Extracto
Este estudio examinó el papel desempeñado por los factores inducibles por hipoxia (HIF) en maligna mantenimiento de fenotipo y la señalización de Wnt canónica. En virtud de normoxia, se determinó que tanto HIF-1α y HIF-2α se expresan en células de cáncer de colon humano pero no en sus homólogos no malignas. La caída estable de HIF-1α o la expresión de HIF-2α inducida efectos negativos sobre el fenotipo maligno de las células de cáncer de colon, con la producción de lactato, la velocidad de la quimiotaxis de apoptosis, migración, mediada por CXCR4, y la actividad tumorigénico todo ser afectadas significativamente por la caída HIF y con HIF-1α agotamiento de ejercer un efecto mayor. Desmontables de estas dos transcripciones HIF inducidos efectos diferentes e incluso opuestas sobre la actividad transcripcional β-catenina en las células de cáncer de colon con diferentes vías de señalización Wnt genéticos. En las células SW480, desmontables HIF-2α no afectó los niveles de β-catenina, el aumento de la actividad transcripcional de β-catenina mediante la inducción de su acumulación nuclear, mientras que HIF-1α silenciar negativamente afectada la estabilidad y la actividad transcripcional de β-catenina, induciendo su salida a partir de los núcleos y su reclutamiento a la membrana celular por e-cadherina. Además, aunque el agotamiento de HIF-1α induce una inversión de la transición epitelio-mesenquimal (EMT), el silenciamiento HIF-2α alterada la expresión de los marcadores de células madre CD44, Oct4, y CD24 y del marcador de diferenciación CK20 en el opuesto dirección que el silenciamiento de HIF-1α. Sorprendentemente, desmontables HIF-2α también mejoró β-catenina actividad transcripcional en condiciones de hipoxia en las células que muestran la señalización de Wnt normales, lo que sugiere que el gen modula negativamente la señalización de Wnt canónica en células de cáncer de colon. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que HIF juegan papeles opuestos en la señalización Wnt canónica y son esenciales para la troncalidad y los tumores malignos mantenimiento de las células de cáncer de colon
Visto:.-Santoyo Ramos P, Likhatcheva M, García-EA Zepeda, Castañeda-Patlán MC, Robles Flores-M Factores (2014) inducible por hipoxia modular la troncalidad y malignidad de las células del cáncer de colon por interpretar papeles opuestos en señalización Wnt canónica. PLoS ONE 9 (11): e112580. doi: 10.1371 /journal.pone.0112580
Editor: Gregory M. Kelly, Universidad de Western, Canada |
Recibido: 2 Julio, 2014; Aceptado: 8 Octubre 2014; Publicado: 14 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Santoyo-Ramos et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que, por razones aprobadas, algunas restricciones de acceso se aplican a los datos subyacentes a los hallazgos. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por becas de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM IN226111 DGAPA-y IN215514) y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT CB2011-151731). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
señalización de Wnt ha sido bien caracterizado como uno de los más importantes contribuyentes a la tumorigénesis en muchos tipos de tumores sólidos. canónica de señalización Wnt aberrante se sabe que contribuyen a la progresión temprana en la mayoría de los cánceres colorrectales. De hecho, una gran cantidad de evidencia experimental ha demostrado que las mutaciones en el gen act poliposis adenomatosa coli (APC) como porteros en la patogénesis molecular de la mayoría de formas esporádicas y hereditarias de carcinoma colorrectal [1], [2]. La vía Wnt también se ha demostrado que desempeñan un papel importante en el desarrollo y la regulación de los sistemas de células madre adultas, y la señalización de Wnt canónica apoya la formación y el mantenimiento de ambas células madre madre y el cáncer (CSC) [3].
señalización canónica de Wnt opera a través de la regulación de la fosforilación y degradación de la transcripción co-activador de β-catenina. Sin la estimulación por Wnt, β-catenina se ensambla en el llamado complejo de destrucción, en la que APC juega un papel central, y este complejo también incluye axina, GSK-3β y la caseína quinasa 1. Este complejo dirige una serie de eventos de fosforilación en ß-catenina que hacen que sea un objetivo para la ubiquitinación y la posterior proteolisis a través de la proteasoma [4]. La estimulación por Wnt conduce a la inhibición de la ruptura β-catenina, lo que permite β-catenina se acumule, entrar en el núcleo, y activar los genes Wnt objetivo, tales como
ciclina D1
y
C-MYC
proto -oncogenes, que promueven la entrada de la célula en la fase S del ciclo celular [5].
hipoxia tumoral y los mediadores críticos de la vía de señalización celular de oxígeno, es decir, los factores inducibles por hipoxia (HIF) , se sabe que regulan múltiples etapas de la tumorigénesis y por lo general se asocian con cambios en el metabolismo, la neovascularización, invasión, metástasis, resistencia a los medicamentos, y en última instancia, los resultados clínicos pobres [6]. HIF son factores de transcripción heterodiméricas que consisten de HIF-α y HIF-β (o ARNT) que se expresan constitutivamente en los niveles de transcripción y traducción. HIF-1α y HIF-2α (también conocido como EPAS1) son los dos miembros mejor estudiados de la familia HIF-α. En condiciones de normoxia, las subunidades HIF-alfa son hidroxilados en los residuos clave de prolina, lo que les permite ser reconocido por el supresor de tumor de von Hippel-Lindau (pVHL), el componente de reconocimiento de sustrato de un complejo de ubiquitina ligasa E3 que se dirige a HIF-α para la degradación proteasomal. señalización hipóxico estabiliza HIF-α mediante la inhibición de la hidroxilación prolil, ya su vez la degradación ubiquitina proteasoma, por lo que HIF-α capaz de dimerizar con ARNT, la unión al ADN elemento sensible a la hipoxia, y la contratación de la p300 transcripción coactivador /CBP para la activación transcripcional de una serie de genes sensible a la hipoxia [7]
. Dadas las similitudes estructurales de HIF-1α y HIF-2α, se pensaba que eran
a actuar de forma redundante en la respuesta celular a la hipoxia. Sin embargo, un creciente cuerpo de evidencia indica que HIF-1α y HIF-2α inducen la expresión de diferentes conjuntos de genes. Aunque HIF-1α y HIF-2α han compartido objetivos tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que también regulan objetivos de genes únicos; HIF-1α regula enzimas glucolíticas [8] y HIF-2α activa el factor de células madre Oct4 [9]. Consistente con este hallazgo, Imamura et al. distintos conjuntos identificados de HIF-1α y genes diana HIF-2α en células de cáncer de colon SW480 mediante análisis de cDNA microarray [10].
Crosstalk se ha informado entre canónica de señalización Wnt y la señalización de HIF en la progresión tumoral y la metástasis. Sin embargo, los mecanismos moleculares implicados en esta diafonía siguen siendo poco conocidos. Varios informes han indicado que las actividades de los factores de transcripción regulados por hipoxia juegan un papel importante en la regulación de la quiescencia de células madre [9] y que la activación mediada por Wnt HIF-1α promueve el mantenimiento de la actividad de células madre [11]. Mazumdar et al. mostró que HIF-1α modula la señalización Wnt /β-catenina en las células madre embrionarias de hipoxia mediante la mejora de la activación de β-catenina y la expresión de los efectores aguas abajo LEF-1 y TCF-1 [11]. Además, hay evidencia experimental apoya la hipótesis de que ambas condiciones de hipoxia y la activación de Wnt canónica están involucrados en la activación de un programa de EMT en muchas células del cáncer [12], [13]. Además, la diafonía se ha demostrado que existen entre canónica de señalización Wnt y la señalización de HIF en la progresión tumoral y la metástasis a través de la interacción sinérgica del gen diana Wnt
c-MYC
con HIF-1α [14], [15]. A este respecto, aunque las respuestas de HIF-1α fisiológicas normales en las células no malignas pueden inhibir la actividad de la normal de c-Myc, paradójicamente, la expresión desregulada de oncogénica de c-Myc que existe en muchos tipos de cáncer, como el carcinoma colorrectal trabaja junto con HIF 1α para conferir el fenotipo metabólico del tumor se describe como el efecto Warburg o glucólisis aeróbica, así como para promover la angiogénesis [14].
el conocimiento actual de los mecanismos homeostáticos que regulan la troncalidad de colon y tumores malignos epiteliales sigue siendo incompleta, evitando significativa los avances en el tratamiento del carcinoma de colon. Este estudio examinó los efectos de HIF-1α estable y siRNA desmontables HIF-2α en el mantenimiento del fenotipo maligno y en la actividad transcripcional mediada por β-catenina. Nuestros resultados indican que, aunque tanto HIF-1α y HIF-2α son esenciales para el mantenimiento stemness y malignidad, estas dos proteínas ejercen efectos diferentes y desempeñan papeles opuestos en la señalización de Wnt canónica.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
Los siguientes anticuerpos fueron utilizados en estos experimentos: ratón aloficocianina-conjugado anti-CD44, anti-CD44 de ratón, y el ratón anti-CD24 de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.); ficoeritrina (PE) de ratón conjugado con anti-CD133 de Miltenyi Biotec (Auburn, CA, EE.UU.); ratón anti-HIF-1α, ratón anti-HIF-2α, conejo anti-Oct4, Alexa 647 conjugado de conejo anti-ratón, de cabra conjugado con Cy3 anti-conejo, y el ratón anti-lamin A /C de Millipore (Billerica, MA ); conejo anti-β-tubulina de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA, EE.UU.); ratón conjugado con biotina anti-CXCR4 de R & amp; D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.); ratón anti-β-catenina, ratón anti-citoqueratina 20 (CK20), de conejo anti-E-cadherina, conejo anti-Snail 1, ratón anti-vimentina, conejo anti-GSK-3β, y anti-cabra (p-Ser9) -GSK-3β de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.); Alexa647-conjugado de cabra anti-conejo de Molecular Probes, Inc., (Eugene, OR, USA); y estreptavidina aloficocianina conjugada de Biolegend (San Diego, CA, EE.UU.). Ratón IgG1 e IgG2b de US Biológicos (Massachusetts, MA, EE.UU.) se utilizaron en la misma concentración que el anticuerpo primario, así como el control emparejado de isotipo en la tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo experimentos. La Anexina V FLUOS Staining Kit de Roche Applied Science (Mannheim, Alemania) se utilizó para detectar células apoptóticas y necróticas. El antibiótico puromicina y L-lactato deshidrogenasa se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Una matriz de Matrigel reducido del factor de crecimiento fue adquirido de BD Biosciences. Todos los demás productos químicos fueron de grado reactivo.
Los plásmidos
Los plásmidos informadores pTOPFlash y pFOPFlash se obtuvieron de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, EE.UU.). El reportero HRE-Luc se obtuvo de Addgene (plásmido 26731: HRE-luciferasa), una organización sin ánimo de lucro dedicada a facilitar el intercambio de plásmido entre los científicos. El plásmido de control que codifica una secuencia shRNA revueltos se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology. El control (void plásmido pSuper), HIF-1a y HIF-2α plásmidos RNAi fueron donaciones generosas de Dr. Daniel Chung, y su construcción y la eficacia fueron descritas en un informe anterior [10].
Cultivo celular
Todas las líneas celulares de cáncer y la línea celular 112CoN no maligno utilizado aquí fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [16]. Todas estas líneas celulares fueron autenticadas en enero de 2012 por Short Tandem Repeat análisis de ADN realizado en el Instituto Nacional de Medicina Genómica (INMEGEN) en la Ciudad de México.
Western Blot
Las muestras de proteínas (50 g) se separaron en un 10% de sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), seguido de la transferencia electroforética a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) como se describe en un informe anterior [14]. Un anticuerpo actina se utilizó para controlar la igualdad de carga.
inmunoprecipitación
Las células se lavaron y se homogeneizaron en pH enfriada en hielo de tampón de lisis que contenía 7,5 mM Tris 50, NaCl 150 mM, 0,5% de Triton X-100 y una mezcla de inhibidores de proteasa y inhibidores de la fosfatasa de proteínas. La concentración de proteína en el sobrenadante se midió utilizando un ensayo de proteínas compatible con detergente (Bio-Rad). Las alícuotas de estos extractos (1 mg /ml) se incubaron durante la noche a 4 ° C con 2 mg /ml de anticuerpo primario con agitación suave. Después, se añadieron 25 l de proteína A-Sepharose (30%, Calbiochem) y se incubaron durante 2 h. A continuación, los complejos inmunes se lavaron dos veces con tampón A (50 mM Tris-HCl y 0,6 M NaCl, pH 8,3) suplementado con 0,1 mg /inhibidor de la tripsina ml y PMSF 1 mM, y una vez con tampón B (Tris HCl 50 y 0,15 M NaCl, inhibidores de la proteasa y de fosfatasa pH 7,5) que contiene.
HIF-1α o HIF-2α caída
Para inducir el silenciamiento estable de HIF-1α o HIF-2α, las células fueron transfectadas con pSuper la HIF-1α o HIF-2α RNAi plásmido, que fueron construidos y analizados por el Dr. Daniel Chung como se describe en un informe anterior [10] o con el plásmido de control (que codifica una secuencia shRNA revueltos o pSuper plásmido vacío) utilizando Lipofectamine 2000 . Para generar transfecciones estables, las células fueron transfectadas ya sea con 1 g del plásmido de control o 1 g de pSuper HIF-1α RNAi o plásmidos RNAi HIF-2α. Se seleccionaron transfectantes estables con 3 mg /ml de puromicina (Sigma) durante cuatro semanas, y se seleccionaron los clones y se cribaron para HIF-1α o HIF-2α silenciamiento por citometría de flujo.
análisis
FACS
Las células fueron separadas y se disociaron en una solución 10 mM de EDTA. La suspensión de células se lavó, se resuspendió en PBS suplementado con suero 4% de ternera fetal (FCS) (tampón de tinción), se tiñeron con el anticuerpo primario correspondiente, y después se incubó con el anticuerpo secundario. Las células teñidas con el anticuerpo secundario solo se utilizaron como un control negativo. Para la tinción nuclear, los núcleos fueron purificados de las muestras de células utilizando un kit de aislamiento de núcleos (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los núcleos se lavaron, fijaron, permeabilizaron, bloqueados, y se marcaron con anti β-catenina y el anticuerpo de cabra Alexa 647 conjugado anti-ratón en tampón de tinción. Como control negativo, los núcleos mantenidas en tubos separados se probaron en paralelo con Alexa anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con 647. Después de un lavado final, los núcleos se fijaron y se analizaron por citometría de flujo.
medición de lactato ensayo
La cantidad de lactato de las células cancerosas secretadas en el medio de cultivo se midió usando un ensayo enzimático utilizando L deshidrogenasa lactato (Sigma). En este ensayo, el lactato secretada en el medio de cultivo de la muestra se reduce a piruvato y NADH en presencia de lactato deshidrogenasa (LDH) (Sigma) y el exceso de NAD. La cantidad de NADH formado en la reacción, medida por el cambio de absorbancia a 340 nm, es proporcional a la concentración de lactato presente en la muestra. Para evitar la interferencia con la LDH que ya puede estar presente en el suero usado para complementar el medio de cultivo, las muestras se sometieron a desproteinización con ácido tricloroacético al 8% (TCA) para hacerlos libre de proteínas antes del ensayo.
la apoptosis
células SW480 de control o HIF-1α o HIF-2α-silenciado se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 1,5 × 10
5 células por pocillo. Veinticuatro horas después de la siembra, las células se incubaron en ausencia o presencia del inductor de la apoptosis H
2O
2 (1 mM) durante 12 h. La apoptosis se midió por citometría de flujo usando el kit de anexina V FITC (Roche) según lo recomendado por las instrucciones del fabricante. Necrosis se midió por la permeabilidad de yoduro de propidio (PI) en ausencia de detergente. El porcentaje de células apoptóticas se determinó mediante citometría de flujo.
cicatrización de heridas ensayo
control o HIF-1α- o se sembraron células SW480 hasta la confluencia en poli-L-silenciados HIF-2α- portaobjetos recubiertos de lisina en DMEM F12 suplementado con 5% de FBS. Después de 24 h, un rasguño se produjo usando una punta de pipeta estéril. Los cultivos se lavaron con PBS. En este punto de tiempo (t = 0 h), se fotografiaron los márgenes de la herida. Las células fueron cultivadas en medio suplementado con 0,05% de SFB durante un máximo de 72 h, y de los márgenes de la herida se fotografiaron en diferentes puntos temporales.
Migración ensayo
La respuesta quimiotáctica a la célula del estroma Factor-1α -derivado (SDF-1α) de la HIF-1α y HIF-2α células con silenciamiento y control se evaluó a través de Boyden cámaras (tamaño de 3 micras de poro). Un total de 1 × 10
se añadieron 5 células a la parte superior de la cámara, y la parte inferior de la cámara contenía SDF-1α (200 ng /ml en 0,05% de FBS). Para obtener el número absoluto de células migratorias, fluyen se obtuvieron recuentos de citometría de cada muestra para un volumen constante, predeterminada y, a continuación en comparación con recuentos de citometría de flujo duplicados obtenidos a partir de los pocillos de control.
modelo de tumor de xenoinjerto
se seleccionaron los clones seleccionados de control- estable, HIF-1α-, o células de HIF-2α-transfectadas y se tamiza por citometría de flujo para determinar la eficiencia de HIF-1α y HIF-2α silenciar en comparación con las células de control. Las células que presentan la más alta eficiencia desmontables se cultivaron y se utiliza para los xenotrasplantes en ratones inmunocomprometidos. Para cada sitio de inyección, 1 × 10
células 6 HIF-1α- o HIF-2α-silenciado se resuspendieron en una alta concentración de Matrigel (BD Biosciences), diluida en PBS a una concentración final de 50% y por vía subcutánea (sc ) se inyecta en los flancos de ratones desnudos de seis semanas de edad (n = 5). Cada ratón se inyectó en el costado superior derecho con las células de control, en el costado inferior derecho con células HIF-1a-silenciada, y en el costado inferior izquierdo con células HIF-2α-silenciada.
Para los xenotrasplantes utilizando CD44
- /CD133
- o CD44
+ subpoblaciones, se obtuvieron células SW480 de células establemente transfectadas con el plásmido de control pSuper o con pSuper HIF-1α o HIF-2α RNAi por clasificación de células FACS. Las subpoblaciones purificadas para cada condición se recogieron por tripsinización. Entonces, 1 × 10
4 células por punto de inyección se resuspendieron en matriz de Matrigel reducido el factor de crecimiento, se diluyó en PBS a una concentración final de 50% y s.c. se inyecta en los flancos de ratones desnudos de seis semanas de edad. Se inyectó a cada ratón (n = 5 para cada condición) en el flanco derecho con CD44
- /CD133
- células y en el flanco izquierdo con CD44
+ células purificadas a partir de cada condición (control, HIF desmontables 1α, o desmontables HIF-2α). Cuatro semanas (por RKO o células SW480-derivado) o dos semanas (para las células SW620-derivado) después de la inoculación, los animales fueron sacrificados y los tumores se retiraron y se pesaron.
Transfección y ensayo de gen indicador de luciferasa
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 1,2-1,8 x 10
5 células por pocillo. Veinticuatro horas después de la siembra, las células se colocaron en medio libre de suero y se transfectaron con 1 g de un plásmido reportero (pTOPFlash) o plásmido control (pFOPFlash) y con 0,05 g del plásmido de luciferasa pRL o plásmido CMV-GFP (transfección controlar). La actividad de luciferasa en los lisados celulares se midió 24 h después de la transfección usando el kit de ensayo de luciferasa Dual (Promega, Madison, WI, EE.UU.). La actividad se normalizó con respecto a la actividad de
Renilla luciferasa
o con respecto al contenido de proteína en cada muestra.
Inmunofluorescencia análisis
SW480 de control o HIF-1α- o desmontables células HIF-2α se cultivaron en cubreobjetos. las células se fijaron, permeabilizaron y co-immunostained con anticuerpos contra la β-catenina, E-cadherina, vimentina y Caracol 1. La fluorescencia se analizó mediante láser microscopía confocal como se describe en un informe anterior [16]. β-catenina y vimentina se visualizaron con Alexa 647 cabra conjugado anticuerpo anti-ratón, y E-cadherina y Caracol 1 se visualizaron con anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con Cy3. La fluorescencia de células Se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio confocal (Leica TCS SP5) con un láser de criptón argón. Una muestra de control de células se tiñó con el anticuerpo secundario sólo para confirmar que no hay señal de fluorescencia se detectó a partir de estas células.
Ética declaración
Todos los animales se manejaron en estricta conformidad con buen animal prácticas según la definición de las directrices experimentales Bio-Ética Animal del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México. Además, todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Bioética Experimental Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México. Cuando se indica, los ratones fueron sacrificados con CO
2.
El análisis estadístico
Los datos se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM). Análisis estadístico de datos se realizó utilizando
t de Student
o una unidireccional ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
HIF-1α y HIF-2α se expresan en células de cáncer de colon, pero no en las células no malignas en condiciones de normoxia
.
la hipoxia es una afección común que se observa en una amplia gama de tumores sólidos, y HIF sobre-expresión se asocia a menudo con metástasis y los resultados clínicos pobres.
In vivo
, la hipoxia es también probable que sea un componente funcional de un nicho de células madre normal. Sin embargo, sigue siendo en gran medida desconocido [17] la importancia de la hipoxia en el mantenimiento de CSC. Debido a que la expresión de alto HIF se ha detectado en las células tumorales en ausencia de hipoxia, se comparó la expresión de estos factores en las células de cáncer de colon cultivadas en condiciones de normoxia e hipóxicas con células 112CoN no malignas cultivadas que se incubaron en las mismas condiciones por Western blot . Los resultados mostrados en la Figura 1 indican que como era de esperar, la hipoxia (3% O
2) indujo la expresión de tanto HIF-1α y HIF2-α tanto en las células normales (112CoN) y cancerosas; sin embargo, en condiciones de cultivo de normoxia (20% O
2), sólo las células de cáncer de colon co-expresado tanto HIF-1α y HIF-2α, mientras que las células 112CoN no malignas no expresan estos factores bajo condiciones de normoxia.
colon normal (112CoN) o células de cáncer de colon se cultivaron bajo normoxia (20% o
2) o hipoxia (3% o
2) durante 12 h. Se prepararon extractos celulares totales de las líneas de células de colon, y las muestras se sometieron a 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Un análisis de inmunotransferencia se realizó con anti-HIF-1α o anticuerpos anti-HIF-2α como se indica en la figura, y se desarrolló usando un segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante. anticuerpos actina se utilizó para controlar la igualdad de carga. Un análisis densitométrico se realizó para estimar los niveles de HIF-1α y la expresión de HIF-2α, que se normalizaron a los niveles de expresión correspondientes en las células 112CoN no malignas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado, y los datos representan la media ± SEM de al menos tres ensayos independientes. * P & lt;. 0,05
caída estable de HIF-1α, pero no HIF-2α disminuye la producción de lactato por las células de cáncer de colon en condiciones de normoxia
Para entender las funciones desempeñadas por los HIF en el cáncer mantenimiento de fenotipo y su posible interacción con la señalización de Wnt canónica, se examinaron los efectos de la caída estable de HIF-1α y HIF-2α de siRNA en las células SW480, que exhiben la señalización de Wnt canónica constitutivamente activa. Los plásmidos utilizados en este estudio se construyeron y probaron previamente con éxito por el Dr. Daniel C. Chung [10], que amablemente donó los plásmidos para nosotros. células SW480 se transfectaron con el plásmido control mezclado shRNA, pSuper HIF-1α RNAi, o pSuper HIF-2α RNAi. Se seleccionaron transfectantes estables usando un antibiótico durante cuatro semanas, y se seleccionaron los clones y se seleccionaron por citometría de flujo para HIF-1α y el silenciamiento HIF-2α en comparación con las células de control. Los transfectantes estables que exhiben una disminución de al menos el 85% en la expresión de HIF-1α y una disminución de al menos 90% en la expresión de HIF-2α se obtuvieron y se seleccionaron por citometría de flujo como se muestra en la Figura 2A. Las células cancerosas exhiben aumento de la glicolisis y la producción de lactato y la disminución de O
2 consumo en comparación con células no transformadas, un fenómeno conocido como el efecto Warburg [18]. De acuerdo con este efecto, la Figura 2B muestra que un aumento significativo en la producción de lactato fue evidente en las células de cáncer de colon SW480 y RKO en comparación con las células de colon 112CoN no malignas. A continuación, examinó los efectos de la silenciamiento estable de cada HIF en la producción de lactato por SW480 células cancerosas en virtud de normoxia o hipoxia. Como se observa en la Figura 2C, la caída estable de HIF-1α en las células SW480 disminuyó la producción de lactato por lo menos 50% en comparación con las células de control bajo condiciones de normoxia, mientras que HIF-2α única caída condujo a una disminución del 20% en la secreción de lactato en comparación con células de control en las mismas condiciones (Figura 2B). Después de 12 h de exposición a hipoxia aguda, los niveles de proteínas HIF fueron elevados, y los niveles de producción de lactato recuperada (Figura 2C). Por lo tanto, para evitar la sobreexpresión de HIF, lo que podría invalidar la eficiencia desmontables (que se muestra en la Figura S1) y hacer que sea difícil para diseccionar el papel desempeñado por cada HIF en el mantenimiento del fenotipo maligno, se decidió realizar más análisis en condiciones de normoxia.
A). Se obtuvieron (plásmido shRNA codificados) transfectantes HIF-1α- o HIF-2α-desmontables o de control estables como se describe en la sección "Materiales y Métodos". Los clones seleccionados fueron seleccionadas por citometría de flujo para evaluar el silenciamiento de HIF-1α y HIF-2α en comparación con las células de control. SEGUNDO). la secreción de lactato fue significativamente mayor en líneas celulares de cáncer colorrectal en comparación con células no malignas 112CoN. DO). Los cambios en la secreción de lactato por HIF-1α- o HIF-2α- silenciados SW480 células en comparación con las células de control (CTR en la figura) cultivadas en normoxia (20% O
2) o hipoxia (3% O
2) durante 24 h. L-lactato se determinó mediante un ensayo enzimático LDH como se describe en el "Materiales y Métodos". Todos los ensayos se realizaron por triplicado, y los datos representan la media ± SEM de al menos tres ensayos independientes. *:. P & lt; 0,05
caída estable de HIF-1α o HIF-2α produjo un aumento en la basal o H
2O
2 inducida por apoptosis en células de cáncer de colon SW480
está bien establecido que HIF-1α promueve la supervivencia celular y la resistencia a la apoptosis en varios sistemas de células en condiciones de hipoxia. Hemos estudiado si el bloqueo de HIF-1α o expresión de HIF-2α en las células cancerosas que expresan ambos factores en virtud de normoxia también afecta a la supervivencia celular. Se utilizó peróxido de hidrógeno para inducir la apoptosis aguda, ya que se ha informado ampliamente de que es un potente inductor de la apoptosis en células de cáncer debido a la producción de estrés oxidativo grave. células SW480 HIF-silenciado se trataron con mM H 1
2O
2 durante 12 h, y entonces el grado de apoptosis de las células se determinó por tinción con Anexina V-PI seguida de citometría de flujo análisis. Tanto la apoptosis y la necrosis se mejoraron bajo normoxia como resultado de HIF-1α o silenciamiento de HIF-2α en comparación con las células de control, incluso en ausencia del inductor de la apoptosis (parte superior de la Figura 3). Sin embargo, la proporción de células apoptóticas y necróticas obtenido como resultado de silenciamiento HIF-1α fue mayor que la inducida por caída HIF-2α con respecto a los controles, y este efecto fue más evidente cuando las células fueron tratadas durante 12 h con 1 mM H
2O
2 (Figura 3). Por lo tanto, estos resultados sugieren que los HIF, particularmente HIF-1α, están involucrados en la promoción de la supervivencia celular y la resistencia a la apoptosis.
La apoptosis se indujo mediante el cultivo de la HIF-silenciada o de control (transfectadas con el plásmido shRNA y revueltos se indica en la figura como células CTR) en la ausencia o presencia de 1 mM h
2O
2 durante 12 h. se tripsinizaron las células SW480, se lavó dos veces con PBS, y sin tratar (vehículo) o tratados con H
2O
2 para 12 h. Los cultivos se tiñeron con anexina V y PI, como se describe en "Materiales y Métodos", y se analizaron por citometría de flujo. Todos los ensayos se realizaron por triplicado (se muestra un histograma representativo de los datos), y el gráfico presenta las medias ± SEM de tres experimentos independientes; *: P & lt; 0,05; **:. P & lt; 0,01
caída estable de HIF-1α o HIF-2α disminuyó la migración celular de las células cancerosas SW480, pero sólo HIF-1α desmontables quimiotaxis CXCR4 mediada gravemente afectados
Hemos realizado ensayos de curación de heridas para investigar los efectos de estas proteínas en la migración celular. células HIF-1α- o HIF-2α-silenciada estables fueron cultivadas bajo normoxia hasta la confluencia, y después se hicieron arañazos en la monocapa. Las imágenes de los arañazos se capturaron a las 0 y 48 h, y el área de borrador se analizó en estos puntos de tiempo. Como se puede observar en la figura 4A, en comparación con los controles, la migración fue bloqueado por la caída de HIF-1α o HIF-2α (por favor ver las líneas de límite de referencia dibujadas en las fotos). Además, la evaluación de la migración celular basada en la actividad quimiotáctica hacia SDF-1α mediada por el receptor CXCR4 reveló que la expresión de CXCR4 se redujo como resultado de HIF-1α pero no desmontables HIF-2α (Figura 4B). Consistente con este hallazgo, el silenciamiento de la expresión de HIF-1α casi abolió la migración SDF-1α- CXCR4 mediada de las células cancerosas a través de Transwell cámaras, mientras que el silenciamiento de la expresión de HIF-2α disminuyó la migración celular por sólo el 45% con respecto a los controles (Figura 4C).
a) un ensayo de cicatrización de heridas se utiliza para determinar si la migración celular es dependiente de cualquiera de HIF-1α o la expresión de HIF-2α. SW480 desmontables y control de las células fueron cultivadas (codificado plásmido shRNA) hasta la confluencia en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, y se realizó el ensayo de curación de heridas tal como se describe en el "Material y Métodos". El área rayada fue fotografiada inmediatamente después de la herida (tiempo 0) y 48 h después de la herida. Estas imágenes son representativos de tres experimentos independientes. B) la expresión de CXCR4 disminuye como resultado de la caída HIF-1α. control de SW480 o células silenciadas, como se indica en la figura, se separaron usando EDTA y se lavaron, y 1 × 10
5 células se incubaron con el ratón conjugado con biotina anti-CXCR4 y aloficocianina conjugada con anticuerpo de estreptavidina y se examinaron por citometría de flujo. Los datos muestran las intensidades medias de fluorescencia de la expresión de CXCR4 y SSC (luz dispersada lateral, proporcional a la granularidad de la célula), y representan los valores medios ± SEM de tres experimentos independientes. *: P & lt; 0,05; **: P & lt; 0,01. Se observaron C) diferencias significativas en la respuesta quimiotáctica inducida por SDF-1α. La respuesta quimiotáctica a SDF-1α de las células HIF-1α- o HIF-2α-desmontables o de control (CTR en la figura) se evaluó a través de Boyden cámaras como se describe en los "Materiales y Métodos". Las células se incubaron durante 48 h para permitir la migración y se recuperaron utilizando EDTA. Los resultados representan la media ± SEM de tres experimentos realizados por duplicado. *: P & lt; 0,05; **:. P & lt; 0,01
silenciamiento estable de HIF-1α o HIF-2α disminuyó la actividad tumorigénico in vivo de las células de cáncer de colon injertadas
El efecto del establo siRNA- Los datos son representativos de tres experimentos independientes.