Extracto
Antecedentes
La identificación de un marcador de diagnóstico basado en la sangre es un objetivo en muchas áreas de la medicina, incluyendo el diagnóstico precoz del cáncer de próstata. Se describe el uso de un promedio de presentación diferencial como un mecanismo eficiente para el descubrimiento de biomarcadores en todo el ARN de sangre. El proceso de promediado reduce el problema de la heterogeneidad clínica y reducir al mínimo al mismo tiempo el manejo de muestras.
Metodología /Principales conclusiones
ARN se aisló de la sangre de pacientes con cáncer de próstata y controles sanos. Las muestras se agruparon y se sometieron al proceso de presentación diferencial promedio. Las transcripciones presentes a diferentes niveles entre pacientes y controles se purificaron y se secuenciaron para su identificación. Los niveles de transcripción en la sangre de pacientes con cáncer de próstata y los controles fueron verificadas por RT-PCR cuantitativa. Las medias se compararon mediante una prueba t y una curva receptor-operativo, se ha generado. El anillo de proteínas dedo 19A (RNF19A) transcripción se identifica por tener niveles más altos en los pacientes con cáncer de próstata en comparación con los hombres sanos a través del proceso de presentación diferencial promedio. Quantitative análisis RT-PCR confirmó un más de 2 veces mayor nivel de los niveles de ARNm de RNF19A en la sangre de pacientes con cáncer de próstata que en los controles sanos (p = 0,0066). La precisión de distinguir los pacientes con cáncer de los hombres sanos, utilizando los niveles de mRNA en la sangre RNF19A según lo determinado por el área bajo la curva operador receptor era 0.727.
Conclusiones /Importancia
Averaged presentación diferencial ofrece un enfoque simplificado para el cribado global de los fluidos corporales, como la sangre, para identificar biomarcadores en pacientes con cáncer de próstata. Por otra parte, esta prueba de concepto estudio merece mayor análisis de RNF19A como biomarcador clínicamente relevante para la detección del cáncer de próstata
Visto:. Bai VU, Hwang O, GW divina, cuartel ER, Menon M, Reddy GP- V, et al. (2012), como promedio Expresión diferencial para el descubrimiento de biomarcadores en la sangre de pacientes con cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (4): e34875. doi: 10.1371 /journal.pone.0034875
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Octubre, 2011; Aceptado: March 10, 2012; Publicado: 6 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Bai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por el Instituto de Urología Vattikuti. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Mientras que el cáncer de próstata metastásico sigue siendo una enfermedad incurable [1], la intervención cuando la enfermedad aún está localizado, y por lo general asintomática, es a menudo curativa [2], [3], [4]. Dado que la intervención temprana es conocida por reducir la mortalidad en los hombres con cáncer de próstata [5], la detección temprana mantiene la promesa de reducir las tasas de mortalidad por cáncer de próstata, pero su eficacia aún no se ha establecido. El antígeno prostático específico (PSA) es el único biomarcador comúnmente en uso para este propósito, pero tiene limitaciones con especificidad y sensibilidad imperfecta. Un PSA normal no excluye la presencia de cáncer de próstata potencialmente letal [6] mientras que la enfermedad benigna de próstata puede causar elevaciones de PSA que pueden requerir una biopsia de próstata para el diagnóstico. Las limitaciones de la prueba de PSA para reducir la mortalidad del cáncer de próstata se ven claramente cuando dos grandes ensayos controlados aleatorios publicados resultados contradictorios [7], [8]. Incluso si se interpreta de forma favorable, los resultados sugieren que el beneficio en la supervivencia de la prueba de PSA era pequeña, con 50 hombres necesidad de someterse a una prostatectomía para salvar una vida [7]. Este resultado también pone de relieve el problema de exceso de diagnóstico de cáncer de próstata, cuando muchos hombres son diagnosticados con un cáncer de próstata indolente que no tendrá impacto en su mortalidad, incluso si no se trata. Sin embargo, el hecho de que el cáncer de próstata sigue siendo la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres [9] es un recordatorio de la importancia de detectar el cáncer de próstata potencialmente letal cuando todavía es curable. Por lo tanto, la identificación de biomarcadores adicionales para mejorar en el rendimiento de PSA sigue siendo un objetivo importante en la detección temprana del cáncer de próstata, especialmente en la detección de enfermedad agresiva.
Se describe aquí la utilidad de una expresión diferencial de promediado (ADE ) enfoque para identificar biomarcadores en muestras de sangre de los hombres con cáncer de próstata. metodología de presentación diferencial no requiere conocimiento previo de los transcritos de ARN. de este modo diferencial pantalla ofrece un sistema "abierto" en el que ambos conocidos y desconocidos transcripciones de ARN asociadas con un estado de enfermedad pueden ser identificados, un hecho que la distingue de la tecnología de microarrays [10], [11]. presentación diferencial requiere pequeñas cantidades de ARN de partida (tan poco como 20 ng de ARN total), y ofrece un potencial sin precedentes para la rápida identificación de las transcripciones de ARN presentes en diferentes niveles en la prueba frente a muestras de referencia; es especialmente eficaz en la identificación de las transcripciones de baja abundancia [11] que no puede ser detectado por las tecnologías de detección de microarrays basados en hibridación. presentación diferencial también ofrece una excelente oportunidad para interrogar a todo el transcriptoma. Sobre la base de cálculos teóricos, se espera que 240 pares de cebadores arbitrarios y de anclaje para amplificar ~96% de transcritos de ARN expresadas [12]. secuenciación del transcriptoma de próxima generación (por ejemplo, ARN-ss) comparte algunos de estos puntos fuertes (análisis del transcriptoma todo, el conocimiento previo de transcripción secuencia no es necesario, pequeñas cantidades de comenzar ARN requiere), mientras que también ofrece la capacidad de distinguir alélicas y empalme variantes que no se evalúan fácilmente con presentación diferencial [13]. Sin embargo, los datos de secuenciación de ARN-ss se sesgar hacia transcripciones alta abundancia y la tecnología sigue siendo hasta 100 veces más caro que la presentación diferencial [13].
ADE conserva las ventajas de la técnica de visualización diferencial al tiempo que facilita el análisis de muestras heterogéneas. La puesta en común de muestras heterogéneas identifica de manera eficiente las transcripciones que se expresan diferencialmente en una alta proporción de las muestras que comprenden dos grupos [10]. Hemos tratado de mejorar aún más la metodología de ADE, acelerando el descubrimiento de biomarcadores en muestras de cáncer de próstata clínicamente relevantes. Aunque el estándar de oro de diagnóstico de cáncer de próstata es una biopsia de próstata, este procedimiento es dolorosa, invasiva y sujeto a posibles complicaciones de la hemorragia y la infección. Por lo tanto, los biomarcadores que pueden ser identificados en muestras tales como sangre son deseables. Como no todos los biomarcadores asociados a tumores serán detectables en la sangre, a partir del proceso de descubrimiento en el tejido tumoral posteriormente requerir el gasto adicional de tiempo y recursos para la validación en muestras de sangre. Además, los biomarcadores basados en sangre que representan una respuesta del huésped a tumor no se identificarían si el descubrimiento de biomarcadores se inicia en muestras de tumores. Especial medios de recogida de sangre permite la recuperación eficiente de ARN no degradado de la sangre entera, incluso después de una incubación prolongada a temperatura ambiente, haciendo de esta una opción práctica para la aplicación clínica. por lo tanto decidimos iniciar el proceso de descubrimiento de biomarcadores usando muestras de sangre entera
.
Aunque ADE típicamente se ha utilizado para evaluar las transcripciones que se expresan diferencialmente en el tejido (por lo tanto, la terminología "un promedio de la expresión diferencial"), se adaptó este técnica para identificar transcripciones de ARN que están presentes a diferentes niveles en el conjunto de ARN en la sangre a partir de dos grupos de pacientes. Estas transcripciones no están necesariamente expresados diferencialmente en las células que están presentes en la sangre, o incluso en el tumor en comparación con el tejido normal, pero su presencia en la sangre se pueden utilizar para diferenciar entre estos dos grupos. En este estudio, se describe el uso de ADE para identificar un transcrito de ARN, (ID Gen: 25897) RNF19A, que está presente en niveles más altos en la sangre de pacientes con cáncer de próstata que en los controles sanos. Estos resultados establecen de prueba de principio de que un promedio de la expresión diferencial (ADE) metodología se puede utilizar para el descubrimiento de marcadores de ARN en los fluidos corporales de hombres con cáncer de próstata y apoyar el estudio de RNF19A como un potencial biomarcador de cáncer de próstata.
Métodos
Ética Declaración
Todas las investigaciones con seres humanos fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (HFHS) Henry Ford Health System. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito para todos los participantes y se llevó a cabo toda la investigación clínica de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki.
Pacientes y extracción de sangre
pacientes con cáncer de próstata fueron identificados a través del Departamento de urología en el Sistema de Salud Henry Ford (HFHS). Controles sanos fueron reclutados de la población en general y las clínicas HFHS Medicina Interna. La sangre entera (2,5 ml) se recogió en tubos de ARN Blood PAXgene (Qiagen, Valencia, CA), lo que permite el transporte a temperatura ambiente sin la degradación del ARN. Las muestras se congelaron a -80 ° C hasta que se realizó la extracción de RNA.
Aislamiento de ARN
sangre en tubos PAXgene ARN de sangre se centrifugó. El sedimento se lavó con agua libre de RNasa y se resuspendió en el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se extrajo el ARN de acuerdo con los protocolos del fabricante. El ARN aislado se trató con DNasa libre de RNasa (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la concentración de ARN total se determinó usando un qubit fluorómetro (Invitrogen, Carlsbad, CA).
promediado expresión diferencial (ADE)
total RNA de la sangre de 10 pacientes y 10 hombres sanos se agruparon por separado, a transcripción inversa, y se sometió a ADE como se describe por Bai et al [10]. Ancla y cebadores arbitrarios utilizados para la PCR fueron H-T11A y H-AP17 (GenHunter Corporation, Nashville, TN). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo por duplicado. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis y las bandas detectadas por autorradiografía. Las bandas que difieren en intensidad entre los pacientes de cáncer de próstata y hombres sanos se cortaron del gel, se re-amplificado usando el mismo ancla y cebadores arbitrarios H-T11A y H-AP17, y directamente secuenciado.
QRT-PCR
el ARN se transcribe de forma inversa utilizando cebadores hexámeros aleatorios y Transcriptor de la transcriptasa reversa (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la transcripción inversa, el ARN se sometió a qPCR en un Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando cebadores específicos de secuencia para RNF19A (Ensayo Id: Hs00968447_m1) y 18S ARN (Ensayo Id: Hs03928985_g1 ). Se determinó el ciclo en el cual la reacción cruzó una fluorescencia umbral (C
T) se determinó para cada transcripción, y el nivel de cada gen de ensayo con respecto a 18S ARN (transcripción de referencia) utilizando la ecuación 2
-ΔC
T, donde? C
T = C
T, la prueba - C
T, ref [14]
Métodos estadísticos
Las medias se compararon usando un t. -prueba. La igualdad de las varianzas de grupo se puso a prueba, y se informó el valor de p para las distribuciones Satterthwaite con varianzas desiguales. El coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para evaluar la correlación lineal. Una curva operador receptor (ROC) se generó mediante el trazado de la sensibilidad frente a la tasa de falsos positivos (1 - especificidad) como la discriminación de la prueba fue variada. Área bajo la curva (AUC) se calculó. Todos los cálculos estadísticos se realizaron en SAS.
Resultados y Discusión
Las muestras de sangre se obtuvieron de los controles sanos de sexo masculino y los hombres con cáncer de próstata localizado antes de la terapia definitiva. Después de la extracción de ARN, 20 ng de ARN total de cada uno de los pacientes de cáncer 10 de próstata o de cada uno de los 10 hombres sanos fueron combinados para formar dos piscinas separadas de RNA (cáncer de próstata vs. sano) que luego fueron analizados por ADE como se describe por Bai et al [10]. la amplificación por PCR utilizando un conjunto de anclaje y cebador arbitrario se realizó por duplicado y los productos de reacción se sometieron a electroforesis en gel (Fig. 1).
Como se muestra en la Fig. 1, el análisis ADE identificó dos transcritos de ARN amplificados en niveles significativamente más altos en muestras de sangre de pacientes con cáncer de próstata (Ca) que en los de los hombres sanos (H). análisis de la secuencia de nucleótidos (Fig. S1, datos suplementarios) reveló que estos dos transcripciones comparten una secuencia común y que esta secuencia tenía 100% de homología con la secuencia de nucleótidos en el 19A proteína de dedo de anillo (RNF19A) transcrito de ARNm. RNF19A, también llamado Dorfin, es una ubiquitina ligasa E3 sabe que se expresa en las inclusiones patológicas encontradas en la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, y Lewy cuerpo demencia [15]. RNF19A ubiquitinates synphilin-1 y mutado superóxido dismutasa 1 (SOD1), que están implicados en la patogenia de estas enfermedades neurodegenerativas [16], [17]. RNF19A no ha sido previamente asociado con el cáncer, que pone de relieve la utilidad de presentación diferencial en la identificación de asociaciones novedosas. Sin embargo, tanto RNF19A y sus objetivos (SOD1 y synphilin-1) han sido implicados en la supervivencia celular y vías de muerte celular [18], [19], [20]. SOD1 ha sido asociada específicamente con el cáncer de próstata [21], [22] y puede ser involucrada en la respuesta celular al daño del ADN a través de su papel en la vía de estrés oxidativo. Otros ligasas E3-ubiquitina, como RNF6, se reportan para regular la actividad del receptor de andrógenos en células de cáncer de próstata [23].
análisis ADE identificó dos transcritos de ARN con niveles significativamente más altos en todo el ARN en la sangre de pacientes con cáncer de próstata ( Ca) que en hombres sanos (H). análisis de la secuencia de nucleótidos reveló que estos dos transcripciones comparten una secuencia común. Esta secuencia tenía 100% de homología con la secuencia de nucleótidos en la transcripción (RNF19A) E3-ubiquitina ligasa anillo de proteínas de dedo 19a y se encuentra en la región no traducida 3 '(UTR).
Después de la identificación de la transcripción RNF19A como un biomarcador potencial para distinguir la sangre de pacientes con cáncer de próstata de la sangre de controles sanos, QRT-PCR se utilizó para medir el nivel de esta transcripción, con respecto a la de 18S ARN, en las muestras enteras de ARN en la sangre de pacientes individuales. RNF19A niveles relativos se midieron en 33 pacientes con cáncer de próstata y 19 controles sanos de sexo masculino. Estas cohortes fueron independientes de los grupos de pacientes utilizados para el proceso de descubrimiento de ADE. Se tomaron las muestras de control (edad media 40 años, rango 31-50 años) de la población general, y como tal, no fueron emparejados por edad de los casos de cáncer de próstata. datos clínicos basales de la cohorte de cáncer de próstata se muestran en la Tabla 1. Todos los casos de cáncer de próstata habían adenocarcinoma convencional en la revisión patológica y ninguno se ha documentado que tienen enfermedad metastásica ganglionar o distante. niveles RNF19A relativos medidos por qRT-PCR se muestran en la Fig. 2 (para la comparación de las materias primas C
de datos T, por favor ver los datos suplementarios, el cuadro S1). El nivel medio relativo de RNF19A fue 4,79 ± 0,91 (SE) en pacientes con cáncer de próstata en comparación con 1,96 ± 0,39 (SE) en los controles sanos. Esta diferencia entre los dos grupos fue estadísticamente significativa (p = 0,0066). Se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa similar en los niveles RNF19A entre los pacientes con cáncer de próstata y controles sanos cuando los niveles se evaluaron utilizando semi-cuantitativos RT-PCR (Fig. S2, datos suplementarios).
RT-PCR cuantitativa se realizó en muestras de ARN en sangre entera de pacientes con cáncer localizado de próstata (n = 33), así como los controles sanos de sexo masculino (n = 19). Los niveles de RNF19A transcripción se normalizaron a 18S ARN (gen de referencia). Los resultados normalizados se presentan en formato de diagrama de caja, con cajas que representan el
º 25, 50
º y 75
º percentiles y bigotes representan el 10
º y 90
º percentiles de la datos. También se muestran los valores atípicos. La diferencia entre los medios fue estadísticamente significativa (p = 0,0066).
Una curva receptor-operativo para RNF19A se generó como una estimación global de la sensibilidad y la especificidad de este biomarcador en sangre para distinguir los casos de cáncer de próstata de los controles (Fig. 3). El AUC para el modelo era 0,7273, donde una AUC de 1 corresponde a una prueba de diagnóstico con especificidad perfecta (100%) y la sensibilidad. Como punto de referencia, el AUC de PSA se ha estimado en 0,640 hasta 0,678, mientras que el AUC para un nomograma popular que tiene en cuenta otros factores de riesgo del cáncer de próstata, además de la concentración de PSA se ha estimado en 0.691 [24], [ ,,,0],25], [26].
una curva receptor de funcionamiento (ROC) se generó como una estimación preliminar de la exactitud de los niveles relativos de RNF19A en la clasificación de los pacientes con cáncer o controles sanos en nuestra cohorte de pacientes. La verdadera tasa positiva (sensibilidad) se representó frente a la tasa de falsos positivos (1-especificidad). El área bajo la curva se calculó como 0,7273.
Aunque este hallazgo es alentador, hay que señalar que el uso de PSA para diferenciar pacientes con cáncer de próstata de los controles en nuestras cohortes también puede haber dado lugar a una mejora de la AUC dada la edad relativamente joven de nuestra cohorte saludable. Con una edad media de 40, el PSA se espera en nuestra cohorte saludable sería menos de 1,0 ng /ml, sustancialmente menor que el valor mediana de PSA de 6,4 ng /mL visto en nuestra cohorte cáncer de próstata. Sin embargo, los niveles de RNF19A no se correlacionaron con la edad (coeficiente de Pearson de 0,09), por lo que es poco probable que nuestros resultados son simplemente debido a un efecto relacionado con la edad. Claramente, una validación adicional necesita ser realizada en las poblaciones que se asemejan más de cerca el ambiente del mundo real de los pacientes que están siendo remitidos para biopsia de próstata. Además, queda por determinar si RNF19A u otros biomarcadores agregarán valor adicional a los métodos establecidos clínicamente para establecer el riesgo de cáncer de próstata tales como PSA, la edad, la raza y la historia familiar. Este estudio no fue diseñado para hacer frente a la cuestión crítica de aumento de la detección de cáncer potencialmente letal, evitando el exceso de diagnóstico de cáncer indolente. Ulteriores esfuerzos de descubrimiento de biomarcadores para identificar estos subtipos letales son un objetivo esencial para el futuro.
En conclusión, como se describe aquí el uso de la expresión diferencial promedio para identificar RNF19A como una transcripción de ARN que está presente a niveles significativamente más altos en la sangre de pacientes con cáncer de próstata en comparación con los controles sanos. En nuestra muestra de pacientes, esta transcripción fue capaz de distinguir los pacientes con cáncer de próstata de los controles con un AUC de la curva de receptor-operativo de 0,7273. Los resultados discutidos aquí establecer la prueba de principio de que la metodología de ADE se puede utilizar para el descubrimiento de marcadores de ARN en la sangre de los hombres con cáncer de próstata y garantiza un mayor análisis de RNF19A como biomarcador clínicamente relevante para la detección precoz del cáncer de próstata.
Apoyo a la Información
Figura S1.
cromatogramas de las transcripciones ADE-identificado. Las muestras de controles sanos y pacientes con cáncer de próstata se sometieron a análisis de expresión diferencial de promediado. Las transcripciones (A y B), presentes en diferentes niveles en los controles sanos en comparación con los pacientes de cáncer de próstata, se sometieron a secuenciación. Los cromatogramas de las reacciones de secuenciación, tanto para la transcripción A y B se muestran, lo que indica una secuencia común idénticos. Teniendo en cuenta la resolución del gel de presentación diferencial, la diferencia de longitud entre las dos bandas (A y B) no es más que varios nucleótidos. Un lugar diferente para el recocido o bien el cebador aleatorio o el cebador poli puede explicar este resultado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0034875.s001 gratis (PPT)
figura S2. análisis
RT-PCR de RNF19A en la sangre de pacientes con cáncer de próstata y hombres sanos. Los niveles de RNF19 se evaluaron utilizando semi-cuantitativos de RT-PCR. El ARN se transcribe de forma inversa usando hexámeros aleatorios o cebador oligo (dT) y transcriptasa reversa Transcriptor (Roche Applied Science) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La amplificación del ADNc se realizó utilizando cebadores específicos de secuencia de RNF19A y GAPDH genes. Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 2%. La cuantificación de las bandas de ADNc en el gel se llevó a cabo por análisis digital de la intensidad de banda utilizando un sistema Eagle Eye II fijas de vídeo con el software proporcionado por Stratagene (La Jolla, CA). los niveles de transcripción RNF19A fueron significativamente mayores en los pacientes con cáncer de próstata en comparación con los controles
doi:. 10.1371 /journal.pone.0034875.s002 gratis (PPT)
Tabla S1.
Raw C
T se presentan los datos de las cohortes de validación de pacientes con cáncer de próstata (AEP) pts y controles sanos. La media de C
valores de T fueron más bajos en pts PrcA comparación con los controles (28,25 frente a 29,50; p = 0,02). La media de C
valores de T para el gen 18S de referencia no fueron estadísticamente diferentes entre los pacientes y los controles (16,62 vs 16,67, p = 0,89). Las medias se compararon mediante una prueba t
doi:. 10.1371 /journal.pone.0034875.s003 gratis (DOC)
Reconocimientos
Los autores desean agradecer a los pacientes y sus familias que hicieron posible este trabajo.