Extracto
El largo no codificante ARN HOTAIR se ha notificado a ser un biomarcador de mal pronóstico en una variedad de tumores malignos. Sin embargo, poco se sabe acerca de la asociación de HOTAIR con cáncer gástrico. Se examinó la expresión de HOTAIR en 68 muestras de cáncer gástrico utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR y analizamos su correlación con los parámetros clínicos. El papel funcional de HOTAIR se examinó mediante la generación de líneas celulares de cáncer gástrico humano con expresión aumentada o suprimido HOTAIR. El crecimiento -independiente anclaje se evaluó por el ensayo de agar blando. El HOTAIR aumentado o suprimida que expresan las células de cáncer gástrico se inyecta en la vena de la cola o en la cavidad peritoneal de ratones inmunodeficientes para examinar el efecto de esta molécula en la metástasis y diseminación peritoneal. La expresión de HOTAIR fue significativamente mayor en lesiones de cáncer que en los tejidos no cancerosos adyacentes en cánceres gástricos humanos. En el tipo difuso de cáncer gástrico, el grupo de alta HOTAIR (HOTAIR /GAPDH & gt; 1) mostró invasión significativamente más venosa, metástasis de ganglios linfáticos frecuentes y una tasa de supervivencia global menor en comparación con el grupo HOTAIR baja (HOTAIR /GAPDH & lt; 1). La formación de colonias en el agar suave se mejoró de una manera HOTAIR-dependiente. HOTAIR expresan MKN74 formó más metástasis hepática comparación con el control cuando se inyectaron en la vena de la cola de los ratones. Además, la reducción de expresión de HOTAIR en KATO III suprimió diseminación peritoneal. Estos resultados sugieren que HOTAIR juega un papel fundamental en el desarrollo de cáncer gástrico
Visto:. Endo H, Shiroki T, Nakagawa T, Yokoyama M, Tamai K, Yamanami H, et al. (2013) Expresión mejorada de largo no codificante ARN HOTAIR se asocia con el desarrollo de cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (10): e77070. doi: 10.1371 /journal.pone.0077070
Editor: Dajun Deng, Hospital del Cáncer y el Instituto de la Universidad de Pekín, China
Recibido: 10 Junio, 2013; Aceptado: 5 Septiembre 2013; Publicado: 10 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Endo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la JSPS KAKENHI numbers24791480 subvención y 24591022 (http://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/index.html), y la subvención-en-ayudas de HIROMI Medical Research Foundation (http: //www.smtb .jp /personal /encomienda /gestión /public /ejemplo /pdf /naturales-06a.pdf) y Daiwa Fundación Valores de la Salud (http://www.daiwa-grp.jp/dsh/grant/outline.html). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la incidencia y mortalidad del cáncer gástrico han disminuido drásticamente en los últimos 50 años en la mayoría de las áreas del mundo, pero aún sigue siendo la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. A pesar de los recientes avances en las técnicas de diagnóstico, tales como aumento endoscopia con imagen de banda estrecha (NBI) [2], y en el tratamiento, incluyendo la terapia de destino [3,4], todavía hay un gran número de pacientes con cáncer gástrico con mal pronóstico. El mecanismo patogénico que contribuye a la función biológica agresivo en este tipo de cáncer aún no se ha aclarado.
Los proyectos de secuenciación del genoma revelaron que el genoma humano está compuesto de% de proteína de menos de 2 genes que codifican, y más de 90% del genoma se transcribe como ARN no codificantes (ncRNA) [5-7]. Estos ncRNAs se clasifican en dos grupos dependiendo del tamaño de nucleótidos. Micro RNAs son aproximadamente 18-25 nucleótidos de longitud, mientras que a largo no codificante del ARN se compone de más de 200 nucleótidos. HOTAIR es un ARN no codificante de largo que fue identificado a partir de una matriz de laboreo de encargo del locus HoxC. HOTAIR se demostró que trimethylate histona H3 lisina-27 de HOXD lugar con la Polycomb represivas complejo 2 (PRC2) e inhibir la expresión de genes HOXD, que se encuentra en un cromosoma diferente [8]. HOTAIR promueve la metástasis a través de la interacción con PRC2 para reprimir la transcripción de múltiples genes supresores de la metástasis en el cáncer de mama [9]. La mayor expresión de HOTAIR está asociado con la invasividad, metástasis y mal pronóstico en una variedad de cánceres como el de mama, colon, de páncreas y cáncer de pulmón [9-12]. Sin embargo, poco se sabe acerca de la expresión y /o la función de HOTAIR en el desarrollo de carcinoma gástrico. En el presente estudio, se determinó la participación de HOTAIR en el desarrollo del cáncer gástrico humano y examinamos si su expresión se correlaciona con el comportamiento agresivo de cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Los tejidos
68 tejidos de cáncer gástrico se obtuvieron de pacientes que se sometieron a cirugía en el Centro de cáncer de Miyagi (Natori, Japón), entre 2007 y 2011. Todas las muestras se congelaron inmediatamente en breve después de la resección en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C o fijados en 10% formalina tamponada y embebidos en cera de parafina. Los cánceres gástricos se clasifican histológicamente como el tipo intestinal (n = 36), el tipo difuso (n = 32) de acuerdo con la clasificación de la Organización Mundial de la Salud y los informes anteriores [13]. Ningún paciente recibió quimioterapia y radioterapia antes de la cirugía. Para el análisis estadístico, la supervivencia global fue definida por la muerte por cualquier causa, y se utilizaron de Kaplan-Meier de supervivencia.
Las líneas celulares
La líneas celulares de cáncer gástrico MKN74 (tipo intestinal) [14] y KATO III (tipo difuso) [15] se obtuvieron a partir de bio RIKEN Center (Tsukuba, Japón). Ambas líneas celulares se mantuvieron en RPMI-1640 (Gibco /Life Technologies Co., CA) que contiene 10% de FBS inactivado (EuroClone, Milano, Italia), con 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco /Life Technologies Co. , CA) y se cultivaron en un 5% humidificado de CO
2 incubadora a 37 ° C.
preparación de ARN, la transcripción inversa y cuantitativa en tiempo real PCR
el ARN total de muestras congeladas y las líneas celulares se extrajo por isogen (NIPPON GENE, Tokio, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. ADNc a partir de todas las muestras fueron sintetizados a partir de 1,0 g de RNA total por PrimeScript® primera hebra de cDNA Synthesis Kit (Takara Bio, Siga, Japón) siguiendo el protocolo del fabricante. La expresión de HOTAIR se cuantificó por LightCycler SYBR Verde Brillante QRT-PCR kit (Roche Applied Science, IN) siguiendo el protocolo del fabricante con los conjuntos de cebadores específicos de acuerdo con el estudio anterior [9]. El nivel de expresión HOTAIR en cada muestra se normalizó al nivel de expresión GAPDH respectivo. La especificidad de cada reacción de PCR fue confirmada por el derretimiento de los análisis de la curva.
HOTAIR expresión vector retroviral
Humano HOTAIR ADNc (Addgene, Cambridge, MA) se amplificó por PCR y se insertó en el puro pBabe vector (pBabe -HOTAIR). retrovirus recombinante fue producida con el platino-A (Plat-A, suministrada por el Prof. Kitamura) envasar líneas celulares como se describe anteriormente [16]. Brevemente, las células Plat-A fueron transfectadas con pBabe -HOTAIR o pBabe-puro Vector (EV). Fugene 6 (Roche Applied Science) y Opti-MEM I (Gibco tecnologías /Life Co.) se añadieron siguiendo el protocolo del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogió el sobrenadante que contiene retrovirus, y pasa a través de un filtro de 0,45 micras. células MKN74 fueron infectadas con los retrovirus recombinantes y luego seleccionan con puromicina.
interferencia de ARN
a desmontables HOTAIR en KATO III, se utilizó Knockout ™ Sistemas de ARNi (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, hemos diseñado cuatro secuencia shRNA dirigido HOTAIR como se muestra en la Tabla 1. Después de la hibridación de los oligonucleótidos complementarios shRNA, ligamos los oligonucleótidos hibridados en Psiren vector (shHOTAIR). A continuación, las células transfectadas Plat-A con shHOTAIR o Psiren vectorial (EV), y se infectaron KATO III con los retrovirus recombinantes y se seleccionaron con puromicina. Las células transducidas con el sh-HOTAIR2 y -3 vector fueron elegidos para el estudio adicional. Cada
en el experimento vitrto
se realizó por triplicado, repitió tres veces y se muestran datos representativos.
shRNA
Secuencia
shHOTAIR-1sensegatccgaacgggagtacagagagattttcaagagaaatctctctgtactcccgttcttttttganti-senseaattcaaaaaagaacgggagtacagagagatttctcttgaaaatctctctgtactcccgttcgshHOTAIR-2 sensegatccgccacatgaacgcccagagattttcaagagaaatctctgggcgttcatgtggttttttg anti-senseaattcaaaaaaccacatgaacgcccagagatttctcttgaaaatctctgggcgttcatgtggcgshHOTAIR-3 sensegatccgtaacaagaccagagagctgttttcaagagaaacagctctctggtcttgttattttttganti-senseaattcaaaaaataacaagaccagagagctgtttctcttgaaaacagctctctggtcttgttacgshHOTAIR-4sensegatccaattcttaaattgggctggttcaagagaccagcccaatttaagaattttttttganti-senseaattcaaaaaaaattcttaaattgggctggtctcttgaaccagcccaatttaagaattgTable 1. Las secuencias de shRNA insertos para el vector que expresa shHOTAIR.
CSV Descargar CSV
Crecimiento de las células de ensayo
1 x 10
4 células fueron sembradas por pocillo en placas de 96 pocillos en el crecimiento normal de las células medios de comunicación. El ensayo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio, tetrazol amarillo (MTT) se realizó con un kit de proliferación celular I (GE Healthcare Life Sciences, NJ) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se hicieron mediciones de absorbancia a 570 nm por VersaMax (Molecular Devices, CA) para estimar la producción de MTT-formazano después de 24, 48 y 72 horas de incubación. Se evaluó el índice a las 48 y 72 horas normalizada a que a las 24 horas.
Soft agar ensayo de formación de colonias
ensayos de agar blando se construyeron en placas de 6 pocillos. La capa de base de cada pocillo consistía en 1 ml con concentraciones finales de 1 x media (RPMI-1640 más 10% de FBS inactivado) y 0,6% de agarosa de bajo punto de fusión. Las placas se enfriaron a temperatura ambiente hasta sólida, momento en el que una capa de agar de crecimiento 1-ml se vertió, que consta de 1 x 10
4 células suspendidas en 1 x medios de comunicación y 0,3% de agarosa de bajo punto de fusión. Las placas se enfriaron de nuevo a temperatura ambiente hasta que la capa de crecimiento congelado. se añadió de nuevo 1 ml de 1 x medios de comunicación sin agarosa en la parte superior de la capa de crecimiento en el día 0 y de nuevo el día 14 de crecimiento. Las células se dejaron crecer a 37 ° C durante 4 semanas y se contaron las colonias totales.
Animales
NOD hembra-Shi-SCID IL2Rγ
nula
6 semanas de edad /(NOG ) ratones se adquirieron de Instituto central de Animales experimentales (CIEA, Kawasaki, Japón) y se utilizaron en este experimento. Se les permitió aclimatarse durante una semana antes de los experimentos. Se alojaron en una habitación limpia de la instalación de cuidado animal en Miyagi Centro de Investigación del Cáncer y se mantienen en condiciones de temperatura, humedad y condiciones de iluminación con hora y de ratón proporcionado comida /agua ad libitum.
ensayo de la vena de la cola de la metástasis de las células cancerosas
Para evaluar el efecto de la expresión HOTAIR sobre la metástasis por vía sanguínea, se inyecta 1,0 x 10
5 células de HOTAIR- (n = 9) o EV-expresión (n = 9) MKN74 con 0,2 ml de PBS en la vena de la cola de los ratones. Los ratones se observaron generalmente para detectar signos de enfermedad semanal para la duración del experimento, y se sacrificaron 8 semanas después de la inyección. Los pulmones, el hígado, los riñones, las glándulas suprarrenales, y el bazo de los ratones fueron extirpados y se investigaron macroscópicamente sobre la presencia de metástasis.
metástasis peritoneal
1.0 x 10
6 células de shHOTAIR- (n = 5) o EV-expresión (n = 5) KATO III se inyectaron con 0,2 ml de PBS en el peritoneo de los ratones para evaluar el efecto de la expresión HOTAIR sobre la metástasis peritoneal. Los ratones se observaron generalmente para detectar signos de enfermedad semanal para la duración del experimento, y se sacrificaron 8 semanas después de la inyección. Se investigó la presencia de nódulos y ascitis en la cavidad peritoneal.
Histología e inmunohistoquímica
Los tejidos extirpados fueron fijadas en formalina al 10% durante 24 horas, luego se corta y embebidos en parafina para microscópica investigación. Las muestras se cortaron en secciones de 4 micras de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). Se investigó la presencia de micro-metástasis que no fue reconocida macroscópicamente. Los tumores reconocidos se investigaron más inmunohistoquímica usando anticuerpo primario para citoqueratina humana (Anti citoqueratina bajo, DC10 /5D3, Nichirei Co, Tokio, Japón) para asegurarse de que se obtuvieron a partir de células de cáncer gástrico humano inyectado. Después de la desparafinación, las secciones de tejido se incubaron en metanol con peróxido de hidrógeno 0,3% en agua destilada durante 20 minutos para bloquear la actividad peroxidasa endógena. La recuperación del antígeno se llevó a cabo por cocción a 95 ° C durante 5 min en 10 mM de tampón de citrato, pH 6,0 a presión, y luego se deja enfriar a temperatura ambiente durante 30 minutos. biotina endógena o sitios de unión de avidina se bloquearon por incubación secuencial durante 30 minutos. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario se ha descrito anteriormente y se hicieron reaccionar con el segundo anticuerpo. Un complejo de avidina-peroxidasa biotina se utilizó para detectar el segundo anticuerpo. La tinción se visualizó con diaminobencidina (DAB). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina, se lavó y se deshidrataron utilizando un gradiente de etanol al xileno.
El análisis estadístico
La correlación de la expresión HOTAIR con variables clinicopatológicas del paciente y la tasa de metástasis en el inyectado los ratones fueron analizados por la prueba de chi-cuadrado. La significación estadística de las diferencias entre los 2 grupos se determinó mediante la prueba de Wilcoxon y
valor de p gratis (
& lt; 0,05) se consideró estadísticamente significativo. La diferencia estadística entre los 3 grupos se evaluó mediante la prueba de acero Dwass o el análisis de Bonferroni y
P valor gratis (& lt; 0,017) se consideró como estadísticamente significativa la probabilidad de supervivencia global fue analizada por los métodos de Kaplan-Meier y evaluado por log-rank prueba, y
valor de p gratis (& lt; 0,05) se consideró estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con Ekuseru-Toukei 2012 (Social Survey Research Information Co., Ltd., Tokio, Japón). El
valor de p gratis (& lt; 0,05) se consideró como estadísticamente significativa
Ética
La Junta de Revisión Institucional del Centro de Cáncer de Miyagi (MCC) aprobó este protocolo de estudio,. y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente (Número de Permiso: MCC-22-30). El protocolo de los experimentos con animales fue aprobado por el Comité de MCC Animal Cuidado y Uso (Número de Permiso: MCC-AE-2011-12).
Resultados
La expresión HOTAIR de muestras de cáncer gástrico humano
los hOTAIR niveles de expresión de tejidos cancerosos y cancerosos adyacentes de los pacientes con cáncer gástrico fueron examinados por QRT-PCR y normalizado por el nivel de expresión de GAPDH. El nivel de expresión media de HOTAIR fue 4.952 ± 6.462 y 3.804 ± 6.721 (HOTAIR /GAPDH ± desviación estándar) en las lesiones de carcinoma y no cancerosas, respectivamente. Los niveles de expresión de HOTAIR fueron significativamente más altos en las lesiones de carcinoma en comparación con las de las lesiones no cancerosas (
P = 0,019
, Figura 1A).
A, de aire caliente niveles de expresión de cancerosos y no cancerosos adyacentes tejidos de los pacientes con cáncer gástrico fueron examinados por QRT-PCR y normalizado por el nivel de expresión de GAPDH. Los niveles de expresión de HOTAIR fueron significativamente más altos en las lesiones de carcinoma en comparación con los de las lesiones no cancerosas (
P
= 0,019). B y C, los tejidos de cáncer gástrico humano se clasifican de acuerdo con el nivel de expresión HOTAIR en un grupo de alta HOTAIR (HOTAIR /GAPDH & gt; 1,0) y el grupo de baja HOTAIR (HOTAIR /GAPDH & lt; 1,0) en el intestino (B ) y el tipo difuso (C) de cáncer gástrico, respectivamente.
Asociación entre la expresión de HOTAIR y los factores clínico-patológicos en los cánceres gástricos humanos
los tejidos de cáncer gástrico humano fueron clasificados histopatológicamente en intestinal (n = 36) y los tipos difusas (n = 32). Los tejidos de cáncer gástrico humano fueron clasificados de acuerdo con el nivel de expresión HOTAIR en el grupo de alta HOTAIR (HOTAIR /GAPDH & gt; 1,0) y el grupo de baja HOTAIR (HOTAIR /GAPDH & lt; 1,0) (Figuras 1B y C). La asociación de la expresión HOTAIR con las características clinicopatológicas en el tipo intestinal y difuso de cáncer gástrico se resume en las Tablas 2 y 3, respectivamente. En el tipo intestinal de cáncer gástrico, no se encontró correlación significativa entre la expresión HOTAIR y los resultados clinicopatológicas (Tabla 2). Además, ninguna relación significativa entre la expresión HOTAIR y la supervivencia global, aunque el grupo de alta HOTAIR tendió a mostrar una supervivencia más corta que en el grupo de bajo HOTAIR (Figura 2A). Por otro lado, se encontró una asociación significativa entre la expresión HOTAIR y metástasis en los ganglios linfáticos (P = 0,043), la infiltración venosa (
P = 0,0083
), y la supervivencia global corto (
P =
0,018) en el cáncer gástrico de tipo difuso (Tabla 3 y la Figura 2B). Sin embargo, no hubo asociación entre el escenario y la expresión HOTAIR.
HOTAIR baja
HOTAIR alta
P
valor
Age73.07 ± ± 9.1870.87 10.650.53Gender0.63Male1016female37T0.87T1, T2610T3, T4713N0.26N078N1, N2 , N3615Ly0.68ly069ly1, LY2, ly3714v0.19v089v1, v2, v3514Stage0.501,27153,4680.50Table 2. La asociación de la expresión HOTAIR con las características clínico-patológicas de tipo intestinal del cáncer gástrico.
CSV Descargar CSV
HOTAIR baja
HOTAIR alta
P
valor
Age59.250 ± ± 10.7566.35 10.160.07Gender0.71male812female48T0.87T1, T212T3, T41118N0.043*N086N1,N2,N3414ly0.40ly067ly1,ly2,ly3613v0.0083*v0119v1,v2,v3111Stage0.311,2783,4512Table 3. La asociación de la expresión HOTAIR con las características clínico-patológicas de tipo difuso de cáncer gástrico.
CSV Descargar CSV
A, En el tipo intestinal de cáncer gástrico, sin relación significativa entre la expresión HOTAIR y la supervivencia global, aunque el grupo de alta HOTAIR tendió a mostrar una supervivencia más corta que en el grupo de bajo HOTAIR. B, el grupo de alta HOTAIR mostraron una supervivencia significativamente más corto que el grupo de bajo HOTAIR en el tipo difuso de cáncer gástrico (
P = 0,018
).
Generación de arriba HOTAIR y las células y la correlación con la viabilidad celular
las reguladas Para evaluar el papel funcional de hOTAIR en el desarrollo de cáncer gástrico, hemos generado de forma estable que expresa hOTAIR MKN74 células MKN-(aire caliente) y estable shHOTAIR que expresan las células KATO III (KATO- shHOTAIR). QRT-PCR análisis reveló que las células MKN-aerostático expresaron un nivel de HOTAIR aproximadamente 10 veces la de EV expresar (MKN-EV) o MKN74 células parentales y que la expresión de esta molécula se redujo en un 30 a 70% en las células KATO-shHOTAIR en comparación con EV transducidas (KATO-EV) o células de los padres KATO III (KATO-EV) (Figura 3A). Los resultados del ensayo MTT demostraron que ni regulación ni la baja regulación de HOTAIR afectados proliferación celular de cáncer gástrico (Figura S1)
.
A, niveles relativos de expresión HOTAIR en líneas celulares de cáncer gástrico se analizaron por QRT- análisis de PCR. células MKN-HOTAIR expresaron cerca de 10 veces más altos niveles de HOTAIR que las células parentales y MKN74 MKN-EV. Por otro lado, la expresión de HOTAIR en células KATO-shHOTAIR se redujo en un 30 a 70% en comparación con células KATO III y KATO-EV parentales. B, El gráfico de barras demostró la expresión relativa de HOTAIR en líneas celulares de cáncer gástrico, los tejidos normales y de carcinoma del estómago analizados en este estudio. Expresión de HOTAIR se normalizó a la de GAPDH. Los valores se expresan en relación a 1,00 para la expresión en células MKN74 parentales.
Soft agar ensayo de formación de colonias
Para dilucidar las funciones de HOTAIR en el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer gástrico, se utilizó un ensayo de agar blando. células MKN-HOTAIR formaron un mayor número de colonias que las células MKN-EV (
P = 0,009
, Figura 4A). En consonancia con este hallazgo, las células KATO-shHOTAIR mostraron un menor número de colonias significativas que las células KATO-EV (Figura 4B). Además, las células de cáncer gástrico con nivel de expresión HOTAIR similar (MKN-HOTAIR y shHOTAIR-3, la Figura 3B) forman un número similar de colonias, lo que indica que el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer gástrico se reguló de manera HOTAIR-dependiente.
potencial de crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer gástrico se evaluó mediante el ensayo de agar blando. células MKN-HOTAIR formaron un número significativamente mayor de colonias que las células MKN-EV (
P
= 0,009) (A), mientras que las células KATO-shHOTAIR mostraron significativamente menos colonias que las células KATO-EV en HOTAIR forma de expresión (EV frente SH- HOTAIR2,
P = 0,016
y EV frente sh-HOTAIR3,
P = 0,0035
) (B).
expresión HOTAIR y cáncer gástrico celular metástasis y diseminación peritoneal
Desde HOTAIR mejora el crecimiento dependiente de anclaje independiente de anclaje, pero no de células de cáncer gástrico, la hipótesis de que HOTAIR podría contribuir a la metástasis a distancia y /o diseminación peritoneal en lugar de invasión directa de órganos vecinos. Para hacer frente a este problema se empleó un ensayo de vena de la cola y la inyección peritoneal de células para examinar si la expresión HOTAIR promueve la metástasis de sangre -borne y diseminación peritoneal, respectivamente. Como era de esperar, las células MKN-aerostático con frecuencia exhiben metástasis hepáticas (
P
= 0,01) en comparación con las células MKN-EV. Además, el número y tamaño de los tumores hepáticos metastásicos fueron significativas más grande con células MKN-aerostático que con las células MKN-EV (
P = 0,03
y
P
= 0,019, respectivamente, cifras 5A y B). Interesantemente, un ratón inyectado con MKN-HOTAIR mostró metástasis en el riñón y la glándula adrenal, además del hígado, mientras que con las células MKN-EV tumores metastásicos forman sólo en el hígado. Consistentemente, la difusión peritoneal se redujo significativamente (1/5,
P
= 0,009) cuando HOTAIR se inactivó en células KATO III mientras que todas las células de control formaron diseminación peritoneal (5/5) (figuras 6A y B). Los tumores metastásicos fueron confirmados histológicamente y mostraron tinción positiva intensa para citoqueratina humana (Figuras 5C y 6C).
A, El efecto de HOTAIR sobre la metástasis se investigó mediante el ensayo de vena de la cola. 1,0 x 10
5 de células que expresan de aire caliente (MKN-HOTAIR, n = 9) y células de control (MKN-EV, n = 9) se inyectaron en la vena de la cola de los ratones. células MKN-aerostático con más frecuencia mostraron metástasis hepáticas (
P
= 0,01) en comparación con las células MKN-EV (panel izquierdo). Además, los números (panel central) y tamaños de los tumores hepáticos metastáticos (panel derecho) fueron significativas más grande con células MKN-aerostático que con las células MKN-EV (
P = 0,03
y
P
= 0,019, respectivamente). B, Los tumores metastásicos pueden ser reconocidos claramente macroscópicamente (flecha). C, Las células tumorales glándulas formadas y se cree que se deriva de las líneas inyectados humanos de células de cáncer gástrico (panel de la izquierda, HE, ampliación original x40). Estas células tumorales mostraron una intensa inmunorreactividad para citoqueratina humana (panel derecho).
A, diseminación peritoneal se redujo significativamente (1/5,
P
= 0,009) cuando se inactivó en HOTAIR células KATO III por shRNA transducción, diseminación peritoneal mientras que todas las células de control formados (5/5). B, El ratón con diseminación peritoneal mostró ascitis hemorrágica (panel izquierdo) y nódulos (flecha en el panel de la derecha) en la cavidad peritoneal. C, Los nódulos en la cavidad peritoneal consistido en las células cancerosas, y algunos de ellos tenían mucina como un carcinoma de células en anillo de sello. Se creía que se derivan de las líneas inyectados humanos gástricos de células cancerosas (HE, aumento original x 100) ya que estas células mostraron una intensa inmunorreactividad para citoqueratina humana (panel derecho).
Discusión
en este estudio, se determinó la expresión de HOTAIR en el cáncer gástrico y examinar su correlación con las características clínico-patológicas, incluyendo el pronóstico de los pacientes. Nuestros resultados revelaron claramente una mayor expresión de HOTAIR en tejidos de cáncer en comparación con los tejidos no cancerosos del estómago y que el alto nivel de expresión de esta molécula se asoció con metástasis en los ganglios linfáticos, invasión venosa y la supervivencia pobre en el tipo difuso de cáncer gástrico. Estos resultados son consistentes con la reciente estudio que muestra que la sobre regulación de HOTAIR se encuentra en el cáncer gástrico en comparación con los tejidos normales y se correlaciona con el estadio del tumor y la metástasis de ganglios linfáticos [17]. Además, de aire caliente que expresan las células de cáncer gástrico exhibió la mejora del crecimiento celular independiente de anclaje
in vitro Opiniones y metástasis en el hígado
in vivo
mientras que la expresión reducida de HOTAIR en células de cáncer gástrico resultó en disminución del crecimiento independiente de anclaje y la difusión peritoneal, lo que sugiere que HOTAIR juega un papel fundamental en la progresión del cáncer gástrico.
Superior expresión de HOTAIR se detectó en las células cancerosas que en las células no tumorales correspondientes en diversos tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama, colon, hígado, páncreas y cáncer de la nasofaringe [9-11,18-20]. En estos tipos de cáncer, de aire caliente también ha demostrado ser asociado con la metástasis y /o mal pronóstico. Por otra parte, el alto nivel de expresión HOTAIR se correlacionó con la supervivencia libre de enfermedad corta en el cáncer de pulmón [12]. Por lo tanto, nuestros resultados presentes son consistentes con estudios previos que indican que la expresión de HOTAIR está involucrado en la agresividad mejorado de varios tipos de células de carcinoma. Por otro lado, no se encontró efecto pronóstico negativo de HOTAIR en el tipo intestinal de cáncer gástrico, aunque el grupo de alta HOTAIR tendió a mostrar menor supervivencia global en comparación con el grupo de bajo HOTAIR. Esto podría ser debido al pequeño número de pacientes en el estudio actual, ya que la expresión forzada de HOTAIR en una línea celular de cáncer gástrico intestinal (MKN74) ganó el fenotipo agresivo
in vitro
y
in vivo
. Otras investigaciones con un gran número de muestras, además del estudio experimental utilizando otras líneas celulares de cáncer gástrico intestinal que se requeriría para abordar esta cuestión.
En el presente estudio, no se encontró ninguna asociación entre la expresión HOTAIR y el crecimiento celular en cáncer gástrico. En el cáncer de hígado de mama, colon y, la participación de HOTAIR en el crecimiento celular no se ha demostrado [9,10,18], mientras que HOTAIR promovido y reduce la proliferación celular en el cáncer de páncreas [11] y el cáncer de pulmón [12], respectivamente. Además, no se encontró ninguna diferencia significativa en el crecimiento del tumor subcutáneo en ratones NOG entre HOTAIR que expresan y las células de control en el presente estudio (datos no se muestran). Basándose en estos resultados, es probable que el vínculo entre la expresión HOTAIR y la proliferación celular depende del tipo de cáncer. En contraste, el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer gástrico fue claramente mejorada de una manera HOTAIR-dependiente. Además, la expresión HOTAIR causó más metástasis en el hígado y otros órganos, y un defecto de HOTAIR suprimió la diseminación peritoneal de células de carcinoma gástrico. Estas observaciones, junto con el hecho de que la expresión HOTAIR contribuye a la metástasis en diversos carcinomas [9-12,18], sugieren que HOTAIR participa principalmente en el proceso metastásico en lugar de en el crecimiento del tumor primario.
En conclusión, la expresión HOTAIR mejorada en el tipo difuso de cáncer gástrico se asoció con la incidencia de la invasión venosa y de mal pronóstico independiente del factor T y la expresión de HOTAIR forzado en células de cáncer gástrico promovido el crecimiento celular independiente de anclaje
in vitro Opiniones y metástasis en el hígado
in vivo
. Estos resultados indican que HOTAIR es probable que participen en el desarrollo de cáncer gástrico y también podría ser una diana terapéutica en el tratamiento del cáncer gástrico.
Apoyo a la Información
Figura S1. Francia El asociación de la proliferación celular con la expresión HOTAIR. Los resultados de ensayo de MTT evaluada a las 72 horas se normalizaron a que a las 24 horas. No se encontró relación entre la expresión HOTAIR y la proliferación de células de cáncer gástrico
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077070.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
Agradecemos al profesor Kitamura (La Universidad de Tokio, Tokio, Japón) para proporcionar células de platino-a.