Extracto
Se presentan los resultados de un estudio global de miRNAs desregulados en muestras pareadas de mucosa normal y tumoral de ocho pacientes con cáncer colorrectal. Aunque no hay datos existentes de la contribución de los genes miARN a la tumorigénesis colorrectal, estos estudios suelen ser pequeñas a mediana escala estudios de líneas celulares o muestras de tumor no apareados. El presente estudio es único en dos aspectos de nuestro conocimiento. En primer lugar, las muestras de tejido tumoral y normales adyacentes están emparejados, teniendo así en cuenta las diferencias iniciales entre los individuos cuando las pruebas de expresión diferencial. En segundo lugar, utilizamos secuenciación de alto rendimiento, lo que permite un estudio exhaustivo de todos los miRNAs expresados en los tejidos. Utilizamos tecnología de secuenciación de Illumina para llevar a cabo la secuenciación y dos herramientas diferentes para estadísticamente las pruebas para las diferencias en los recuentos de lectura por gen entre las muestras: bordeadora cuando se utiliza la información de par y DESeq cuando se ignoran esta información, es decir, el tratamiento de grupos independientes como muestras tumorales y normales. Identificamos 37 miRNAs que se dysregulated significativamente en ambos enfoques estadísticos, 19 de las reguladas y 18 hasta regulada. Algunos de estos miRNAs son publicados previamente como posibles reguladores en los adenocarcinomas colorrectales, tales como miR-1, miR-96 y miR-145. Nuestra amplia encuesta de miRNAs expresados diferencialmente por lo tanto confirma algunos hallazgos existentes. También hemos descubierto 16 miRNAs desreguladas, que a nuestro entender no han sido previamente asociados con la carcinogénesis colorrectal: Los siguientes significativamente las reguladas miR-490-3p, -628-3p /-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5p, -3656 y el regulado hasta el miR-105, -549, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -3180-3p, -4326. Aunque el estudio es preliminar con sólo ocho pacientes incluidos, creemos que los resultados se suman a los conocimientos actuales sobre la desregulación de los genes miARN en la carcinogénesis colorrectal. Como tal, los resultados servirían como un robusto conjunto de entrenamiento para la validación de biomarcadores potenciales en un estudio de cohorte más amplia. Finalmente, también se presentan datos que apoyan la hipótesis de que existen diferencias en la expresión de los genes miARN entre los adenocarcinomas y tumores neuroendocrinos de colon
Visto:. Hamfjord J, Stangeland AM, Hughes T, Skrede ML, Tveit KM, Ikdahl T , et al. (2012) Expresión diferencial de miRNAs en el cáncer colorrectal: Comparación de la pareja de tejido tumoral y normal adyacente mucosa Uso de Alto Rendimiento de secuenciación. PLoS ONE 7 (4): e34150. doi: 10.1371 /journal.pone.0034150
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 6 Septiembre, 2011; Aceptado: February 23, 2012; Publicado: 17 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Hamfjord et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación externa recibido de "agujeros Ivar, Ragna og Morten Legat hasta fremme av kreftforskningen i Norge" (Ivar, Ragna y Fundación Morten agujeros "para servir a la investigación del cáncer en Noruega). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más frecuentes en todo el mundo [1]. El pronóstico depende del estadio del tumor en el momento del diagnóstico. Existe una gran atención en el descubrimiento y validación de los marcadores de detección temprana, así como de factores predictivos y pronósticos tal como fue revisado por Asghar
et al
. [2]. La génesis molecular de CRC está entre los mejores descrita de todos los cánceres humanos. El modelo Vogelstein [3] tiene en los últimos años han modificado y ampliado, como se ejemplifica por Slaby
et al
. [4].
Los microARN (MIR) son pequeñas moléculas de ARN no codificantes 18-25 nucleótidos de longitud, descubrió por primera vez a principios de 1990 en
C. elegans
[5]. Mantienen homeostasis mediante la alteración de la expresión génica en diferentes procesos celulares, tales como la diferenciación, la proliferación, la supervivencia y la apoptosis [6]. Se estima que más de 10% de todos los genes humanos que codifican proteínas puede ser regulado por estos mecanismos [7]. El último número de MIR humanos registrados en miRBase supera un [8], y el uso creciente de secuenciación de alto rendimiento está impulsando el descubrimiento de más de mil. Los estudios también han demostrado que miRs puede dysregulated en diferentes cánceres humanos, y por lo tanto actuar como supresores de tumores u oncogenes [9], [10]. Estas moléculas son interesantes ya que pueden ser potenciales biomarcadores de diagnóstico o pronóstico y actuar como dianas potenciales en la terapia específica del cáncer tal como fue revisado por Cho
et al
. [11], [12]. El objetivo final sería la medicina personalizada con el cáncer de redes genotipo-fenotipo como el plan de trabajo para las decisiones clínicas [13].
Muchos estudios se han centrado en la expresión de miR en el cáncer colorrectal. La mayoría de estos estudios han analizado un número más pequeño de miRs utilizando la reacción en tiempo real cadena de la polimerasa (PCR) o la tecnología basada en la hibridación, en parte, de líneas de células o tejidos no apareados de pacientes [14], [15], [16], [17 ], [18]. Sólo unos pocos estudios han secuenciado más global MIR en una escala más grande para el perfil de expresión, como el estudio sobre el melanoma [19] y de colon [20] microRNAome. El último estudio fue único en su género y presenta un conjunto de nuevos MIR putativos mediante el uso de un enfoque experimental llamado Mirage. Sin embargo, como este estudio data de varios años atrás, sólo un subconjunto de miRs maduros conocido hoy fue investigado activamente.
expresión global de MIR tradicionalmente se ha evaluado el uso de tecnologías de matriz basada en la hibridación. Estas matrices se basan en la hibridación específica de secuencia después de marcar con un colorante fluorescente. La intensidad de fluorescencia se registra y refleja la expresión de un gen dado. Mediante el uso de múltiples colorantes, la diferencia en la fluorescencia se puede utilizar como un índice de la expresión génica. la secuenciación de alto rendimiento, por otra parte, utiliza las transcripciones de la muestra como molde de partida. La secuenciación directa se realiza a continuación, con una serie de reacciones que utilizan nucleótidos terminadores fluoróforo. Secuencia lee a continuación, se asignan de nuevo a la referencia del genoma o una base de datos de las transcripciones y el número de la secuencia lee mapeo de nuevo a una transcripción específica es una medida de la expresión génica. En el caso general de ARNm, este conteo necesita ser normalizado por la longitud de la transcripción y el número total de lecturas generado para la muestra. En el caso del MIR, no es necesaria la normalización para la transcripción de longitud como las lecturas cubre la longitud completa de la transcripción. La expresión diferencial se mide por la diferencia en los recuentos normalizados para un determinado gen. Una publicación reciente compara la expresión diferencial de genes en
D. Pseudoobscura
cuando se utiliza la tecnología de matriz y secuenciación de alto rendimiento. La mayoría de los niveles de expresión son similares entre los métodos con un rendimiento comparable [21]. Un estudio similar sobre
S. cerevisiae
ha demostrado que los métodos coinciden bastante bien para los genes con niveles medios de expresión, pero la correlación es muy baja para los genes, ya sea con niveles altos o bajos de expresión. Esto es en parte debido a la gama dinámica mucho mayor para la cuantificación de la expresión génica proporcionado por el método de secuenciación de alto rendimiento [22]. secuenciación de alto rendimiento se considera más importante, cuando se trata de la estructura y la dinámica del transcriptoma. Ejemplos de esto incluyen la expresión de secuencias desconocidas de destino, eventos de edición de ARN y otras variaciones de la secuencia de ARN, tales como polimorfismos [21], [22], [23].
Dado que estas características de secuenciación de alto rendimiento sugieren que es un método excelente para estudios mundiales de los pequeños RNAs, se incluyeron ocho pacientes con cáncer colorrectal sometidos a resección quirúrgica del colon para el estudio de los cambios específicos del tumor en la expresión de miR utilizan la tecnología de secuenciación de alto rendimiento Illumina. Los tejidos de mucosa normal y tumor se obtuvieron de muestras quirúrgicas para todos los pacientes, por lo tanto produciendo un conjunto único de pares de muestras. Nuestro análisis de las bases de datos de secuencias que hemos producido a partir de estas muestras nos permite identificar MIR que no han sido previamente asociados con los adenocarcinomas colorrectales. También hemos identificado diferencias en la expresión de miR entre los adenocarcinomas y un tumor neuroendocrino de colon. Estos resultados se suman a los conocimientos actuales sobre el miR desregulación en la carcinogénesis colorrectal.
Resultados
Ocho pacientes fueron seleccionados al azar de acuerdo con las especificaciones de género (hombres solamente) de una cohorte de cáncer colorrectal. Se extrajo el ARN total de tejido tumoral y de la mucosa normal adyacente. En el análisis preliminar de la expresión diferencial entre el tumor y la mucosa normal adyacente, un par demostró un patrón de expresión diferente del resto de los pares. La histopatología fue revisado por un patólogo (Tabla 1), y era evidente que un paciente fue clasificado erróneamente y albergaba un tumor neuroendocrino atípica (NET), mientras que el resto eran adenocarcinomas. Todos los análisis estadísticos adicionales tratan al paciente con NET como un caso separado del resto de los pacientes. Los porcentajes de células tumorales y componentes del estroma También se estimaron en hematoxilina y eosina tiñen las secciones de tumor primario, lo que demuestra que siete de las ocho muestras albergaban las células tumorales más del 60% (Tabla 1).
El 16 Las muestras fueron secuenciados con éxito utilizando Illumina Genome Analyzer II (Illumina, CA, EE.UU.) y se procesaron usando miRanalyzer [24] con un promedio de 562 miRs maduros asignados a miRBase por experimento de secuenciación cuando autoricen un nucleótido desajuste (Figura 1B). Aproximadamente el 80% de lecturas de secuenciación asigna a madurar miRs humanos en miRBase (versión 16) en diecisiete de los dieciocho corridas de secuenciación, la mayoría restante lee mapa a otras partes del transcriptoma. En la última muestra (tejido normal N7) había un porcentaje mucho menor de lecturas que mapa para miRBase (37,2% del total lee) (Figura 1A). Esto puede ser debido a problemas técnicos durante la preparación de la muestra. Por otra parte, unos pocos cientos de novela putativo de miR y secuencias de gen loci en el genoma de referencia (hsa hg18) se predice a partir de las pistas de secuenciación. Estas secuencias putativas equivalen a una pequeña fracción del total de recuento de lecturas (datos no mostrados).
Grupo A con porcentaje de lecturas de secuenciación asigna a madurar MIR (negro) del total lee por experimento. Grupo B con número de MIR maduros identificados por experimento de secuenciación. El número total de miRs humanos maduros en miRBase liberar 16 (n = 1212) se incluye como referencia.
La expresión diferencial (DE) de miRs identificados de miRBase se calculó utilizando dos herramientas bioinformáticas, DESeq [25 ] y bordeadora [26]. Bordeadora implementa la funcionalidad para realizar ambas pruebas pareadas no apareados y la información (par se ignora y normal y muestras tumorales son tratados como grupos independientes), mientras que DESeq no puede realizar pares de pruebas, pero se beneficia de refinamientos estadísticos adicionales en relación con bordeadora. El tratamiento de las muestras normales y tumorales como dos grupos independientes se predice teóricamente ser la prueba más conservadora, ya que, a diferencia de la prueba de pares, que no tiene en cuenta las diferencias iniciales entre los pacientes. Mediante el uso de ambos métodos, se obtienen dos conjuntos de miRs significativamente expresados diferencialmente. La intersección entre estos dos conjuntos es una predicción muy conservador de los miRs dysregulated significativamente. Además, hemos sido capaces de observar en qué medida la prueba no pareado es más conservador que el pareado. Se analizó el cambio primer pliegue de miRs conocidos entre los grupos de adenocarcinoma (n = 7) y de la mucosa normal (n = 8), posteriormente entre el caso neuroendocrino (n = 1) y de la mucosa normal (n = 8) usando DESeq (Figuras 2A y 2C). Al mirar los adenocarcinomas como un grupo y utilizando el ajuste de Benjamini y Hochberg [27] para múltiples pruebas (FDR & lt; 0,1), un total de 52 miRs fueron significativamente dysregulated en comparación con la de la mucosa normal: 28 se redujeron regulado y 24 hasta reguladas (Tabla S1). El caso neuroendocrino, sin embargo, demostró un total de 38 miRs disregulados significativamente en comparación con el grupo de mucosa normal, todo hasta reguladas (Tabla S2). Curiosamente, sólo 6 MIR están representados en ambos grupos histopatológicos: miR-7, -96, -204, -1269, -1827 y -3177. En este análisis no son, por tanto, un total de 46 y 32 MIR que parecen algo específico para el adenocarcinoma y neuroendocrino histopatología, respectivamente.
Esquema del enfoque estadístico. Los paneles A y C muestran enfoque utilizando estadísticas no apareados y la herramienta DESeq. El panel B muestra enfoque utilizando estadísticas pareadas y la herramienta de afinado. Véase el texto para más detalles.
Desde que estábamos examinando muestras de tumor y el tejido normal de la mucosa emparejado de los mismos pacientes, también se realizó una prueba de los siete casos de adenocarcinoma usando estadísticas pareadas en bordeadora (Figura 2B ). Se identificaron un total de 118 miRs mal regulada como significativamente en las mismas condiciones que para el análisis no pareado (Tabla S3). De ellos, había 81 MIR que no fueron identificados en el análisis no pareado, y un solapamiento común de 37 para ambos enfoques. Esto confirma la predicción de que el análisis no apareado es la prueba más conservador, aunque hay 15 miRs identificados como mal regulada en el ensayo no pareado DESeq que no fueron identificados por el análisis pareado en bordeadora (Figura 3).
es evidente que hay 37 miRs comunes que se encuentran que están alteradas significativamente al utilizar los dos enfoques estadísticos (Tabla 2). Hay aproximadamente igual distribución entre el MIR y abajo hasta reguladas. Hay dos humilde (aproximadamente 10-10 000 absoluta lecturas) y MIR altamente (aproximadamente 10 000 000 000-5 lee absolutos) expresadas representados en el subconjunto de miR común, son dos ejemplos notables de miR-7 y miR-1, respectivamente. Al mirar los niveles de expresión a nivel mundial en términos de todos los MIR identificados, hay una regulación global de la expresión en el tumor en comparación con la de la mucosa normal (considerado desde el análisis pareado de la adenocarcinomas).
La secuenciación de alto rendimiento fue validada experimentalmente usando una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa para miRs seleccionados y muestras de tejido (Figura S1). Nuestros resultados están en línea con anteriores inter-plataforma resultados de la validación [28]:. Los resultados entre los diferentes métodos se correlacionan, pero esta correlación no es perfecta
Discusión
Varios estudios han encontrado que las MIR son globalmente las reguladas en diferentes tipos de cáncer, con una correlación entre el grado de diferenciación y los niveles de expresión mundial de MIR. Aunque se ha indicado que la baja regulación mundial promueve la transformación celular y tumorigénesis [10], [15], [29], un gran estudio de perfiles de expresión de los tumores sólidos por Volinia
et al
. no observaron la baja regulación de MIR como se informó anteriormente [30]. Nuestro estudio sugiere que la baja regulación global no es el caso de los adenocarcinomas colorrectales en nuestra cohorte, a pesar de que un número considerable de miRs individuales se ha reducido regulado en los adenocarcinomas en relación con las muestras normales.
De acuerdo con la miRecords base de datos [31], el miR-1 cuenta con 117 dianas validadas y potencialmente podría interactuar con varios genes importantes en la carcinogénesis del cáncer colorrectal. En un estudio a partir de 2009, el miR-1 y miR-551b (entre otros) se encontró que tenían una menor expresión en células madre embrionarias en relación con las células diferenciadas y en el cáncer colorrectal en relación con la mucosa normal [17]. Esto es consistente con nuestros hallazgos de las reguladas miR-1 y miR-551b en los adenocarcinomas colorrectales. reguladas por el miR-1 también se observa en el caso neuroendocrino. MIR-1, que además se ha informado de que se ha reducido regulado y sugirió una función supresora de tumores por la orientación del gen transgelin 2 (
TAGLN2
) en el cáncer de vejiga [32] y de cabeza y cuello carcinomas de células escamosas [33] .
miR-145 es el regulado en los adenocarcenomas de nuestro estudio, y esto MIR frecuencia se ha asociado con la regulación por disminución en los cánceres de colon [16], [34], [35], [36] . Se cree que tiene un papel supresor de tumores, en parte por la orientación del sustrato receptor de insulina 1 similar a la insulina del receptor de factor de crecimiento (ISR-1) y el tipo I (IGF-IR). La pérdida de miR-145 de inhibición aumenta las señales anti-apoptóticas en la célula y promover el crecimiento celular [37], [38].
En un estudio a partir de 2010, el miR-195 se encontró que las reguladas en el 81 tejidos de cáncer colorrectal en comparación con la mucosa normal correspondiente y esto está de acuerdo con nuestros resultados para los adenocarcinomas. Este MIR se cree que apuntar Bcl-2 y por lo tanto ejercer su función pro-apoptótica cuando fisiológicamente regulada [39]. Otro estudio demostró que una menor expresión de miR-195 se produjeron con más frecuencia en pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos y el estadio tumoral avanzado. bajos niveles de expresión eran también pobres predictores de la supervivencia global [40].
En dos estudios menores, uno de cáncer de colon sin metástasis a los ganglios linfáticos [41] y el otro de cáncer gástrico [31], el miR-378 fue encontrado que son las reguladas en los tumores en comparación con el tejido normal adyacente como se ha visto en nuestro estudio. Sin embargo, se ha informado de que miR-378 promueve la supervivencia celular y el crecimiento tumoral por la orientación Sufu y Fus-1 [42] y también puede desempeñar un papel modificador con otros miRs en la angiogénesis [43]. No es una prueba más de que el módulo funcional Myc /miR-378 /TOB2 /ciclina D1 regula la transformación oncogénica [44].
miR-383 es también las reguladas en los adenocarcinomas en comparación con el tejido normal. Para nuestro conocimiento, este no ha sido reportado para los adenocarcinomas colorrectales, pero se ha observado en un pequeño estudio sobre el cáncer gástrico [45]. Existe una buena concordancia entre los hallazgos de miRs reguladas por en adenocarcinomas colorrectales y los informes publicados anteriormente. Así como los MIR se ha descrito anteriormente, hemos identificado un número significativo de otros miRs uniformemente reguladas por los menos, se hace referencia en la literatura; -139-5p, -363, -422a, -486-5p, -490-3p, -628-3p, -628-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5p y -3656 (Tabla 2 ). Esto pone de relieve el potencial de secuenciación de alto rendimiento como una herramienta para identificar miRs potencialmente relacionados con la carcinogénesis que podrían haberse perdido el uso de la tecnología basada en matriz.
miR-7 tiene un papel funcional en la diferenciación de las células epiteliales en el intestino , revisado por Tazawa
et al
. [46]. Se cree que regulan la expresión de CD98 de glicoproteínas transmembrana que tiene un papel importante en la adhesión celular mediante la interacción con la integrina beta-1. Sobre regulación de miR-7 suprime la expresión de CD98 en las células Caco2-BBE y de ahí modula las interacciones beta-1 integrina-laminina-1. Esto puede afectar la proliferación y diferenciación de los enterocitos durante la migración a través del eje cripta-vellosidad [47]. miR-7 se ha informado para funcionar como un supresor de tumores en schwannomas [48], pero como un oncogén en el pulmón escamoso carcinomas de células [49]. Hay pruebas de que el aumento de expresión de EGFR se asocia con un mayor nivel de miR-7, al menos en carcinomas de células escamosas. El miR-7, a su vez dirige factor de Ets2 represor (FER), atenúa la expresión de EGFR y modula el crecimiento celular [49]. Por tanto, es posible que miR-7 puede funcionar en varios bucles de retroalimentación y de alimentación hacia adelante, tanto como supresor de tumores y oncogenes dependiendo del tipo de tumor. Nuestros resultados sugieren fuertemente que el miR-7 es hasta reguladas en ambos adenocarcinomas colorrectales y en el caso neuroendocrino. Sobre la base de los resultados anteriores y publicados objetivos validados para miR-7 como
EGFR
,
PAK1
,
RAF1, IRS1 /2 Opiniones y
CD98
[ ,,,0],31], que es justo a la hipótesis de que este MIR puede estar implicada en la regulación de la señalización intracelular, el crecimiento y la diferenciación de los cánceres colorrectales
.
Las expresiones de miR-96, miR-135b y miR-493 se incrementaron en varios Los estudios sobre el cáncer colorrectal, así como en nuestro estudio [14], [17], [50]. miR-135 se ha demostrado que afectan directamente a los 3 'UTR de
APC
e inducir la vía Wnt aguas abajo [51]. Nuestros resultados también muestran que miR-552 y -592 expresiones se incrementaron en los adenocarcinomas en comparación con los tejidos normales. los datos publicados anteriormente para estos dos miRs demostraron una regulación en los cánceres colorrectales con el estado de reparación de genes competentes (MMR), pero la baja regulación de MMR tumores deficientes en relación con el tejido normal del colon [17]. Yoon
et al
observó que el miR-296 interactuó con los 3 'UTR del gen
CDKN1A gratis (p21 /WAF1), y que este era el miR con frecuencia hasta reguladas durante la inmortalización de células humanas [52]. Curiosamente, también se observa una sobre regulación de miR-296-3p. Esto podría MIR como tal contribuir a la carcinogénesis mediante la inhibición de la p53-p21 /WAF1 vía.
No hay muchas publicaciones sobre la función de miR-549 (Chr15 en
KIAA1199
), y para ninguno nuestro conocimiento en relación con el cáncer colorrectal. Curiosamente, el gen de la transcripción de este MIR se localiza en el gen
KIAA1199
. Este gen de función incierta ha sido previamente notificado a ser fuertemente regulados hasta en adenomas colorrectales (n = 32) y carcinomas (n = 25) analizados en un estudio realizado por Sabates-Bellver
et al
. El estudio también muestra que la expresión de 19 de las metas de Wnt se correlacionó estrechamente con la regulación de
KIAA1199
, y que la expresión en la mucosa normal se limita a las células en la parte inferior de las criptas colónicas [53], [ ,,,0],54]. La sobre-expresión de
KIAA1199
ha sido confirmada más tarde por adenomas de colon [55] y el cáncer gástrico [56]. Si
KIAA1199
y miR-549 son co-transcritos, esto puede explicar el aumento de los niveles de expresión de miR-549 se encuentran en nuestro estudio. Además, como la sobre regulación parece ser un evento temprano de los estudios publicados previamente, el miR-549 podría ser un biomarcador sustituto para el desarrollo de adenoma y adenocarcinoma etapas tempranas. Esto debe investigarse más a fondo en estudios más amplios.
Un estudio sobre miRs epigenetically silenciados en el cáncer colorrectal, encontró que el miR-1247 fue metilado en las células HCT116. células HCT116 y DLD1 fueron transfectadas con un mímico miR-1247 que resultó en una disminución significativa en el crecimiento celular y la actividad metabólica en ambas líneas celulares. Sin embargo células DKO (HCT 116 células eliminadas de ADN metiltransferasa) no redujo el crecimiento celular cuando se introducen en el sinóptico, pero causaron deterioro de la migración celular [57]. El papel de este MIR sigue siendo poco clara, pero se ha planteado la hipótesis de funcionar como un supresor de tumores. Encontramos este MIR ser hasta reguladas en los adenocarcinomas, lo que podría indicar diferentes objetivos en las líneas celulares puras en comparación con la de un tejido tumoral organizada.
Por último, hay pocas, o ninguna, informes sobre la función y su papel en adenocarcinomas de colon de los siguientes MIR hasta reguladas en nuestro estudio: -105, -483-3p, -584, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -4326 y -3180-3p (Tabla 2).
como hemos incluido un tumor neuroendocrino (NET) en este estudio, podríamos tomar ventaja de analizar esta separado utilizando un enfoque estadístico similar al de los adenocarcinomas. Aunque, estamos trabajando parcialmente y sin repeticiones, la herramienta DESeq puede manejar este desafío [25]. Las redes son tumores poco frecuentes que se originan a partir de células neuroendocrinas en diferentes partes del cuerpo, incluyendo el sitio gastrointestinal. Existe una incidencia creciente, en parte debido a un mejor registro y herramientas de diagnóstico, posiblemente, mejor [58]. Sin embargo, muy pocos estudios han examinado la expresión de miR en NET. En nuestro estudio, las acciones de Net unos mirs significativas con los adenocarcinomas, pero lo que es más sorprendente son algunos de los MIR únicos y altamente expresadas (Tabla S2). Estos tienen grandes cambios veces en comparación con los tejidos normales no apareados y también una expresión relativa más alta en comparación con los adenocarcinomas. El patrón de expresión de miRs en la red difiere ampliamente de la mucosa normal. Esto es lógico, puede deberse en parte al propio tejido neuroendocrino que es funcional y genéticamente diferentes de epitelio normal y el estroma. Sin embargo, la miRs identificado puede potencialmente ayudar a diferenciar entre células neuroendocrinas malignos del colon y la mucosa normal (como nuestros datos sugieren), y posiblemente también entre células neuroendocrinas benignos y mucosa normal (sin datos). El tamaño de la muestra de uno significa que los datos de la red Sólo puede considerarse indicativo. Sin embargo, en nuestra opinión, las diferencias sustanciales en los conjuntos de miRs regulados diferencialmente entre los dos tipos de cánceres merecen ser informado. Nuestra observación sugiere que puede ser fructífera para investigar más a fondo estos marcadores miR ya que pueden ser útiles para establecer el origen de los cánceres colorrectales pobremente diferenciados.
microdisección del tejido tumoral no ha sido la norma en los estudios realizados con anterioridad. Sin embargo, hemos examinado la histopatología de las muestras de tejido, y se estima que los porcentajes de tumores del estroma y. El porcentaje del tumor fue de alrededor del 67% en promedio, muy por encima de la media para un subgrupo de la cohorte KAM (n = 139), que fue del 49% +/- 24% (datos no publicados). Desafortunadamente, una muestra del conjunto de datos era aberrante con un bajo porcentaje tumor (Tabla 1), y esto es una debilidad de nuestro estudio. Lo ideal sería que las muestras de estudio deberían haber tenido una población más homogénea del tumor. Sin embargo, existe una noción de que la mucosa normal se compone principalmente de células epiteliales y estroma. Al comparar el tejido tumoral y mucosa normal, estamos comparando principalmente las células tumorales (con cantidades variables de estroma) con las células epiteliales y estroma en la mucosa normal. Como tal, creemos que el efecto de un porcentaje muy bajo del tumor será resultados falsos negativos.
En experimentos de alto rendimiento (ya sea matriz o basada en la secuencia), es común para llevar a cabo un experimento de validación utilizando otra tecnología. Se realizó un experimento de este tipo de validación utilizando una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa para MIR seleccionados y muestras de tejido (Figura S1). Los resultados muestran una correlación positiva entre las dos plataformas tecnológicas diferentes. Hay siete miRs para que las veces los cambios son muy diferentes en la validación. Estas diferencias en el factor de cambio entre plataformas tecnológicas no son inusuales, como lo demuestra un estudio de la expresión de miR diferencial utilizando las plataformas de microarrays de Affymetrix, Agilent, y Illumina, así como la PCR cuantitativa y secuenciación de alto rendimiento [28]. A pesar de la preocupación, esta observación no invalida los resultados obtenidos. De hecho, se ha observado que los métodos para MIR perfiles de expresión génica están fuertemente sesgadas hacia cierta miRs, evitando la determinación precisa de números absolutos. El sesgo observado está fuertemente determinada por el método usado para la preparación de la biblioteca. Sin embargo, puesto que los errores son sistemática y altamente reproducible para una tecnología determinada, perfiles de expresión génica es adecuado para la determinación relativas diferencias de expresión entre las muestras, siempre que la misma tecnología se utiliza a través de muestras [23]. En nuestro estudio, debido a las grandes cantidades de ADNc requerida para el análisis de secuenciación de alto rendimiento, que no tienen suficiente ADNc disponibles para la validación de PCR cuantitativa para todos los pacientes. Por lo tanto tuvimos que hacer una segunda ronda de la extracción de RNA a partir de tejido adyacente donde esté disponible. Cualquier heterogeneidad entre los tejidos adyacentes puede añadir a la variabilidad observada en los datos de validación (Figura S1).
Este estudio es único en el sentido de secuenciación de alto rendimiento global de nuestro conocimiento se ha utilizado para caracterizar la expresión de miR en apareado tejido de cáncer colorrectal y mucosa normal adyacente. Aunque preliminares, creemos que los resultados pueden servir como un robusto conjunto de entrenamiento para un estudio de cohorte más amplia. Hemos utilizado las estadísticas pareadas y no pareadas, y se identificaron 37 MIR que se dysregulated en los siete casos de adenocarcinoma en ambos enfoques estadísticos; 19 de las reguladas y 18 hasta regulada. Nuestra amplia encuesta de miRs expresados diferencialmente confirma algunos hallazgos existentes. También hemos descubierto 16 miRs desreguladas, que, a nuestro entender, no han sido previamente asociados con la carcinogénesis colorrectal. Nuestros resultados indican que estos pueden ser importantes reguladores y que las nuevas investigaciones sobre posibles objetivos de miR y su posible uso como marcadores predictivos o de pronóstico están garantizados. Particularmente interesante es el gen miR-549 situado en
KIAA1199
que a su vez ha sido previamente asociado con la regulación en los adenomas y carcinomas. Si es co-transcribió el MIR, que podría ser un marcador sustituto potencial para la detección temprana de enfermedades en los fluidos corporales o excrementos. El estudio también ha arrojado nueva luz sobre los posibles biomarcadores de miR que parecen ser específicos para los TNE en el colon.
Materiales y Métodos
Cohorte
Se seleccionaron ocho pacientes con cáncer colorrectal de una cohorte de Noruega cáncer colorrectal (
Kolorectalcancer, arv og miljø, España KAM) en base a la edad y el género parámetros. Todos los pacientes eran varones con una edad media de 60 años. Todas las muestras de tejido se extrajeron a partir de especímenes quirúrgicos. La mucosa normal se recogió en una parte distal del intestino cerca de los márgenes de resección. Las muestras se congelaron posteriormente en nitrógeno líquido y se almacenaron en un congelador a -80 grados Celsius. Siete de los pacientes se confirmó que los adenocarcinomas y uno fue caracterizado como un tumor neuroendocrino mediante examen histopatológico. Las características clínicas e histopatológicas de los pacientes se resumen en la Tabla 1.
La extracción de RNA y Digital Secuenciación
El ARN total de los pacientes fue extraído a partir de 10 secciones congeladas de 10 micras para el tumor y el tejido normal, respectivamente utilizando el kit mirVana (Ambion, TX, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Algunas muestras se concentraron en una centrífuga de vacío para obtener la concentración necesaria de 1 g /l. La presencia de pequeños ARN se confirmó en un Bioanalyzer 2100 (Agilent, CA, EE.UU.) sin signo de degradación cuando se evalúa la relación OD 260/280. La cantidad de partida fue 10 g de RNA total, y el protocolo de preparación se realizó de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Los pequeños ARN se aisló de ARN total en un gel Novex PÁGINA TBE-urea al 15%. El tamaño de la banda que representa el área de 18-30 nucleótidos (nt) se cortó y fragmentado, el ARN se eluyó en 0,3 M NaCl y se purificó en una columna de Spin X. El 5'-adaptador se ligó durante 6 horas a 20 ° C. Pequeños ARN ligado con 5'-adaptador se aisló en un gel de Novex PÁGINA TBE-urea al 15% (Invitrogen, CA, EE.UU.). La banda de 40 a 60 nt se cortó y fragmentado, el ARN se eluyó en 0,3 M NaCl y se purificó en una columna de Spin X.