Extracto
Los mecanismos de fosforilación de la proteína anormal que regulan la invasión celular y la metástasis en el cáncer de páncreas sigue siendo oscuro. En este estudio, hemos utilizado matriz fosforilación de alto rendimiento para poner a prueba dos líneas celulares de cáncer de páncreas (células PC-1 con la mínima, y las células PC-1.0 con un alto potencial de invasión y metástasis). Hemos tomado nota de que un total de 57 proteínas reveló una expresión diferencial (doble cambio ≥ 2,0). Seis proteínas candidatas fueron validados por Western blot con los resultados encontrados para estar de acuerdo con la matriz. De 57 proteínas, 32 proteínas hasta reguladas (por ejemplo CAMK1-alfa y p90rsk) eran principalmente involucrados en ErbB y neurotrofina vías de señalización como se determina usando el software DAVID, mientras que 25 proteínas-regulado (por ejemplo, una oferta y BRCA1) estaban estrechamente implicados en la apoptosis y vías de señalización de p53. Por otra parte, se encontraron cuatro proteínas (AKT1, Chk2, p53 y p70s6k) con diferentes sitios de fosforilación, no sólo entre hasta reguladas, sino también entre proteínas-regulado. Es importante destacar que los sitios de fosforilación específicos pueden afectar a las funciones biológicas de células. software CentiScaPe calcula características topológicas de cada nodo de la interacción proteína-proteína (PPI) de la red: se encontró que AKT1 posee los grados máximos de nodo y de intermediación en la red PPI proteína de regulación (26 nudos, la longitud del camino promedio: 1,89, grados de nodos : 6,62 ± 4,18, intermediación: 22.23 ± 35.72), y p53 en la red PPI proteína baja regulación (17 nudos, la longitud del camino promedio: 2.04, 3.65 grados de nodos: ± 2,47, intermediación: 16.59 ± 29.58). En conclusión, la identificación de fosforilación de la proteína anormal en relación con la invasión y la metástasis puede permitir la identificación de nuevos biomarcadores en un esfuerzo por desarrollar nuevas dianas terapéuticas de fármacos para el tratamiento del cáncer de páncreas
Visto:. Tan X, Liu P, Huang Y, Zhou L, Yang Y, Wang H, et al. (2016) Análisis de Phosphoproteome Invasión y Metástasis Factores relacionados en células de cáncer de páncreas. PLoS ONE 11 (3): e0152280. doi: 10.1371 /journal.pone.0152280
Editor: Dong Wang, de la Universidad Médica de Harbin, China
Recibido: 14 Noviembre 2015; Aceptado: 12 Marzo de 2016; Publicado: 25 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Tan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Liaoning de China (Nº 2014021006)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que existen conflictos de intereses.
Introducción
el cáncer de páncreas es una enfermedad altamente maligno con un pronóstico muy pobre. A pesar de considerables avances en las técnicas de ultrasonido radiológicos y endoscópicos, a menudo se presenta como una enfermedad localmente avanzada o metastásica en la mayoría de los pacientes, y sólo alrededor del 10-20% de los pacientes se consideran candidatos para la cirugía [1, 2]. Aparte de la cirugía, no existen otros métodos eficaces de tratamiento, y la tasa de supervivencia para los pacientes resecados también es extremadamente baja. La razón principal de un mal pronóstico es recurrencias locales y /o metástasis a distancia después de la cirugía. Esto sugiere que la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares implicados en la invasión y metástasis de cáncer de páncreas es importante y requiere una mayor exploración.
Sin embargo, las modificaciones posteriores a la traducción de proteínas en líneas celulares de cáncer de páncreas, que pueden jugar un papel esencial en el regulación de las respuestas celulares, no se ha demostrado claramente. Por tanto, es importante identificar los eventos de fosforilación y para determinar los perfiles de fosforilación de proteínas enteras de células tumorales. Recientemente, mediante la comparación de los phosphoproteomes en diferentes etapas de desarrollo de cáncer de piel en ratones, se identificaron proteínas asociadas con respuestas celulares tempranas y tardías, proporcionando nuevos conocimientos sobre la progresión de la enfermedad [3]. Batchu et al. encontró que el tratamiento de miR-26a podría restaurar las funciones de tipo salvaje de p53 mutante a través de la fosforilación en residuos de sus Ser9 y Ser392, lo que resulta en la inhibición del crecimiento celular [4]. Por lo tanto, la fosforilación específica de sitio de proteínas juega un papel importante en la regulación de procesos celulares.
Sin embargo, en lo que sabemos, los estudios no han analizado los perfiles de phosphoproteome de las dos líneas celulares homogéneos (PC-1 con una baja, y PC-1.0 con un alto potencial de invasión y metástasis) [5, 6] en la investigación del cáncer de páncreas. Nuestro objetivo es comparar los cambios en 582 sitios de fosforilación de proteínas entre 452 PC-1 y células PC-1.0 mediante la utilización de la tecnología de matriz fosfo Explorador de anticuerpos. Además, las vías y redes que relacionan con fosfoproteínas identificados en nuestro estudio muestran variaciones importantes en sus componentes.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
Dos hámster se utilizaron las líneas celulares de cáncer de páncreas: células débilmente invasivas y metastásicas (PC-1), y células altamente invasivos y metastásicos (PC-1.0). La línea celular PC-1 se estableció a partir de los adenocarcinomas ductales pancreáticas inducida por el BOP en un hámster dorado de Siria. La línea celular PC-1.0 se establece a partir de un tumor subcutáneo producido después de la inoculación de un hámster de PC-1 células [5,6].
in vitro
, PC-1.0 células son principalmente las células individuales, mientras que las células PC-1 crecen como colonias de células semejantes a islas.
In vivo
, invasión local por células PC-1.0 y desarrollo local de las células PC-1 se observaron [7].
células PC-1.0 y PC-1 se incubaron en medio RPMI-1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EE.UU.), suplementado con 10% de suero fetal bovino (Bioserum, Canterbury, Victoria, Australia), 100 U /ml de penicilina G y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada del 5% de CO
2/95% de aire.
perfiles de fosfo-proteínas mediante el Explorador de anticuerpos fosfo matriz
lisados
celulares obtenidas a partir de células PC-1 y PC-1.0 se aplica a una matriz fosfo Explorador de anticuerpos (Full Moon Biosystems, Sunnyvale, CA, EE.UU.). La matriz contenía 1318 anticuerpos. Cada uno de los anticuerpos tiene dos repeticiones que se imprimen en portaobjetos de vidrio recubiertos, junto con varios controles positivos y negativos. Brevemente, los lisados celulares se extrajeron con el kit de ensayo de anticuerpos de matriz que contenía un inhibidor de cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa, y se realizaron según el protocolo del fabricante. 25 g de lisados de células fueron marcadas con 3 l de biotina. diapositivas Antibody microarrays se bloquearon primero en una solución de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente, se aclaró con agua de calidad Milli-Q, y se secaron con nitrógeno comprimido. Y después se incubaron con lisados de células marcadas con biotina en solución a temperatura ambiente de acoplamiento para 2 h. diapositivas de matrices se lavaron cuatro veces con 60 ml de 1 × solución de lavado y se enjuagaron extensivamente con agua de calidad Milli-Q antes de la detección de las proteínas biotinilado unido utilizando estreptavidina-Cy3 conjugado. Las diapositivas fueron digitalizadas en un escáner GenePix 4000 y las imágenes se analizaron con GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
Un cambio de relación de fosforilación se calcula en base a la siguiente ecuación donde la expresión de fosforilados proteínas se normalizó a la expresión de proteínas correspondiente no fosforilado en tanto experimental (PC-1.0) y los datos de referencia (PC-1). Se consideraron proteínas fosforiladas que se expresó diferencialmente cuando un aumento (≥ 2,0) o disminuir (≤ 0,5) se produjeron en la relación de los niveles de expresión entre las células PC-1 PC-1.0 y. los datos de fosforilación de proteínas fueron confirmados por Western blot.
Los anticuerpos y reactivos
anticuerpos policlonales de conejo contra epítopos de ABL1 humana, pAbl1-Tyr204 (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.), ITGB4 , ITGB4-Tyr1510 (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), Myc, PMYC Ser62, Fos, el PFOS Thr232, IRS-1, PIRS-1-Ser636, Raf1, pRaf1-Tyr341 y ß-actina (Santa Cruz Biotechnology, Dallas , TX, EE.UU.) se utilizaron como anticuerpos primarios. anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante o marcados con FITC anticuerpos fluorescentes (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para el Western Blot. FOS y el IRS-1 siRNA fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Dallas, TX, EE.UU.). inhibidor RAF1 (GW5074) se adquirió de Selleck Químicos (Houston, TX).
Western blot
Western Blot se realizó como se describió anteriormente [7]. Las células se recogieron sobre hielo utilizando tampón RIPA suplementado con un cóctel inhibidor de la proteasa e inhibidor de la fosfatasa durante 30 minutos. En resumen, las muestras de proteína total equivalente (20 mg) se corrieron en un gel de poliacrilamida losa de 5% y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad, Anaheim, CA, EE.UU.). Las membranas se incubaron con el anticuerpo primario, diluido en 0,1% de Tween-20 /PBS, durante la noche a 4 ° C. Las transferencias se incubaron con anticuerpo secundario de rábano picante conjugado con peroxidasa (diluido 1: 5000) en 0,1% de Tween-20 /PBS. Las proteínas se visualizaron utilizando reactivos de detección de quimioluminiscencia (Santa Cruz Biotechnology).
in vitro
ensayos de invasión y migración
células PC-1.0 se transfectaron transitoriamente con diferentes siRNAs utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY), o fueron suprimidos usando inhibidor RAF1. Para invasión ensayos Transwell, las células transfectadas (5 × 10
4 células /ml) en medio libre de suero a las cámaras superiores, que fue adquirido de Costar (8 micras filtros de tamaño de poro, Nueva York, Nueva York) y recubierta con Matrigel (dilution1: 4). Las cámaras inferiores se rellenaron con medio RPMI-1640 que contiene 10% de suero. Después de 24 h de incubación, se eliminaron las células que quedan en las cámaras superiores, y las células invasoras en las cámaras inferiores se fijaron con paraformaldehído al 4% (Sigma-Aldrich), se tiñeron con violeta cristal a temperatura ambiente, y se contaron bajo un microscopio. Para el ensayo de migración de cicatrización de la herida, se sembraron las células transfectadas en placas de 6 pocillos durante 24 h. Una herida en todo 1 mm se hizo a través de la monocapa con la punta de una pipeta de 200 l. A continuación, las fotos fueron tomadas a las 0, 6 y 12 h utilizando un microscopio. Se realizaron las células PC-1.0 como se ha descrito anteriormente como un control. Cada experimento se realizó por duplicado y por tres veces. Para confirmar el nivel de tres proteínas en la célula desmontables, las células se sometieron a PCR en tiempo real y análisis de transferencia de Western usando cebadores y anticuerpos específicos, respectivamente. Los cebadores usados para la amplificación de los FOS y el IRS-1 se enumeran en la Tabla S1.
ontología de genes y Kyoto Enciclopedia de genes y genomas vía (KEGG) análisis y la búsqueda de herramientas para la recuperación de genes que interactúan /Proteínas
Para la detección de los términos de ontología de genes (GO) enriquecido de manera significativa, se utilizó el plugin de Cytoscape BINGO [8,9]; proteínas fosforiladas expresados diferencialmente se montan automáticamente a categorías de proceso biológico, la función molecular o componente celular. GO grupos con un corregida
P-valor
& lt; 0,01 se designan para los diferentes niveles de significación. analiza la vía de las proteínas fosforiladas expresados diferencialmente se realizó utilizando DAVID (la base de datos para anotación, y Visualización Descubrimiento e Integración) los recursos de bioinformática (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) [10] bioinformática y vías de señalización cambiado de manera significativa se basaron seleccionado en un
P-valor
& lt; 0,01, y FDR (False Discovery Rate) & lt; 10%. Por lo tanto, el enriquecimiento se pudo medir cuantitativamente mediante la prueba exacta de Fisher modificada. El uso de una herramienta de búsqueda para la recuperación de los genes que interactúan /base de datos de proteínas (CADENA) (http://www.string-db.org/), se obtiene una red de interacción proteína-proteína (PPI) [11]. Una red PPI se construyó cuando una puntuación de confianza de más de 0,9 mostró que sólo las interacciones con un alto nivel de confianza fueron considerados como enlaces válidos en la red PPI.
Análisis topológico de la red PPI
para una mejor comprensión de la red PPI, software CentiScaPe [12] se utilizaron para analizar las características topológicas de la red y para calcular la distribución de nodo de grado, la longitud del camino promedio, el coeficiente topológica y de intermediación. Podríamos analizar directamente las redes de interacción molecular utilizando herramientas visualizados, y obtenido interesantes proteínas clave. Además, se empleó un servidor web GeneMANIA (http://www.genemania.org/) para predecir las redes. Tal herramienta servidor web hizo predicciones de función génica eficaz, incluyendo la co-expresión, interacciones físicas, las vías y las redes predichos, que se basan en datos experimentales se informó anteriormente [13]. En este informe, se empleó un método de ponderación seleccionada de forma automática y se utiliza humano como una especie de código para predecir las redes.
Análisis de las Estadísticas
El análisis estadístico y los gráficos se realizaron utilizando GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego CA). Los resultados se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Las comparaciones de los datos cuantitativos se analizaron de Student
t
prueba de ANOVA o entre dos grupos (de dos colas;
P-valores
& lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativa).
Resultados
diferencialmente expresados fosforilación de la proteína identificada por PEX100 en las células pancreáticas altamente (PC-1.0) y débilmente (PC-1) invasivas y metastásicas
Para identificar diferencialmente expresado señalización asociada a proteínas fosforiladas entre altamente (PC-1.0) y débilmente (PC-1) las células de cáncer invasivo y metastásico, se compararon los niveles de expresión de proteínas específicas fosfo-anticuerpo en las dos líneas celulares de cáncer de páncreas. De los anticuerpos 1318 analizados en experimentos de microarrays, un total de 57 proteínas mostró expresión diferencial utilizando una relación pliegue ≥ 2 como el criterio de corte. De estos 57 proteínas, los niveles de expresión de 32 proteínas se incrementaron notablemente en PC-1.0 en comparación con las células PC-1 (Tabla 1 muestra los diez proteínas más upregulated). En contraste, los niveles de expresión de 25 proteínas se redujeron significativamente en PC-1.0 en comparación con las células PC-1 (Tabla 2 muestra las diez proteínas más downregulated). Las relaciones que se muestran representan los niveles de expresión en las células PC-1.0 en comparación con los niveles de expresión en las células PC-1. CAMK1-α se sobre-expresa en altos niveles en células PC-1.0 mientras que Smad1 se había reducido regulado, revelando una baja intensidad matriz. Por otra parte, se encontraron cuatro proteínas (AKT1, Chk2, p53 y p70s6k) con diferentes sitios de fosforilación, no sólo entre hasta reguladas, sino también entre proteínas-regulado. Las imágenes reales gama de chips se muestran en la Tabla S2 y la expresión de todas las proteínas se enumeran en la Tabla S3.
Validación de proteínas de fosforilación por western blot, y las proteínas diferencialmente juegan un papel importante en la migración celular y la invasión de PC-1.0 metastásico
Para validar los datos de la fosforilación de proteínas, los niveles de expresión de proteínas seis seleccionados al azar de las comparaciones de PC-1.0 y PC-1 células fueron examinados por Western blot (Fig 1). Las transferencias Western revelaron que las seis proteínas mostraron un aumento de la fosforilación en células PC-1.0 consistentes con nuestros datos de la matriz, lo que confirma la fiabilidad de este último. Para entender las relaciones funcionales de alteración diferencial en la fosforilación de proteínas en células altamente metastásicas PC-1.0, ensayos de invasión y migración se llevaron a cabo. Western blot y PCR en tiempo real se realizaron análisis para confirmar la eficacia de siRNA o inhibidor baja regulación (Como se muestra en la Tabla S3). Se observó una fuerte inhibición de la migración de FOS, IRS-1 y RAF1 usando siRNA o anticuerpo de bloqueo (Fig 2A), y con respecto a la invasión, FOS, IRS-1 y RAF1 también causó una reducción significativa en la capacidad de invasión (Fig 2B).
Como se muestra, la expresión total de cada proteína era igual en ambas líneas celulares, mientras que en el nivel de fosforilación, la expresión de seis proteínas fue más fuerte en PC 1.0 células que las células PC-1. Los marcadores moleculares se indican.
(A) Efecto de tres proteínas de la migración después de usar siRNA o bloqueo de anticuerpos en células altamente metastásicas PC-1.0. Las células se incubaron durante 24 h. La migración porcentaje se calcula y representa gráficamente. * En comparación con el PC-1.0,
P-valor
& lt; 0,01. (N = 3) (B) Cuantificación de transwell ensayo para grupo tratado y el grupo control. Se contaron las células en pocillos por triplicado y en tres experimentos idénticos, * en comparación con el PC-1,0,
P
-valor & lt; 0,01. (N = 3) guía empresas
Clasificación funcional, la red y la vía de análisis
Para entender los procesos biológicos similares que se correlacionan con la invasión y la metástasis de las células del cáncer pancreático, hemos explorado estas usando de nuevo el herramienta de anotación funcional en línea, DAVID, e incluyendo las vías KEGG análisis. GO análisis plazo mostró que los objetivos fueron enriquecidos en muchos procesos (Tablas 3-5), incluyendo la fosforilación de aminoácidos y proteínas modificación posterior a la traducción. Los análisis reveló vía estos objetivos hasta reguladas fueron enriquecidos en 27 KEGG vías (Figura 3A), que son esenciales para el metabolismo de la insulina (la vía de señalización del ciclo celular), la inmunidad (vía de señalización del receptor de células T) y de desarrollo (vía de señalización de ErbB). Las proteínas forman una red PPI y están implicados en la alteración y el control de la invasión celular en diversos sistemas biológicos. Los datos se muestran en la figura 3B y 3C. La figura 4A y 4D muestran la red de interacción construido en Cadena después de la consulta del 32-regulados y hasta 25 proteínas reguladas por los encontrados en células PC-1.0. Además, cuando la puntuación de confianza era & gt; 0.900, CAMK1-α, MKK7 PIM-1 y /MAP2K7 ya no estaban incluidos en una red en marcha regulada, así como MAPKAPK2, citoqueratina 8, GATA1, GRK1, ACC1, PDGFRA y Smad1 en una red regulada hacia abajo. Markov (MCL) y K-means algoritmos de racimo fueron utilizadas para analizar aún más las redes PPI. En comparación, se obtuvo una consecuencia aproximado de clúster en el que el punto de corte fue MCL 2 y el punto de corte K-media fue de 4 en tanto hasta reguladas (Fig 4B y 4C) y las reguladas (figura 4E y 4F) redes PPI. Las proteínas con menos o ninguna interacción se encontró más hacia la periferia de la red. Se requiere más investigación experimental de estas proteínas no relacionadas con el fin de comprender su función real en una red PPI.
KEGG y BioCarta vía anotaciones funcionales de los expresados diferencialmente hasta reguladas (A, C) y las reguladas (B ) proteínas (
P-valores
& lt; 0,01, Benjamin & lt; 0,05). puntajes de enriquecimiento correspondientes a cada vía proporcionada por la herramienta de anotación DAVID se muestran como -log
P-valores
. proteínas que estaban anotaciones funcionales de la vía BioCarta solamente se enriquecieron en la señalización de apoptosis en respuesta al daño del ADN abajo reguladas.
(A) Una red PPI, como se muestra en la vista interactiva, genera una base de datos STRING para revelar las interacciones funcionales entre las proteínas hasta reguladas. Cada nodo representa una proteína, y cada borde representa una interacción (
P-valores
= 6.06E-12); (B) hasta reguladas algoritmos de racimo MCL proteínas "derivados utilizando una cuerda. MCL = 2; (C) algoritmos de conglomerados de K-medias proteínas reguladas-Up '. K-medias = 4; aproximadas mismas consecuencias por dos grupos; (D) Una red PPI revela interacciones funcionales entre las proteínas reguladas por (
P
-valor = 1.47E-6); (E) hacia abajo-regulada algoritmos de racimo proteins'MCL. MCL = 2; (F) de K-medias algoritmos de racimo proteínas reguladas por '. K-medias = 4.
Además, el software CentiScaPe, que calculan las características topológicas de cada nodo, se utilizaron para obtener una comprensión en profundidad de las características biológicas de la red PPI, pero no incluyendo las proteínas no relacionadas. La red PPI regulación consistía en 26 nodos con una longitud del camino promedio de 1,89. nodo de grado fue de 6.62 ± 4.18, e intermediación era 22.23 ± 35.72 (Tabla 6). Con el mismo método, nuestra red PPI baja regulación representada 17 nodos con una longitud del camino promedio de 2,04. nodo de grado fue 3,65 ± 2,47 y 16,59 ± era intermediación 29.58 (Tabla 7). Las proteínas de alto valor fueron más importantes en la red y esto sugiere un papel central en el mantenimiento de la funcionalidad y la coherencia de los mecanismos de señalización. En nuestra red PPI en marcha regulada, centro de proteínas con alto grado de nodo y de intermediación (& gt; Means) fueron AKT1, CTNNB1, FOS, NFkB p65, SYK, TP53 y MYC. Por otra parte, la red regulada hacia abajo incluye BRCA1, LCK, AKT1, y TP53 (Fig 5). En particular, AKT1 y TP53 muestran la puntuación más alta para todas las centralidades calculadas, lo que sugiere su papel regulador central en hasta reguladas y proteínas en una red de las reguladas.
Todos los nodos que tienen un valor de centralidad mayor o igual a la umbral se resaltan con un color gris claro en la vista de red. (A) las proteínas hasta reguladas; (B) las proteínas reguladas por.
A continuación, fosfoproteínas expresados diferencialmente fueron subidos a una herramienta para predecir GeneMANIA una red de co-expresión. Como resultado de ello, se añadieron 20 genes a la red (Fig 6, Tabla 8). Dicha red co-expresión ayuda a explicar procesos distintos que se encuentran en líneas celulares de cáncer de páncreas. En general, dichas propiedades topológicas de la red pueden mejorar nuestra comprensión de los principales genes asociados con la invasión.
Una red de genes diferenciales se generó usando GeneMANIA. La red de la izquierda representa hasta regulados los genes y la red de la derecha representa reguladas por los genes. Además, existen cinco genes, tanto en las redes hacia arriba y hacia abajo-regulados (TP53, CHEK2, AKT1, RPS6KB1, RAF1). genes de consulta se indican con puntos negros y co-expresión se indica por líneas de color rosa. nodos grises indican los genes predichos.
(Peso ≥ 0,04).
Discusión
En los últimos años, muchos investigadores han utilizado endoscópica guiada por ultrasonido fina aspiración con aguja fina (EUS-FNA) como método de diagnóstico preoperatorio para reducir los procedimientos quirúrgicos innecesarios en un esfuerzo para lograr mayores tasas de supervivencia [14,15]; Sin embargo, los resultados no han sido satisfactorios. ¿Cómo reducir la invasión y metástasis de cáncer de páncreas sigue siendo un área de intensa investigación y del problema en curso. La fosforilación es el más importante y está implicado en muchos procesos celulares (por ejemplo, proliferación, diferenciación, transducción de señales, el metabolismo, la apoptosis, celular-señalización, regulación transcripcional y traduccional) [16-23].
Como se describe en nuestra estudio anterior, se han establecido dos líneas celulares de cáncer de páncreas a partir de un modelo experimental de cáncer de páncreas [5,6]. Las células no disociadas-células (PC-1) y disociadas (PC-1.0) muestran altos similitudes histológicas, pero difieren en sus capacidades invasivas y metastásicas. Hemos racionalizado que el uso de tales líneas celulares sería minimizar la influencia de la utilización de células de diferentes orígenes tisulares. Por lo tanto, el análisis de phosphoproteomes expresados diferencialmente en dos líneas celulares (PC-1.0 y PC-1) es particularmente importante para el estudio de los mecanismos de invasión y metástasis del cáncer de páncreas.
Con el fin de comprender mejor las diferentes funciones biológicas producido por diferentes modificaciones de fosforilación de la misma proteína en las dos líneas celulares (PC-1.0 y PC-1), una técnica de matriz de la fosforilación de alto rendimiento se utilizó en nuestros análisis. La matriz detecta los niveles de fosforilación de proteínas en residuos de aminoácidos específicos (por ejemplo, Ser, Thr, Tyr), y siempre preciso y eficiente de perfiles phosphoproteome de cada línea celular de cáncer de páncreas. Después de minería de datos, se ha observado que de los 57 de la firma proteínas de expresión diferencial, seis genes codifican 12 proteínas, con la fosforilación ocurre en diferentes sitios (es decir, NFkB-p65, p70S6K, Smad2, Chk2, p53 y AKT1). La fosforilación específica de sitio de proteínas que normalmente se traduce en diferentes funciones biológicas [24]. Pero las funciones de los múltiples sitios de fosforilación en una única molécula de proteína no han sido claramente dilucidado. Por lo tanto, Guo et al. inmunoensayo usado proteómico nanofluídico (NIA) para analizar y caracterizar la fosforilación de proteínas de varios sitios diferentes [25]. En comparación con el Guo et al. estudio, nuestros resultados indican que la fosforilación en Thr72 y Ser124 de AKT1 tiene un papel más importante y puede estar estrechamente relacionada con la invasión del cáncer de páncreas y metástasis
.
En general, las quimioquinas son pequeñas proteínas que juegan un papel importante en el control la migración de diversas células [26]. Nuestros resultados muestran que 10 proteínas que hemos identificado podrían ser clasificados como quimiocinas (es decir ITGB4, plcg2, IRS-1, FOS, CTNNB1, plcg1, CD227, PKD1, P53 y ACTC1), de acuerdo con http://www.phosphosite.org [27]. Otros tipos de proteínas relacionadas con la invasión-eran factores de transcripción (MYC, Rb, FOS, CTNNB1, NFkB p65, p53, BRCA1, GATA1, Smad1 y Smad2) y las proteínas del citoesqueleto (lamina A, citoqueratina 8 y ACTC1).
a través de análisis vía KEGG, se encontró que estas proteínas de expresión diferencial existían en dos rutas de señalización principales (ErbB y vías de señalización de neurotrofinas, como se muestra en la figura 2A). Entre la vía alterada, encontramos PI3K y MAPK como actores principales en el proceso de la motilidad celular. En nuestros estudios anteriores, se encontró que la activación del EGFR mediada por MEK /ERK vía de señalización inducida por la invasión de células en las células PC-1, por el contrario, el inhibidor de EGFR AG1478 podría inhibir por encima de la vía y reducir la invasión de células en las células PC-1.0 [28] . En este estudio, hemos detectado la hiperfosforilación de ErbB3, ErbB4, Raf1, p90rsk, MSK1, MYC y FOS en las células PC-1.0 en comparación con las células PC-1, pero no se observaron cambios en Grb2, MEK, ERK y Elk1. Además, se empleó Raf1 inhibidor y FOS siRNA para estudiar la relación entre la proteína y la invasión. Los resultados revelaron que la caída de FOS o Raf1 inhibió significativamente la migración y la invasión de las células PC-1.0. Nuestros resultados, no se observaron señalización /ERK Grb2 /MEK, tal vez como resultado de las limitaciones metodológicas. Nuestros datos muestran que p90rsk se hiperfosforilada, sin embargo, Kang et al. informó de que P90RSK2 promueve la invasión y metástasis de la cabeza humana y carcinoma de células escamosas del cuello (HNSCC) [29]. P90rsk puede estar implicada en la regulación de la invasión de células de cáncer de páncreas y metástasis
.
La otra vía de señalización (PI3K /AKT) implica generalmente en la proliferación celular y el ciclo celular [30]. En nuestros datos, hemos probado varios reguladores de aguas arriba de PI3K /AKT como VEGFR1 /2/3, ErbB2 /3/4, PDGFRa, MET, EGFR, FLT3, KIT, y de IGF-1R. Entre estas proteínas, ErbB3 y ErbB4 son altamente fosforilada, en contraste, PDGFRa y KIT se reducen significativamente. Mientras tanto, se observó que el IRS-1 fosforilación en Ser 636 se incrementó notablemente, pero el IGF-1R no se ha modificado. En particular, el IRS-1 fosforilación puede ser regulada negativamente por la activación de p70S6K en la vía de señalización de PI3K /AKT /mTOR [31]. En este estudio, hemos encontrado un aumento de la fosforilación en Ser371 p70s6k y Thr 421, y la disminución en la Ser 418 fosforilación. Por lo tanto, nuestros estudios sugieren que el PDGFRa y KIT regulación a la baja en el cáncer de páncreas conduce a la disminución de la fosforilación en Ser 418 p70S6K, y el aumento de IRS-1 fosforilación en Ser 636 por medio del incremento de señalización PI3K /AKT mTOR /p70s6k. Hiperfosforilación de IRS-1 mediada posteriormente activación de la vía PI3K /AKT. El hallazgo podría indicar el mecanismo de resistencia en el cáncer de páncreas, como resultado, los ensayos clínicos de combinación en el cáncer de páncreas deben ser considerados.
En resumen, la identificación de phosphoproteomes expresados diferencialmente, como se revela en nuestro estudio, apuntará a la mecanismos subyacentes a la invasión y metástasis de cáncer de páncreas. En el futuro, tenemos que prestar más atención a la identificación de la phosphoproteome activado, en particular los residuos de aminoácidos específicos. En su conjunto, la identificación de la fosforilación de la proteína anormal, que está relacionada con la invasión y la metástasis, puede permitir la identificación de nuevos biomarcadores para la detección precoz del cáncer de páncreas.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Las secuencias de cebador y el inhibidor usado en el ensayo.
en tiempo real se realizó PCR para analizar el nivel de FOS o IRS-1 mRNA en las líneas celulares desmontables. El nivel de Raf1 desmontables se confirmó mediante Western blot
doi:. 10.1371 /journal.pone.0152280.s001 gratis (DOCX)
S2 tabla. La matriz de fosfo Explorador de anticuerpos fue escaneada en un escáner GenePix 4000
doi:. 10.1371 /journal.pone.0152280.s002 gratis (DOCX)
S3 Tabla. se presentó la expresión de todas las proteínas de la matriz de fosfo Explorador de anticuerpos México La coordenadas y las proteínas se indica en la tabla
doi:.. 10.1371 /journal.pone.0152280.s003 gratis (XLSX)