placas de 96 pocillos ópticas MicroAmp usando un sistema de PCR HT 7900 (ABI). expresión relativa de los miRNAs se calcularon utilizando RNU6b (ensayo de control TaqMan miARN) como control endógeno, y calibrado de las muestras de control.
análisis estadísticos
La asociación de los distintos cambios de nucleótidos dentro de la genoma viral, con CaCx patogénesis, se determinó mediante la prueba de chi-cuadrado según el caso. Para ello se compararon entre los casos y el grupo no maligna después de ajustar por el tamaño de los respectivos ORF. Falso descubrimiento tasas de 0,05 se obtuvieron para corregir las múltiples pruebas utilizando el Benjamini y el método de Hochberg [30] .La diferencia en el porcentaje de codones humanizados y SNPs en NCR2 entre casos CaCx y muestras no malignas, y entre AA y E variantes fue también se determinará mediante la prueba de chi-cuadrado. expresión de ARNm de L2 y el análisis basado densitometría de L2 de datos de expresión de proteínas se expresaron como media ± desviación estándar. Se realizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar si las variables de prueba como expresión de ARNm y proteína L2, siguieron una distribución normal. Se utilizó dos muestras t-test para identificar la asociación del fenotipo de la enfermedad con las variables que siguieron una distribución normal. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Se realizó un análisis de regresión lineal para determinar la asociación del número de copias de E2 con expresión L2 mRNA. Los diagramas de caja se construyeron para observar la diferencia en la distribución de miRNAs expresiones entre las distintas categorías de muestras cervicales. Kolmogorov-Smirnov prueba identificado miRNAs expresión como una variable no seguir una distribución normal. Por lo tanto, la prueba no paramétrica (U de Mann-Whitney U test) se realizó para estudiar la asociación de la expresión de miRNAs con el fenotipo de la enfermedad. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando paquetes de software SPSS (versión 16.0 para Windows) y R (www.r-project.org)
Resultados
variaciones de nucleótidos dentro de ORF de E1:. Tipo y la frecuencia
las variaciones de nucleótidos dentro de los ORF de genoma HPV16, a excepción de E1, se ha informado anteriormente de nuestro laboratorio [21]. variaciones de nucleótido único se registraron a 20 posiciones dentro de ORF de E1 (Tabla 1). De las variaciones de un solo nucleótido, 19 eran cambios bi-alélica de restricción de uno, lo que era tri-alélica. La frecuencia de las variaciones osciló entre 0,01 y 0,45 y sobre la base de las frecuencias de alelos menores (MAF) fueron clasificados como polimorfismos (MAF≥0.05) y variaciones de baja frecuencia (MAF & lt; 0,05). De las 20 variaciones dentro de la ORF, había 9 (45%) variaciones no sinónimos y 11 (55%) variaciones sinónimo distribuidas por todo el gen E1.
cambios de aminoácidos No sinónimo a través de todos ORFs de genoma HPV16
Más temprano, nos registraron 110 variantes no sinónimas distribuidos a través de los ORF de HPV16, exceptuando E1 [21]. Tales variaciones no han sufrido modificaciones, incluso después de aumentar el tamaño de la muestra de 70 casos y 25 muestras no malignas. Por lo tanto, todo nuestro análisis de la secuencia del genoma de HPV16 genomas virales intactas reveló un total de 119 variantes no sinónimas. El porcentaje de tales variaciones dentro de E1 no fue significativamente diferente entre los casos (0,08%) y las muestras no malignas (0,11%). correcciones múltiples pruebas se realizaron, después de incluir las variaciones no sinónimos dentro de E1 ORF junto con las de los otros ORFs. Tal re-análisis confirmó que el porcentaje de variación no es sinónimo de L2 ORF fue significativamente mayor en los casos, en comparación con el grupo de HPV16 no maligno positivo (Tabla 2).
cambios de aminoácidos sinónimos y humanizados codones a través de las distintas ORFs de genoma HPV16
Un total de 124 variaciones sinónimas se registraron distribuye a través de las regiones codificantes de los genomas de HPV16 aislados intactos. El porcentaje de variaciones sinónimo fueron significativamente mayores en los casos en comparación con las muestras no malignas para E6 (casos = 0,104%, las muestras no malignas = 0,026%, P = 0,014), E5 (casos = 0,296%, las muestras no malignas = 0,064 %, p = 0,001) y L2 (= 0,22% de los casos, las muestras no malignas = 0,121%, p = 0,0002) ORFs (Tabla 3). Se llevó a cabo un análisis más detallado, con la función gCua (http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html), para identificar los codones humanizados dentro E5, E6 y L2 ORF bajo el impacto de las variaciones sinónimos.
Hubo 25 codones humanizados en L2 y 2 tales codones en tanto E5 y E6 (Tabla S2). Se observó que todos los 25 (100%) codones humanizados identificados dentro de L2 ORF de las muestras analizadas, fueron albergadas por casos CaCx, mientras que 8 de los 25 (32%) fueron albergado por HPV16 muestras no malignas positivas. Así, la frecuencia de los codones humanizados en L2 ORF fue significativamente mayor (p = 3.87105E-07) en los casos CaCx, en comparación con HPV16 muestras no malignas positivas. No se encontraron diferencias significativas en las frecuencias de codones humanizados en E5 y E6 ORF, entre los casos CaCx y HPV16 muestras no malignas positivas (Tabla 4).
Hemos clasificado aún más el HPV16 aislados intactos en E. y AA variantes siguiendo un esquema de clasificación como se informó anteriormente de nuestro laboratorio [21]. Tras la inclusión de muestras adicionales en este estudio no hemos podido registrar variantes AA entre las muestras no malignas, mientras que entre los casos CaCx intacta E2, la proporción de AA y E variantes fue de 18,6% (13/70) y 81,4% (57 /70), respectivamente. Por lo tanto, hemos hecho un intento de comparar AA y E variantes en términos de codones humanizados en L2 ORF entre los casos CaCx solamente. Nuestro análisis reveló que todas las variantes AA (13/13 100%) albergaban codones humanizados en la región L2 mientras que sólo algunas variantes E (13/57, 22,8%) albergaban tales codones y esta diferencia fue estadísticamente significativa (p = 2.02E-7) . El número de codones humanizados también era claramente diferente entre las dos variantes. Característicamente, cada variante AA albergaba 4-6 codones humanizados en contraste con cada variante E que albergaba ninguno o un máximo de 2 codones humanizados.
Expresión diferencial de ARNm L2 entre los casos CaCx albergan episomal (puro o concomitante) y HPV16 genomas integrados
En nuestro estudio anterior, se confirmó la integridad del gen E2 mediante el análisis de la presencia de la transcripción viral (E7-E1∧E4) que produce el represor E2, por APOT (amplificación del virus del papiloma oncogénicos transcripción) -junto-cuantitativa-RT-PCR de E7 y E4 (anidada para el gen E2) genes [31]. Basado en tales análisis, las muestras se clasificaron como episomal puro o concomitante (episomal e integrado) con genes E2 intactos, y se integran con los genes E2 interrumpidas. El estudio [31] también reveló que estos dos tipos de cánceres diferían en la expresión de E7 y E2 mRNAs. Por lo tanto, se determinó la expresión de ARNm de L2, mediante PCR cuantitativa en tiempo real el 23 de HPV16 casos positivos concomitantes CaCx episomal /, y se compararon los datos con los de 11 casos CaCx integrados. No expresión L2 se registró entre los casos integrados, en oposición a distinta expresión L2 mRNA en episomal /casos CaCx concomitantes (Figura 1), que era bastante similar a la registrada en el caso de la expresión de E2 en nuestro estudio anterior [31]. Todas las muestras analizadas, interpretado la expresión de transcripciones de ARNm de ACTB como control interno. Un análisis más detallado no reveló significativa (p = 0,224, t-test) diferencias en la expresión L2 ARNm entre AA [media (L2 C
T /ACTB C
T) ± SD = 0,834 ± 0,127] y E [media (L2 C
T /C ACTB
T) ± SD = 0,904 ± 0,128] variantes (Figura 2). La relación, L2 C
T /ACTB C
T, también se encontró una correlación significativa con el número de copias E2 (p = 0,004; r
2 = 0,336) en los casos episomal CaCx (Figura 3 ), lo que justifica la expresión de L2 de los genomas virales episomales.
(a) amplificación parcela basado en PCR cuantitativa en tiempo real de la expresión de HPV16 L2. L2 se transcribe en E2 intacto /episomal (episomal o concomitante) pero en casos E2 interrumpidos /integrados. curva (B) La disociación que representa la primera derivada de curvas de fusión para la reacción de la caracterización de la expresión de L2 (Tm de 80,5 ° C). (C) La amplificación parcela basado en PCR cuantitativa en tiempo real de la expresión ACTB. ACTB se expresa por tanto episomal y los casos positivos HPV16 integrado. (D) curva de disociación que representa la primera derivada de curvas de fusión para la reacción de la caracterización de la expresión de ACTB (Tm de 81,0 ° C).
relativa expresión L2 ARNm está representado por la media L2 C
T /C ACTB
T.
La expresión diferencial de la proteína L2 entre los casos que albergan CaCx episomal (puro o concomitante) y HPV16 genomas
, se determinaron la proteína L2 integrada la expresión mediante análisis de inmunotransferencia, en un subgrupo de 12 casos CaCx (integrado o E2 interrumpido casos CaCx = 4, episomales de Asia o de casos CaCx intacta E2 = 3 y los casos CaCx intacta E2 episomal Europea o = 5) a partir del conjunto que se utilizó para análisis de expresión L2 mRNA. expresión L2 se registró entre los casos episomal CaCx, AA y la variante E aísla, mientras que dicha expresión no se pudo identificar entre los casos CaCx integrados (Figura 4). Todas las muestras CaCx, independientemente de episomal o integrado, retrataron la expresión de la proteína ACTB (control endógeno). El estado de los codones humanizados dentro de la AA y la variante E aísla de muestras que revelan la expresión de la proteína L2 se representa en la Tabla 5. expresión de la proteína L2 se cuantificó por análisis densitométrico de los resultados de inmunotransferencia por el software J IMAGEN (http: //rsb.info.nih. /ij /docs /index.html) y no hubo diferencia significativa (p = 0,562, t-test) se registró entre AA [(área de la banda de proteína L2 /área de la banda de proteína ACTB) ± SD = 2,66 ± 1,85] y gov variantes E [(área de la banda de proteína L2 /área de la banda de proteína ACTB) ± dE = 1,95 ± 0,61] como aparece en la Figura 5.
El panel superior representa la expresión L2. Los carriles 1 y 2: HPV16 positivos muestras E2 interrumpido /caso CaCx integrado (D1 y D2); Los carriles 3, 5 y 7: HPV16 positivo E2 intacto /episomal (episomales o concomitantes) variantes europeas (EV1, EV2, EV3, respectivamente); Las calles 4, 6 y 8: HPV16 E2 intacto /episomal positivo (episomal o concomitante) variantes de origen asiático (AAV3, AAV2, VAA1, respectivamente). Panel inferior representa la expresión ACTB entre todas las muestras analizadas. Detalles de las muestras se ilustran en la Tabla 5.
miARN sitios de unión en la región no codificante corta (NCR2) y la pérdida de tales sitios de unión debido a la presencia de SNPs en el NCR2 de CaCx casos
Una región no codificante corta (NCR2) existe comúnmente entre los marcos de lectura abierta E5 y L2 de HPV. NCR2 se caracteriza por una actividad promotora débil que está estrechamente regulada por la diferenciación de queratinocitos y se utiliza sólo para las transcripciones que codifican la proteína de la cápsida menor L2 de HPV16 [26]. Otro estudio informó de 13 transcripciones de HPV16 en línea cervical de células epiteliales W12 (HPV16 genomas albergar episomales), de los cuales, se encontraron 6 transcripciones para abarcar el NCR2 y L2 [32]. En vista del hecho de que los casos CaCx que albergan genomas episomal HPV16 también expresaron el gen L2, nos centramos en el desciframiento de los factores que podrían estar asociados con la expresión de L2 en tales casos CaCx. Al utilizar el software RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/), se identificaron los sitios de unión en la NCR2 (nt 4139 hasta 4234) de HPV16 aislados intactos, lo que corresponde a 14 miRNAs humanos (HSA-MIR-3148, HSA -miR-3174, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-3916, hsa-miR-495, hsa-miR-548A-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-548C-5p, HSA -miR-548d-5p, hsa-miR-548h-5p, hsa-miR-548i-5p, hsa-miR-548j-5p, hsa-miR-548w-5p, hsa-miR-548y-5p) (Figura 6 ). Tales sitios de unión miARN se seleccionaron sobre la base de mínima energía libre (MFE≤7) y la puntuación de hibridación (≥140) (Tabla S3) según los estándares normalmente utilizados para la formación de los genes miARN: mRNA híbrido. Nuestros datos resequenced revelaron la presencia de un SNP (T4228C) (Figura S1) en la variante NCR2 de E intacta aislamientos única, lo que podría conducir a la pérdida de 9 puntos de unión miARN en las transcripciones correspondientes (HSA-mir-548A-5p, HSA -miR-548b-5p, hsa-miR-548C-5p, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-548h-5p, hsa-miR-548i-5p, hsa-miR-548j-5p, HSA-mir -548w-5p, hsa-miR-548y-5p) (Figura 6), todos los cuales pertenecía a la familia de hsa-miR-548 de miRNAs. Curiosamente, la proporción de casos CaCx intacta E2 (54/70, 77%) que albergan SNPs en los sitios de unión dentro de la miARN NCR2 fue significativamente mayor (p = 0,007) en comparación con la de muestras no malignas (12/25, 48%) . Dentro de los casos CaCx intacta E2, también se observó que ninguna de las variantes AA (0/13, 0%) albergaba un SNP en los sitios de unión de genes miARN en el NCR2. Por lo tanto, no se observó pérdida de miARN sitios en el NCR2 unión en variantes AA.
(A) representa los NCR2 (posiciones de nucleótidos 4139-4236) situadas dentro de 5 'UTR del gen L2, con un polimorfismo de nucleótido (SNP) en la posición 4228 (T a C). basado identificación (B) de software RegRNA de catorce sitios de unión dentro de miARN NCR2 con la pérdida de sitios de unión correspondientes a los nueve miRNAs (
*) del hsa-miR-548family debido a la SNP (T4228C).
estudio previo de nuestro laboratorio [21] reveló la aparición de variaciones dentro de la repetición NCR2.