Extracto
Antecedentes
electrotaxis es el movimiento de las células adherentes que viven en respuesta a un campo de corriente continua (cC) eléctrico (EF) de fuerza fisiológica. células de cáncer de pulmón humano altamente metastásicas, CL1-5, exhiben la migración direccional y orientación bajo dcEFs. Para entender la respuesta transcripcional de las células CL1-5 a un dcEF, el análisis de microarrays se llevó a cabo en este estudio.
Metodología /Principales conclusiones
Un chip grande de campo eléctrico (LEFC) fue diseñado, fabricado, y se utiliza en este estudio. células CL1-5 fueron tratados con la fuerza de EF 0 mV /mm (el grupo control) y 300 mV /mm (el grupo EF-tratado) durante dos horas. Señalización de vías de participación de los genes que expresan de forma diferente entre dieron a conocer los dos grupos. Se demostró que los genes de EF-regulada altamente correlacionados con unión adherente, la regulación de genes componente ARN de telomerasa, y la unión apretada. Algunos genes regulados tales como
ACVR1B
y
CTTN
, y otros hacia abajo de los genes regulados, tales como
PTEN
, son conocidos por ser positiva y negativamente correlacionada con la migración celular , respectivamente. Las interacciones proteína-proteína de adherentes genes de EF-regulada de unión asociada sugirieron que (PDGF) receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas y receptores de efrinas pueden participar en la detección de estímulos eléctricos extracelulares. Observamos, además, un alto porcentaje de los genes regulados significativamente que codifican proteínas de membrana celular, lo que sugiere que dcEF puede influir directamente la actividad de proteínas de la membrana celular en la transducción de señales.
Conclusiones /Importancia
En este estudio , algunos de los genes de EF-regulada se han notificado a ser esencial, mientras que otros son nuevos para electrotaxis. Nuestro resultado confirma que la regulación de la expresión del gen está implicado en el mecanismo de la respuesta electrotactic
Visto:. Huang CW, Chen HY, Yen MH, Chen JJW, TH joven, Cheng JY (2011) Expresión Génica de Humana línea celular de cáncer de pulmón CL1-5 en respuesta a un campo eléctrico de corriente continua. PLoS ONE 6 (10): e25928. doi: 10.1371 /journal.pone.0025928
Editor: Eshel Ben-Jacob, la Universidad de Tel Aviv, Israel
Recibido: 16 de febrero de 2011; Aceptado: September 13, 2011; Publicado: 5 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo es financiado parcialmente por el Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán (http://web1.nsc.gov.tw/) (Contrato no. 98-2113-M-001-013-MY2 y 100 a 2113-M-001 -014 -MY3 ). No se recibió financiación externa adicional para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
electrotaxis, también conocido como galvanotaxia, es el movimiento de organismos o células en respuesta a un campo eléctrico (EF). EF Physiological existe extracelularmente, como en la herida, la piel del embrión, y conductos de [1], [2]. Puede también existir en la interfaz entre tumores y tejidos normales [3], [4]. Se conocen varios tipos de células cancerosas tales como células de cáncer de próstata, células de cáncer de mama y células de cáncer de pulmón, para migrar direccionalmente bajo dcEF, y el grado de electrotaxis de estas células de cáncer se ha demostrado que se correlaciona con su capacidad de metástasis [5] - [8]. Living electrotaxis célula es diferente de electroforesis de células ya que este último requiere la separación de las células cultivadas a partir de sustrato de antemano [9]. Además, la fuerza EF para electroforesis de células es aproximadamente 100 veces mayor que la de electrotaxis [9]. Además, se ha demostrado que la migración direccional de las células fue causado por la SSC, pero no los eventos de EF inducida tales como los flujos de electro-osmótico [10].
El mecanismo de electrotaxis ha sido explorado por más de 10 años. se reportan estar involucrado varias proteínas y genes importantes. Se sabe que EF fisiológica redistribuye de crecimiento epidérmico (EGFR receptores del factor), que conduce a la polarización catódica y la activación de la proteína quinasa activada por mitógeno EGFR-(MAPK) [11] de señalización, [12]. la señalización de EGFR es esencial para la migración dirigida-EF de células de cáncer de mama [6]. Además, AMP cíclico (cAMP) y dependiente de cAMP proteína quinasa A median la migración direccional de los queratinocitos humanos en un dcEF [13], [14]. Beta-4 integrina junto con el factor de crecimiento epidérmico (EGF) también median la electrotaxis de queratinocitos humanos a través de una vía de señalización dependiente de Rac-[15]. Las señales eléctricas controlan la cicatrización de la herida a través de la fosfatidilinositol-3-OH-quinasa (PI3K) -γ y fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN) [16]. La estimulación EF desencadena la activación de Src y la señalización de inositol-fosfolípido, que polariza en la dirección de la migración de células epiteliales [16]. En
Xenopus
neuronas espinales embrionarias, GTPasas Cdc42, Rac y Rho mediar el crecimiento de dirección en un cono de EF fisiológica a través de la regulación espacial y temporal de la actividad GTPasa y sus efectores [17], [18]. La migración EF-guiada de las neuronas del hipocampo de ratas está mediada por la activación de la proteína asociada a Rho cinasa (ROCK) y PI3K [19]. Además, la dirección de la migración inducida por EF de
Dictyostelium
células se conmuta por cGMP y fosfatidilinositol señalización [20]. También se informa de que los iones de calcio juegan un papel importante en la migración dirigida de
Dictyostelium
células y las células similares a osteoblastos [21], [22], lo que sugiere que la vía de señalización de calcio pueden participar en el electrotaxis.
la mayoría de los estudios sobre el mecanismo de electrotaxis se centran en genes específicos, proteínas y vías de señalización. El perfil de la expresión génica global podría ser un enfoque para revelar toda la vista del mecanismo. microarrays de ADN es una tecnología bien conocida para los perfiles de expresión génica de todo el genoma. Recientemente, el análisis de microarrays para electrotaxis estudio se ha realizado en los fibroblastos dérmicos humanos y queratinocitos epidérmicos [23], [24]. En fibroblastos dérmicos humanos, los genes de EF-regulada están asociadas con rutas de señalización celular que incluyen TGF-β, proteínas G, y la inhibición de la apoptosis [23]. En queratinocitos epidérmicos humanos, los genes regulados por EF se muestran en correlación con quimiocina, la apoptosis, las vías JAK-STAT, Wnt, y G-proteína de señalización MAPK activación [24]. Hasta el momento, no hay ningún trabajo de investigación discutir el efecto global de la EF en la expresión génica de las células cancerosas.
Tumor de células invasión y metástasis son las principales causas que resultan en la alta mortalidad de los pacientes con cáncer de pulmón en cinco años. Invasion es el paso más crítico en el proceso metastásico y se produce a través de la interacción entre las células tumorales y el medio ambiente circundante. células de adenocarcinoma de pulmón humano, CL1-5, que es una sublínea derivada de CL1-0, tiene invasividad mayor que CL1-0 [25]. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que CL1-5 células migran hacia el ánodo y orientar perpendicularmente a la dirección de la dcEF. Por el contrario, CL1-0 no mostró respuesta electrotactic obvio [8]. Dado que la correlación positiva entre la capacidad metastásica y la respuesta electrotactic se ha observado en el nivel de movimiento de células, es importante investigar más a fondo la influencia de EF fisiológica en la expresión génica. En este trabajo, las células metastásicas CL1-5 altamente fueron examinados mediante el uso de microarrays de ADN. A través del análisis de los genes regulados por EF y sus correspondientes vías de señalización, podemos entender más sobre el papel de EF fisiológica en la metástasis tumoral.
Para el estudio electrotaxis, hemos diseñado y fabricado un campo eléctrico de microfluidos chip (EFC), que proporciona uniforme dcEF en la micro-cámara de cultivo celular [8]. El espesor de la micro-cámara es solamente 70 micras y por tanto el calentamiento por efecto Joule se puede omitir [8]. La limitación de la EFC es que la región de cultivo de células es demasiado pequeño para proporcionar suficientes células para el análisis de microarrays en el experimento de una sola vez. Por lo tanto, un chip de campo eléctrico grande (LEFC) proporcionar uniforme dcEF fue diseñado y fabricado en este trabajo para la recogida de muestras (Figura 1).
El LEFC tenido que conecta los agujeros para el medio de entrada /salida y la sal agar puentes. Las células se cultivaron en la micro-cámara (la región de cultivo de células). La anchura, longitud y espesor de la micro-cámara de 24 mm eran, de 75 mm, y 70 micras, respectivamente.
Resultados
LEFC y EF estimulación
Para construir una EF con la fuerza de 300 mV /mm en la región de cultivo de células, el flujo de corriente de 696 mu se introdujo en el LEFC mediante la aplicación de la tensión de alrededor de 21V en los electrodos (Figura 2). La potencia eléctrica consumida en la región de cultivo de células se estimó en P = IV = 15.7mW (696 mu × 75 mm × 300 mV /mm). Se esperaba que Joule-calentamiento podría omitirse con tal energía eléctrica de baja. La simulación numérica de la dcEF mostró una distribución uniforme en la región de cultivo celular (Figura 3). región de la cultura más del 85% se expuso en la fuerza EF de 300 +/- 15 mV /mm.
Un LEFC estaba integrado con un chip calentador de ITO transparente, dos electrodos de Ag /AgCl con solución salina tamponada con fosfato (PBS ) como electrolitos, dos puentes de agar agar sal (1,5% en PBS), una bomba de jeringa, un adaptador de corriente, un amperímetro y un microscopio invertido.
la resistencia a lo largo de la EF de puntos se muestra la línea (entre las dos flechas). área de la cultura más del 85% se expuso a la fuerza EF de 300 +/- 15 mV /mm.
En el análisis de microarrays, se requiere de 20-30 g de ARN total de un GeneChip, lo que significa que alrededor se necesitan 10
6 CL1-5 células para cada réplica. La región de cultivo de células de un LEFC es 75 × 24 mm
2, alrededor de 40 veces mayor que la de un EFC (3 × 15 mm
2). Se ha probado que CL1-5 células recogidas de un LEFC podrían llegar a 10
6 células por chip. En otras palabras, un LEFC podría proporcionar suficiente cantidad de ARN total de un experimento de microarrays.
vía de señalización análisis
A través de la prueba de ANOVA, 1631 conjuntos de sonda de Affymetrix HG-U133 matriz plus2.0 se identificaron con la expresión diferencial estadísticamente entre el grupo control y el grupo tratado-EF (p & lt; 0,05). Entre ellos, 431 conjuntos de sonda tenían todas las intensidades de señal de los dos grupos de más de la intensidad mediana mundial de los seis arrays (= 66.5, a partir de las intensidades de señal de 54675 sonda fija × 3 repeticiones × 2 grupos). Los 431 conjuntos de sonda se consideraron en el análisis de la vía de señalización. Los números de acceso de estos conjuntos de sonda se presentaron a la página web CRSD, donde se realizó el análisis de enriquecimiento iterativo de todo el genoma. Los tres principales vías de señalización que muestran una correlación significativa con los genes regulados por EF eran de unión adherente, la telomerasa gen componente ARN
hTERC
regulación de la transcripción y la unión estrecha (Tabla 1).
subcelular localización y función biológica análisis
los genes de EF-regulada se clasificaron en base a la localización subcelular de sus productos proteicos. La base de datos Swiss-Prot proteína y Ensembl se refiere. Si una proteína se encuentra en "membrana de la célula" se muestra en la Swiss-Prot, o que contenía "péptido señal y dominio transmembrana" se muestra en Ensembl, que se clasificó como una proteína de membrana de la célula en este estudio. Sobre la base de la definición, se consideraron 6545 sonda fija de gama HG-U133 Plus2.0 para representar a los genes que codifican las proteínas de la membrana celular. Aquí examinamos los genes regulados significativamente con el cambio veces mayor que 1,5 o menor que 1 /1.5 (/el grupo de control del grupo EF-tratado). Entre 88 genes que cumplieron con los criterios, 18 genes fueron reconocidos para codificar la proteína de la membrana celular. El porcentaje es del 18,2% (= 16/88). Para la comparación, se seleccionaron al azar 88 conjuntos de sonda de la sonda fija de matriz plus2.0 HG-U133 (con exclusión de los conjuntos de sonda de secuencias de control) y se examina el porcentaje de genes que codifican proteínas de la membrana celular. El porcentaje medio de la operación 10000-tiempo es de 12%.
La categorización de los 88 genes regulados significativamente se muestra en la Tabla 2 (hasta reguladas) y en la Tabla 3 (abajo-regulado). Aparte de los genes que codifican las proteínas de la membrana celular, otros se clasificaron en base al "componente celular" en Swiss-Prot. Además, los genes que figuran en la Tabla 2 y la Tabla 3 se analizaron con su función biológica de acuerdo con la anotación ontología de genes (Figura 4). El resultado del análisis de microarrays fue parcialmente validado por tiempo real de RT-PCR. Los 20 genes seleccionados mostraron una correlación positiva entre el tiempo real de RT-PCR y los resultados del análisis de microarrays en su cambio de expresión (Tabla 2 y 3).
Los genes regulados significativamente enumerados en la Tabla 2 (hasta reguladas) y en la Tabla 3 (abajo-regulado) se clasificaron con su función biológica de acuerdo con la anotación ontología de genes. expresión
génica de los genes reportados electrotaxis relacionadas /proteínas
también examinamos los resultados del análisis de microarrays de los genes que se han reportado estar correlacionada con electrotaxis. Entre los 1631 sonda fija identificados por ANOVA, los que tienen todas las intensidades por encima del nivel de fondo (es decir, mayor que la media global) en al menos uno de los dos grupos fueron considerados. La expresión de proteínas /electrotaxis relacionadas con los genes se discute más adelante.
Discusión
estimulación EF
Bajo la fuerza EF de 300 mV /mm, nuestro trabajo previo ha demostrado que CL1 -5 células tienen una tendencia significativa de la migración direccional y la orientación mientras que las células CL1-0 mueven al azar [8]. células CL1-5 presentan un movimiento casi constante hacia el ánodo inmediatamente después de la dcEF está activada. Sin embargo, la orientación de las células CL1-5 no es evidente hasta la exposición de 2 horas en el dcEF. El tiempo de respuesta distinta a las migraciones direccional EF-inducido y la orientación del cuerpo celular de las células CL1-5 sugieren la implicación de diferentes vías de señalización en electrotaxis. Este punto de vista también se sugiere en un reciente trabajo de Hammerick et al [26].
Nos presume que el cambio de la expresión génica asociarse con las dos respuestas electrotactic, la migración direccional y la orientación, se pudo detectar todos después del tratamiento 2 horas de la dcEF. Por lo tanto, en este estudio se realizó el análisis de microarrays para CL1-5 células estimuladas por 300 mV /mm durante 2 horas. Los resultados mostraron que varios genes fueron regulados de manera significativa. Teniendo en cuenta el alto costo de los análisis de microarrays de ADN (alrededor de US $ 1.000 × 3 repeticiones × 2 grupos para cada punto de tiempo), empezamos eligiendo el periodo de tiempo de 2 horas en este estudio inicial. A fin de distinguir si el gen regulado fue correlacionada con la migración direccional o la orientación, el análisis de microarrays de estimulación EF corto plazo (quizás 10 minutos) será perseguido en nuestro trabajo futuro.
En este estudio, el medio de cultivo celular se reemplazó con medio DMEM libre de suero antes de aplicar la dcEF. El suero es un compuesto complejo que contiene diferentes proteínas como factores de crecimiento, citoquinas y factores de fijación. En virtud de un dcEF aplicado en la cámara de cultivo celular, gradiente químico de estas proteínas puede ser generado por electroforesis. Por lo tanto, la respuesta de las células bajo el dcEF podría verse afectada por la quimiotaxis. Para reducir al mínimo los posibles efectos de la gradiente químico cuando se investiga la influencia de dcEF en las células, el suero se elimina previamente. Nuestro trabajo previo ha demostrado que la dcEF induce la migración direccional y la orientación de las células CL1-5 en medio libre de suero [8]. Los resultados sugieren que la dcEF podría inducir la respuesta de las células vivas electrotactic sin estimulación química. Algunos diferentes tipos de células también muestran respuesta electrotactic en medio libre de suero, tales como las células de la cresta neural, las neuronas del hipocampo, y células CHO [27] - [29]
Sin embargo, las células están rodeadas por una variedad de. factores de crecimiento y citoquinas
in vivo
que también pueden desempeñar funciones en las células de electrotaxis. En nuestro estudio anterior, se han observado células CL1-5 a migrar hacia el ánodo tanto en [8], y en (Película S1) medio libre de suero que contiene suero bajo una dcEF aplicada. Es un importante trabajo futuro para comparar la expresión del gen EF-regulada en medio que contiene suero y que en medio libre de suero. El efecto concurrente de la FE y el gradiente químico por lo tanto podría ser investigada. Este tipo de trabajo puede ayudar a nosotros para saber los factores de crecimiento y citoquinas candidato que participan en el mecanismo de electrotaxis.
vía de señalización análisis
En el marco del tratamiento de la dcEF, se observó la regulación diferencial de seis genes que se sabe están involucrados en la vía de unión adherente (hsa04520, KEGG) (Tabla 1). Cuatro genes
ACVR1B gratis (1,51 veces),
FYN gratis (1,21 veces),
WASF3 gratis (1,2 veces), y
ACP1 gratis ( 1,18 veces), se mostró a estar regulado.
ACVR1B
(receptor de activina A, tipo IB) codifica un tipo I de activina receptor, que es un receptor transmembrana de la serina /treonina quinasa y es esencial para la señalización. señalización del receptor de activina regula la adhesión de células epiteliales de la próstata y está asociada con la metástasis del cáncer de próstata [30]. La proteína tirosina quinasa Fyn (codificada por
Fyn, FYN
oncogén relacionado con
SRC
,
FGR
,
SÍ
) es un miembro de la Src quinasas de la familia que son importantes en la adhesión celular mediada por integrina y la migración [31]. La activación de Fyn promueve la migración de células de carcinoma escamosas [32].
WASF3 gratis (FUE familia de proteínas, elemento 3), también conocido como
wave3
, codifica un miembro de la familia de proteínas que media WAVE reorganización de la actina y el movimiento celular. Se ha informado de que wave3, que está regulado aguas abajo de PI3K, se concentra en el lamelipodia en el borde delantero y media la migración celular y la formación lamelipodia [33].
La expresión de
PVRL1 gratis ( 1 /1,97 veces) y
ACTG1 gratis (1 /1,05 veces), se mostró a ser suprimidas por el dcEF aplicado.
PVRL1 gratis (virus de la polio por receptores relacionados con 1), también llamado
nectin-1 |, codifica una proteína de adhesión célula-célula independiente del calcio. Nectin-1 juega un papel en la organización de las uniones adherentes de las células epiteliales y endoteliales [34], [35].
ACTG1 gratis (actina, gamma 1) codifica una actina citoplasmática en las células no musculares encontrado. Actins son bien conocidos por estar involucrados en diversos tipos de la motilidad celular, y el mantenimiento del citoesqueleto. El dcEF aplicado aumentó la expresión de
ACVR1B
,
FYN
, y
WASF3
, lo que podría a su vez mejorar la migración de CL1-5. Se sugirió que la reducción de EF-adherencia (
PVRL1
↓) contribuyó a la movilidad mejorada. La supresión de
ATCG1
fue menor en comparación con el cambio de los otros genes. Se ha demostrado que la tasa de migración de CL1-5 se mejora cuando se aplica un dcEF a la región de cultivo celular [8].
Además, investigó la relación entre los productos proteicos de estos seis genes. La herramienta analítica MetaCore (GeneGo) se aplicó para construir las redes de la interacción directa o indirecta proteína-proteína. Las interacciones y la localización subcelular de las proteínas se muestran en la Figura 5. Se observó que Fyn, ACP1, y c-Src tienen interacción directa con los receptores de dos tipos de receptores, derivado de las plaquetas del factor de crecimiento (PDGF) y los receptores de ephrin [36 ] - [43].
C-Src
se demostró que era 1,3 veces hasta regulada por dcEF en este estudio. receptores de PDGF han sido implicados para ser activado por las fuerzas físicas que alteran la conformación del receptor [44]. Las redes sugirieron que los receptores de PDGF pueden ser estimulados por la dcEF y luego activan Fyn, c-Src y c-Abl, que influyó en la activación de wave3 [45] - [47]. El wave3 activado posteriormente regula la reorganización del citoesqueleto de actina y por lo tanto influyó en la morfología celular y la motilidad [48]. Los resultados también sugieren que los receptores de ephrin-A y los receptores de ephrin-B podrían jugar un papel en la conversión de los estímulos eléctricos en señales biológicas. Sin embargo, el cambio de la expresión génica no se observó en receptores de PDGF, receptores de ephrin, y c-Abl en este estudio. El nivel de expresión y el papel de estas proteínas en electrotaxis necesitan investigarse más a fondo.
El diagrama muestra que el EF hasta reguladas Fyn, ACP1, y c-Src podría interactuar directamente con los dos tipos de receptores de membrana, los receptores de PDGF y los receptores de efrinas. flecha verde: efecto positivo; La flecha roja: efecto negativo; flecha gris:. efecto no especificado
Varios genes regulados-EF estaban involucrados en la regulación transcripcional del gen componente ARN de telomerasa
hTERC gratis (h_terc, BioCarta), que codifica el componente ARN de la telomerasa humana. El componente de ARN sirve como molde para la repetición del telómero [49]. A través del tratamiento de la EF, se observó que
NFYA gratis (factor de transcripción nuclear Y, alfa) y
FJCN gratis (factor de transcripción nuclear Y, gamma) se redujeron regulado con 1 /1.16- plegar y 1 /1,27 veces, respectivamente.
NFYA
y
FJCN
codifican dos subunidades de un complejo de proteína trimérica NF-Y, que es un activador de la
hTERC
gen. La baja regulación de
NFYA
y
FJCN
sugirió que la expresión de
hTERC
puede disminuir debido a la dcEF aplicado. Puesto que no hay sonda conjunto para el
hTERC
gen en HG-U133 Plus 2,0 array, la expresión de este gen no se muestra en el resultado de microarrays.
La aplicación de la dcEF a CL1 -5 células también alteran la expresión de genes importantes implicados en la ruta apretado nudo (hsa04530, KEGG). Cuatro genes correlacionados
F11R gratis (1,52 veces),
CTTN gratis (1,51 veces),
RAB13 gratis (1,25 veces), y
banda 4.1
(1,23 veces), se mostró a ser de hasta regulado.
F11R
gen (receptor F11), también llamado adherencia de unión molécula-A (JAM-A), es un importante regulador de conjunto de unión apretada y la migración celular [50].
CTTN
gen (Cortactin) codifica una proteína que regula Cortactin las interacciones entre los componentes de las uniones de tipo adherente. Se organiza las estructuras de adhesión celular y del citoesqueleto de células epiteliales y carcinoma. Muchos estudios han documentado un papel para Cortactin en la promoción de la motilidad celular y la invasión del cáncer [51].
RAB13
gen (RAS miembros la familia del oncogén) codifica una de las pequeñas trifosfatasa de guanosina (GTPasas) de la subfamilia de RAB, que se conoce para localizar a la unión estrecha. Esta proteína se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en la regulación tanto de la estructura y función de uniones estrechas en células epiteliales polarizadas [52]. proteína Rab13 también se muestra para ser activado durante la dispersión de células epiteliales-el proceso que incluye los primeros pasos de carcinoma invasión /metástasis [53]. El gen
banda 4.1 gratis (banda de proteína de membrana de los eritrocitos 4.1) codifica una de las proteínas llamadas 4.1R 4.1. Las proteínas de la familia 4.1 son componentes del citoesqueleto cortical subyacente a la membrana celular. Contribuyen a la organización de la polaridad celular, la adhesión y la motilidad. También afectan el transporte a través de la membrana y la respuesta a factores de crecimiento [54]. Por otro lado,
PTEN gratis (1 /1,19 veces) y
ACTG1 gratis (1 /1,05 veces), se mostró a ser reguladas.
PTEN
es identificado como un supresor de tumores y codifica una fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato 3 (PtdIns (3,4,5) P3) - fosfatasa. PTEN regula a la baja los niveles intracelulares de PtdIns (3,4,5) P3 y por lo tanto regula negativamente la vía PI3K /Akt. Bajo el dcEF aplicado, PtdIns (3,4,5) P3 se informó a ser polarizados para el borde de ataque de las células HL60 diferenciadas que migran hacia el cátodo [16]. Se sabe que PTEN inhibe la migración celular, la difusión, y las adhesiones focales [55]. En resumen,
F11R
,
CTTN
,
RAB13
,
banda 4.1
,
PTEN
y
ACTG1
eran conocidos para mediar en la motilidad celular y /o la organización del citoesqueleto, que sugiere que puede jugar un papel en la respuesta electrotactic de CL1-5.
los confluente monocapas de células CL1-5 se pudo observar después de la incubación durante la noche (~20hrs ) en la cámara de cultivo de LEFC. Se ha informado de que el desarrollo de los sellos eléctricos de alta resistencia toma de chapado de 48 horas para alcanzar el estado estacionario en la formación de uniones estrechas [56]. Dado que se observaron los genes de unión asociada ajustados para ser reguladas EF, inferimos que la dcEF puede influir en la formación de uniones estrechas durante el periodo de estimulación. Por lo tanto, hemos examinado aún más la expresión de genes de otros importantes componentes de unión estrecha, como las ocludinas proteínas transmembrana y claudinas, y la familia ZO citoplasmática. Sin embargo, no se observó diferencia significativa entre el grupo control y el grupo tratado con EF. Los resultados sugieren que dcEF podría influir en el conjunto de la regulación de las uniones estrechas a través de JAM-A en lugar de ocludinas, claudins, y la familia del decalaje de origen en el nivel de transcripción.
Para resumir, EF puede influir en el movimiento de CL1-5 por la regulación de la unión adherentes y apretado nudo en el nivel de la transcripción. Muchos de los genes regulados en las dos vías de señalización son conocidos para correlacionar a la migración celular. A excepción de
PTEN
y
ACTG1
, la mayoría de los genes no se han notificado a ser aún EF-correlacionados.
Localización subcelular análisis
Una conocida mecanismo de electrotaxis es que los receptores de membrana redistribuyen bajo la dcEF aplicado y causan la señalización asimétrica de la célula [1]. También se propone que EFs pueden ser transducidas en señales mecánicas por el par mecánico ejerciendo sobre las glicoproteínas de la membrana de la célula [57]. Dado que las proteínas de la membrana celular podrían estar directamente influenciados por el dcEF, nos gustaría investigar su proporción en los productos de los genes regulados por EF. se observaron para codificar proteína de membrana celular Acerca de 18,2% de los genes regulados significativamente (1 /1,5 veces el cambio & gt;; 1,5 o & lt). Sin embargo, sólo el 12% de los genes seleccionados al azar codifica la proteína de la membrana celular. El resultado indicó que un porcentaje relativamente alto de proteínas de la membrana se regula significativamente por la dcEF en el nivel de la transcripción. Los genes de las proteínas de membrana EF afectadas por descubiertos en este trabajo podrían ser los candidatos para el estudio adicional de glycomic electrotaxis.
función biológica de los genes regulados-EF
Además de la adhesión biológica, podríamos ver que el dcEF regula los genes que funcionan en los procesos biológicos, tales como la regulación biológica, proceso celular, la señalización, el proceso metabólico, etc. (Figura 4). Se conocen varios genes para participar en la apoptosis, incluyendo los genes regulados
SRGN
y
TP53INP1 gratis (Tabla 2), y las reguladas por los genes
BIRC7
,
TRAF2
,
Unc5B
, y
GCLM gratis (Tabla 3). Además, algunos otros genes regulados significativamente codifican las proteínas correlacionadas con la señalización de la proteína G, incluyendo los genes regulados
F2R
y
DOCK9
, y las reguladas por los genes
,
GPR156
, y
RAPGEF1
. Se sabe que las proteínas G son transductores de señales que transmiten señales químicas fuera de la célula, tales como hormonas, neurotransmisores, y quimiocinas, y causar cambios dentro de la célula [58]. El resultado implica que las proteínas G también pueden desempeñar un papel en la transmisión de señales mecánicas en la estimulación de EF. Algunos otros genes regulados-EF asociadas con la señalización de la proteína G se observan en los fibroblastos dérmicos humanos y queratinocitos epidérmicos adultos [23], [24].
relacionados con electrotaxis La expresión génica de los genes /proteínas reportados
EGFR se han reportado para polarizar en el lado del cátodo con orientación de cáncer de pulmón de células A549 y líneas CL1-5 que migró hacia el cátodo y el ánodo bajo la dcEF, respectivamente [7], [59]. También se sabe que la migración direccional EF-mejorada se correlaciona bien con el nivel de expresión de EGFR /ErbB1 en células de cáncer de mama. La transfección de células MTLn3 y MDA-MB-435 células con vectores de expresión para miembros de la familia ErbB ErbB1, ErbB2 y ErbB3 también mejorar significativamente la migración inducida por EF [6]. En nuestro análisis de microarrays, el cambio de expresión de
ErbB1
y
no se observó ErbB2
bajo la estimulación de EF. La expresión de
ErbB3
parecía ser reguladas por el dcEF aplicado, ya que la intensidad de la señal del grupo de control (71,3 en promedio con todas las repeticiones & gt; 66.5) es mayor que la del grupo tratado con EF (48.7 en promedio con todas las repeticiones & lt; 66,5).
Beta-4 integrina, codificada por
ITGB4
, se asocia con alfa-6 integrina ser un receptor para las lamininas. Se ha informado de que el beta-4 integrina y EGF coordinadamente regular la migración direccional EF-mediada a través de Rac1 en los queratinocitos humanos [15]. A partir del resultado de análisis de microarrays, no vimos la regulación de los
EGF
,
ITGB4
, y
Rac1
bajo la dcEF. Sin embargo,
ITGB5 Windows que codifica la beta-5 integrina, otro miembro de la familia de las integrinas, mostraron importantes sobre regulación por el dcEF (1,55 veces, Tabla 2). Beta-5 integrina está asociada con alfa-V integrina ser un receptor para las fibronectinas. Se ha informado de que la interferencia de ARN desmontables de beta-5 integrina expresión reduce la migración celular
in vitro
y metástasis
in vivo
[60]. Nuestro resultado sugiere que la correlación positiva entre la sobre regulación de
ITGB5
y el aumento de la migración de las células bajo el CL1-5 dcEF aplicado.
Rac y Cdc42 son GTPasas que regulan la formación de filopodios y lamelipodia , respectivamente. Han sido propuestos para dominar el manejo de los conos de crecimiento cathodally en
Xenopus
neuronas espinales embrionarias. También se ha demostrado que RhoA, cuya activación conduce a un colapso del cono de crecimiento, eleva anodally en los conos de crecimiento EF tratados con [17], [18]. proteínas Rho regulan el conjunto dinámico de los componentes citoesqueléticos para varios procesos fisiológicos incluyendo la motilidad celular. Se sabe que estar involucrados en la transformación celular y la metástasis del cáncer. En nuestro análisis de microarrays, no vimos el cambio de expresión de
Rac
,
Cdc42
, y
RhoA
bajo la dcEF. Sin embargo,
DOCK9
, que codifica un factor de intercambio de guanina-nucleótido específico (GEF) que reconoce y activa Cdc42, ha demostrado ser hasta reguladas por 1,94 veces (Tabla 2) [61]. Además,
RhoJ
, que codifica otro miembro de la familia Rho, parecía ser de hasta reguladas por el tratamiento EF (# de acceso BC025770). Para
RhoJ
, la intensidad de señal del grupo EF-tratado (todas las repeticiones & gt; 66.5, 91.4 en promedio) es mayor que la del grupo control (todas las repeticiones & lt; 66.5, 32.4 en promedio).