Extracto
A pesar de la apoptosis de las células endoteliales participa en la reducción del tumor después de la radioterapia sola dosis alta, poco se sabe acerca de la respuesta vascular después de la radioterapia fraccionada convencional. Por lo tanto, se evaluó la hipoxia, la perfusión y cambios microambiente vascular en un modelo ortotópico de cáncer de próstata de la radioterapia fraccionada convencional a dosis clínicamente relevantes (fracciones de 2 Gy, 5 fracciones /semana). En primer lugar, la radioterapia fraccionada convencional disminución de la proliferación de células tumorales y el aumento de la muerte celular con una cinética comparables a la radioterapia del cáncer de próstata humano. En segundo lugar, la inyección de Hoechst 33342 o fluorescentes-dextranos mostró un aumento de la perfusión del tumor dentro de 14 días en los tumores irradiados, que se correlacionó con una clara reducción de la hipoxia. La mejora de la perfusión y la disminución de la hipoxia no fueron explicados por el aumento de la densidad de los vasos sanguíneos, el tamaño o la morfología de la red. Sin embargo, una maduración vascular tumor definido por perivasculares células desmina + /+ SMA cobertura se observó claramente junto con un aumento en endotelial, zonula occludens (ZO) -1, uniones intercelulares positivos. Nuestros resultados muestran que, además de la destrucción de células tumorales, la maduración vascular juega un papel descubierto en la reoxigenación del tumor durante la radioterapia fraccionada
Visto:. Potiron VA, Abderrahmani R, Clément-Colmou K, Marionneau-S Lambot, Oullier T, Paris F, et al. (2013) Mejora de la funcionalidad del sistema vascular durante fraccionada convencional de la radioterapia del cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (12): e84076. doi: 10.1371 /journal.pone.0084076
Editor: Zhaozhong Han, Alexion Pharmaceuticals, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Junio, 2013; Aceptado: noviembre 20, 2013; Publicado: 31 de diciembre de 2013
Derechos de Autor © 2013 Potiron et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer (INCA PAR prostático 2010), la Asociación para la Investigación sobre el cáncer, la Ligue Nationale Contre le cáncer y la región Pays de Loire. La fuente de financiación no participó en la recopilación, análisis e interpretación de datos, la preparación del manuscrito y la decisión de publicar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Aunque la sensibilidad de los tumores a la radioterapia (RT) depende en gran medida de la radioresistance intrínseca de las células madre de cáncer [1], otros datos sugieren que la sensibilidad del endotelio también juega un papel importante [2] . Como resultado de la producción excesiva de moléculas angiogénicas, los vasos sanguíneos en los tumores sólidos exhiben rasgos característicos tales como microvasos dilatados, revestimiento endotelial incompleto, compresión por las células tumorales, la excesiva ramificación y una arquitectura muy irregular. A nivel celular, una maduración incompleta de los capilares se observó con células perivasculares ausentes o individual, de la membrana basal ausente o demasiado gruesa y la falta de unión de células endoteliales. Esta vasculatura anormal hace que la hipoxia que más afecta a la eficacia de la irradiación debido a 1) la falta de oxígeno reduce la cantidad de especies reactivas de oxígeno inducidas por la irradiación y 2) la hipoxia selecciona células mutantes radioresistant [3]. Durante la radioterapia fraccionada, la proporción de células hipóxicas aumenta rápidamente después de la fracción de tratamiento ya que las células de normoxia son preferentemente y rápidamente mataron por irradiación. En las próximas horas, debido a la reducción del consumo de oxígeno por las células dañadas, la mejora de la perfusión, y la densidad celular reducida, las células tumorales hipóxicas pueden ganar un acceso más fácil a la oxigenación, y por lo tanto ser más sensibles a la fracción posterior de la irradiación. Este proceso de la reoxigenación se cree que confiere una ventaja terapéutica para CFRT través de una disminución progresiva de las células tumorales de normoxia y un acceso más fácil de las células hipóxicas al oxígeno [3].
Los vasos sanguíneos se ven afectados en gran medida por RT en función del número de fracciones, la tasa de dosis, la dosis total de radiación y el tamaño de la fracción [4], [5]. la irradiación individual de dosis alta puede inducir apoptosis rápida de la vasculatura [6], [7]. Además, tanto solo de alta dosis y la irradiación hipofraccionada inducen la apoptosis de células endoteliales, lo que disminuye la densidad vascular [8], con los vasos que sobrevivieron más dilatada [9], [10]. Sin embargo, la importancia del daño vascular en los tumores de recibir radioterapia fraccionada convencional (CFRT: 1,8-2 Gy por fracción) es más controvertida [11], [12]. En los vasos sanguíneos normales del cerebro, la información muy reciente sugiere que, por el contrario a las dosis más grandes, una Gy-irradiación 2 induce la apoptosis de células endoteliales mínimo seguido de un incremento más adelante en el diámetro del vaso, la densidad microvascular y de los vasos leakiness [13]. Sin embargo, las células endoteliales quiescentes son más resistentes a la irradiación de la proliferación de células endoteliales [14], [15]. Por lo tanto, los efectos de CFRT en el endotelio del tumor pueden diferir del endotelio normal. Por otra parte, para entender los efectos de la radioterapia clínica, estudios específicos sobre los vasos sanguíneos del tumor que se han llevado a cabo en modelos ortotópico ya que el grado de hipoxia y la vascularización se ve afectado en gran medida por el sitio del injerto del tumor [16], [17].
para estudiar los efectos de CFRT en la vasculatura del tumor y la hipoxia, se seleccionaron un modelo de cáncer de próstata, porque CFRT hasta la dosis total de 74 a 80 Gy juega un papel importante en los pacientes con cáncer de próstata localizado [18], y porque el respuesta de los tumores de próstata a la irradiación es altamente sensible a la hipoxia [19], [20]. Por otra parte, los cánceres de próstata muestran características detención del crecimiento de terminales como el modo dominante de la muerte celular inducida por la radiación [21], [22], y esta lenta cinética de muerte celular tras RT puede afectar en gran medida la reoxigenación del tumor. Se analizó la evolución del tumor y la vasculatura estructural y cambios funcionales y su impacto sobre el microambiente del tumor usando un esquema de fraccionamiento clínicamente relevante (2 Gy x 5 fracciones /semana durante 2 semanas) en un modelo ortotópico de cáncer de próstata. Nuestros resultados sugieren que por el contrario a la radioterapia hipofraccionada, CFRT no afecta a la densidad de vasos, pero remodela la vasculatura del tumor mediante el aumento de la cobertura perivascular, mejorar la perfusión del vaso y que conduce a la disminución de la hipoxia.
Resultados
radiación fraccionada convencional controles de terapia crecimiento del tumor de próstata
Para estudiar los cambios del tumor y su microambiente durante un protocolo clínicamente relevante de la terapia de radiación, se indujo cáncer de próstata ortotópico en ratones. Dos semanas después se inyectaron las células, los animales portadores de tumores recibieron una dosis diaria de 2 Gy de irradiación centrada en el abdomen inferior, cada día de la semana durante dos semanas (convencionalmente radioterapia fraccionada, CFRT; Fig. 1A). Este protocolo imita las dos primeras semanas de radioterapia para pacientes con cáncer de próstata. Se sacrificaron los animales y se analizaron a 0 (no irradiado), 1 (2 Gy), 3 (6 Gy), 7 (10 Gy) y 14 días (20 Gy) durante el tratamiento. Como era de esperar, la irradiación condujo a una marcada disminución en el peso del tumor en comparación con animales no tratados (irradiados: 237 ± 37 mg vs. no irradiados: 777 ± 135 mg, p & lt; 0,01, Fig 1B.). Además, la irradiación tuvo un efecto preferencial en las células tumorales en proliferación, en comparación con los tejidos sanos adyacentes (Fig. 1C). La reducción de la proliferación celular era visible desde día 1, y más pronunciado con el tiempo (-54% a t14 vs. t0, p & lt; 0,01, Fig 1D, E.). En paralelo, la muerte celular aumentó rápidamente en el día 3 (+ 109%, p & lt; 0,05) y permaneció no significativamente mayor que la línea de base a partir de entonces (Fig 1D, F.). En general, estos resultados están en línea con las respuestas lentas cinética observada en los pacientes con cáncer de próstata.
(A) Esquema del protocolo convencional de radioterapia fraccionada (CFRT) que se utiliza para el tratamiento de los tumores de próstata establecidos. (B) Peso de tumores diseccionados después de la hora indicada de CFRT. Los valores promedio de n≥6 = ± SEM. La comparación estadística vs. t14 irradiado. (C) Ejemplo de un tumor tratado por una semana, que muestra células tumorales TUNEL + ( "T") y los tejidos adyacentes normales ( "N"), principalmente TUNEL. Tumor y los tejidos normales fueron identificados con DAPI basado en la morfología de los núcleos, tamaño, intensidad de la tinción y la organización espacial de las células. (D) Imágenes de Pseudo-confocal de tumores durante CFRT, teñidas para Ki-67 /TUNEL /CD31. (E, F) la cuantificación de la proliferación celular Image (índice Ki-67, E) y la muerte celular (índice de TUNEL, F). Las comparaciones estadísticas vs. t0.
CFRT reduce la hipoxia tumoral y aumenta la perfusión
La hipoxia de exceso de consumo de oxígeno por las células tumorales, así como anomalías de los vasos sanguíneos del tumor. Para determinar el patrón de la hipoxia, un importante factor de radioresistance, durante CFRT, se utilizó el EF5 marcador extrínseca [23], lo que pone de relieve graves. (& Lt; 0,2% de O
2), hipoxia radiobiologically relevante (Figura S1 A-C ). superficie EF5-positiva se aumentó moderadamente a día 1 (+ 45%), aunque no significativamente, con algunas áreas de hipoxia en las proximidades de los vasos sanguíneos, lo que sugiere que no todos los vasos se perfundieron (Fig. 2A-B). Sin embargo, la hipoxia disminuyó en todos los puntos de tiempo posteriores, para llegar a sólo el 11,4% de t0 a las 2 semanas (p & lt;. 0.05, Fig 2A-B).
(A) imágenes Pseudo-confocal de tumores durante CFRT, manchado por la hipoxia (EF5) y células endoteliales (CD31). (B) Imagen de cuantificación EF5 + superficie en los tumores durante CFRT. Los valores representan la media de n≥13 por punto ± sem. (C) Imágenes de Pseudo-confocal de tumores perfundidos con Hoechst 33342 y 10 kDa /2 dextranos MDa antes (t0) o después de 2 semanas de CFRT (t14). SYBR verde se utilizó como contratinción de núcleos de células totales. (D, E, F) cuantificación Imagen de Hoechst + (D), y medio (E) y grandes dextrano (F) + superficies en los tumores durante CFRT (n = 6). (B, D, E, F). Las comparaciones estadísticas vs. t0.
Para evaluar la funcionalidad del buque, se inyectaron moléculas fluorescentes de diferentes tamaños por vía intravenosa. Grandes (2 MDa de dextrano) moléculas que permanecen cuenta intravascular para la perfusión, medio (10 kDa de dextrano) para difusión intersticial y pequeño (Hoechst 33342, 616 Da) para la permeabilidad. Mientras que en los tumores no irradiados, solamente áreas discretas se tiñeron positivamente, la superficie de distribución de todas las moléculas se aumentó en gran medida después de 2 semanas de CFRT y era más homogénea (Fig. 2C-F). Distribución de Hoechst alcanzó un valor cercano al de la próstata normal (t0: 0,10 vs. t14: 0,33, p & lt; 0,01, Fig 2C-D; normal:. 0.41, Fig S2.). La superficie total del medio (10 KDa) y grandes (2 MDA) dextranos también se incrementó (t0: 0,011 vs. t14: 0,029, p & lt; 0,05, Fig 2C, E y t0: 0,0054 vs. t14:. 0,010, p & lt; 0,05, Fig. 2C, F), aunque no comparable a los tejidos normales (0,12 y 0,02, Fig. S2) como la densidad de los microvasos (MVD) es ≈ 3 veces menor en los tumores (Fig. S3a-C). Ambos permanecieron dextranos puntuado, sin mostrar ningún signo de difusión considerable que representaría permeabilidad recipiente (2 MDA) o permeabilidad anormal (10 kDa). El aumento similar independientemente del tamaño de la molécula es coherente con un aumento de la perfusión (por ejemplo, aumento del flujo sanguíneo). Curiosamente, no se observó ningún aumento significativo de la perfusión en los acinos de próstata normal (Fig. S4A-D). Por lo tanto, CFRT mejora preferentemente la perfusión recipiente en el contexto de la microambiente tumoral.
CFRT no induce cambios en la densidad de los vasos, el tamaño o la distribución
mejora de la perfusión en el contexto de la quimioterapia de tumores se ha asociado con la normalización vascular, y potencia la terapia de radiación [24]. Sin embargo, no se han estudiado los cambios de la vasculatura asociada a tumores durante CFRT. Por ello, investigó la densidad y estructura de microvasos en los tumores irradiados en diferentes momentos. MVD era estable durante el curso de tiempo del experimento, de 51 ± 8 microvasos /mm
2 en el instante t0 a 54 ± 7 en t14 (Fig. 3A), a diferencia de los tumores no irradiados, que exhiben un aumento significativo (de 47 ± 7 a 80 ± 8, p & lt;. 0.01, Fig S5A, B). Es de destacar que esto es muy por debajo de la observada en la próstata normal con un MVD de 166 ± 6 (Fig S3C, p & lt;. 0,01 vs. tumor en t0), lo que puede explicar la hipoxia detectado en tumores no tratados. El mantenimiento de MVD nos llevó a determinar si se produce la muerte de las células endoteliales durante CFRT. Por lo tanto, se midió el índice de TUNEL en las células CD31 +. CFRT no indujo CE muerte (Fig. 3C, D), a pesar de una tendencia a día 1 (+ 28%, p = 0,37) que era coherente con el mínimo MVD no significativa en el día 3 (Fig. 3A). Por otra parte, la cantidad de TUNEL + tinción no era coherente con el daño masivo de células endoteliales. A continuación, a la cuenta de la heterogeneidad de distribución de los vasos sanguíneos, se determinó la distancia de las células (identificado por DAPI) al recipiente más cercano. El uso de este análisis, el leve y transitorio reducción MVD observado en el día 3 (Fig. 3A) dio lugar a un cambio leve pero no significativos de las células hacia un entorno hipóxico teóricamente (& gt; 100 micras desde el recipiente más cercano, figura 3B.). Sin embargo, en el momento en que la hipoxia estaba ausente y se aumentó la perfusión (t14), el perfil de las células de los vasos sanguíneos era idéntico a los tumores no irradiados (T0: 21,3 vs. t14: 24,9% de las células en más de 100 m). Además, los valores fueron en gran medida más allá de las que se encuentran en la próstata normal (S3A, F). Por lo tanto, el aumento de la entrega de Hoechst /dextranos observado después de la irradiación podría ser debido a la calidad de recipiente en lugar de la cantidad. Por lo tanto, se analizaron la morfología de red de vasos mediante la exploración de tejidos sobre un espesor 100 micras. Sin embargo, en comparación con los tumores no irradiados, tumores recogidos en el día 14 durante CFRT no mostraron ninguna diferencia en el recipiente de ramificación (t0: 8,9 rama /mm vs. t14: 7,6, p = 0,32; Fig 3E, F.), El diámetro (t0: 9,5 micras vs. t14: 8,6 m, p = 0,21). En general, estos resultados indican que la hipoxia /perfusión aumentada reducido durante CFRT no se correlaciona con una mejor densidad vascular, la topografía o morfología.
(A) la densidad de microvasos en los tumores durante CFRT. Los valores representan la media de n≥13 por punto ± sem. (B) el perfil Distancia entre las células y el vaso sanguíneo más cercano, de tumores durante CFRT. Los perfiles se basan en n≥13. Las comparaciones estadísticas vs. t0. imágenes (C) Pseudo-confocal de los vasos sanguíneos asociados al tumor (CD31 +) teñidas para TUNEL durante CFRT. Flechas: TUNEL + /CD31 + células. (D) la cuantificación Imagen de CD31 + /+ TUNEL superficie. Los valores representan la media de n≥13 por punto ± sem. (E) un representante imágenes Z-stack de 100 secciones de tumores micras de espesor antes (T0) o después de 2 semanas de CFRT (t14) y teñidas de los vasos sanguíneos (CD31 + /FLI-1 +). (F) Análisis de la imagen de la red de vasos sanguíneos del tumor secciones 100 micras de espesor. Los valores representan la media de n = 9 por punto ± SEM.
CFRT induce la maduración de la pared vascular
vasos tumorales anormales a menudo exhiben pared endotelial no continua, lo que resulta en la permeabilidad exacerbada y la permeabilidad. Para apreciar la cohesión pared endotelial, que se tiñeron para zonula occludens-(ZO) -1, una proteína implicada en uniones estrechas. Endoteliales (CD31 +) - específica índice ZO-1 fue significativamente upregulated después de 2 semanas de CFRT (+ 38% de t0, p & lt;. 0.05; Fig 4A, B). Más importante aún, esto se asoció con un aumento de la cobertura de las células endoteliales por células positivas actina alfa de músculo liso (SMA) (+ 111% de t0, p & lt; 0.05; Fig. 4A, C). Por microscopía confocal y análisis de histogramas, ZO-1 se confirmó que era endotelial (dentro de las células CD31-expresión) y se expresó de forma continua, en concreto después de la irradiación (Fig. S6A-B). En contrario, SMA era no endotelial y yuxtapuesta a la pared endotelial. Para precisar la naturaleza de las células perivasculares, los tejidos fueron co-teñidos para desmina, un marcador de pericitos [25]. Además del índice de SMA, las células perivasculares desmina + también se incrementaron (t0: 0,034 vs. t14: 0,065, p & lt; 0,01; figura 4D.). Por otra parte, SMA y desmina fueron co-expresados por las mismas células (Fig. 4E, F). Además, la frecuencia de desmina + /+ SMA cubierto vasos se duplicó entre día 0 y día 14 de CFRT (t0: 20,0 vs. t14: 39,4, p & lt; 0,05). Es de destacar que, SMA y desmina fueron también co-expresados en las raras vasos no irradiados cubiertos (Fig. S7). En la próstata normal, desmina fue expresada por tanto micro (intra-acinos) y macro (entre acinos) -los aparatos, aunque SMA estaba estrictamente restringido a las macro-vasos (Fig.S3A, D-E, Fig. S8A-B). Por otra parte, no se detectó la regulación positiva de SMA en microvasos normales irradiados (Fig. S9A, C), ni en los microvasos tumorales no irradiadas (Fig. S5C, D). Por lo tanto, el aumento de perivasculares células desmina + /SMA + es específico de microvasos tumorales irradiadas.
(A) Imágenes Pseudo-confocal de los vasos sanguíneos del tumor durante CFRT y manchado de ZO-1 /CD31 (arriba) o SMA /CD31 (parte inferior). (ANTES DE CRISTO). imagen cuantificación de las superficies de ZO-1 + /CD31 + (B) y peri-CD31 + SMA (C). Los valores representan la media de n≥13 por punto ± sem. (D) la cuantificación Imagen de peri-CD31 + superficie de desmina y la frecuencia de los vasos desmina + /+ SMA. (B, E, D) Las comparaciones estadísticas vs. t0. (E) confocal de imágenes representativas de un vaso sanguíneo de un tumor tratado de 14 días teñidos para CD31 /desmina /SMA. (F) el análisis de histograma CD31 /desmina perfil pseudocolor /SMA de sección transversal imagen confocal.
Discusión
Aunque varios estudios sugieren que la irradiación conduce a la destrucción de los vasos, el efecto de convencionalmente irradiación fraccionada ha sido en gran parte inexplorado. Se utilizó un modelo ortotópico de cáncer de próstata con un esquema de fraccionamiento clínicamente relevante, la inducción de muerte celular modesta, el aumento de detener la proliferación con efecto de la dosis y diferencial entre células /tumorales normales. Encontramos que CFRT casi abrogó la hipoxia tumoral después de 2 semanas de tratamiento, junto con un aumento de la perfusión. Inesperadamente, estos efectos no se asociaron con cambios significativos en la morfología de recipiente o de la densidad, sino más bien con la maduración fenotípica de la pared vascular, incluyendo las células endoteliales (CD31 + /ZO-1 +) y pericitos (desmina + /SMA +). En general, estas observaciones indican que la adaptación vascular juega un papel descubierto en la reoxigenación del tumor durante la terapia de radiación fraccionada.
No se observó un aumento drástico en las células endoteliales apoptóticas después de 24h todos los días 2 irradiaciones Gy, y MVD se mantuvieron estables, consistentes con la reciente información en los vasos sanguíneos del cerebro normales [13]. Estos resultados están en contraste con estudios anteriores utilizando mayor irradiación de dosis, donde se informó de la muerte de células endoteliales y la disminución de la densidad de vasos, si bien en puntos de tiempo anteriores [2], [4]. En particular, las fracciones de 4 y 12 Gy durante 2-3 semanas llevado a un aumento de la muerte de células endoteliales y la disminución de MVD en tumores subcutáneos [8], [9], [10]. Esto es sorprendente, ya que la apoptosis endotelial se cree que ocurre sólo a dosis individuales ≥ 10-15 Gy [2], [4]. Sin embargo, la muerte CE podría depender de la configuración de tumor, ya que los cambios vasculares solamente menores se observaron 24 horas después de una sola dosis de 15 Gy en otro modelo de cáncer de próstata [26]. Los diferentes estados de células endoteliales entre los estudios puede dar cuenta de las diferencias en la radiosensibilidad, ya que las células endoteliales quiescentes son más resistentes al daño del ADN inducido por la irradiación, pero no a la muerte a corto plazo de la membrana inducida por la célula [14] [15]. Esto puede explicar que los aumentos observados en la cobertura y la perfusión pericítico sólo fueron significativas en el compartimiento del tumor irradiado, donde el ambiente microvascular puede ser más sensible /permisiva. Estos resultados ilustran la complejidad de la vasculatura del tumor y su respuesta a los tratamientos heterogénea. Tal vez la importancia de un entorno ortotópico a menudo no se aprecia desde los vasos sanguíneos muestran una fuerte heterogeneidad entre los órganos (por ejemplo, la expresión del receptor de andrógenos para el endotelio de próstata, la barrera sangre-cerebro, etc ..). De hecho, los tumores PC3 cultivadas derivadas por vía subcutánea tienen sustancialmente mayor tamaño del vaso y la densidad (x3 ≈, datos no mostrados). Más importante aún, los estudios recientes que utilizan dosis mayor fracción están de acuerdo con nuestro trabajo por una disminución en la hipoxia tumoral y el aumento de la perfusión y la cobertura de pericitos [9], [10], excepto un informe utilizando muy alto (30 Gy) en dosis única de irradiación [ ,,,0],27]. En conjunto, estos estudios sugieren que el aumento de la cobertura perivascular podría desempeñar un papel esencial en la perfusión del vaso y la reoxigenación después de la irradiación fraccionada.
La preservación de la vasculatura ahora es visto positivamente por el tratamiento del cáncer, debido al concepto de normalización vascular. El concepto más allá de esta observación es que la destrucción de la vasculatura produciría hipoxia que hace que la irradiación menos eficaz. La observación inicial era que la inhibición de la angiogénesis Sobreproducción con un anticuerpo anti-VEGFR2 recluta pericitos temporalmente y regula a la baja la hipoxia tumoral [24]. Desde incontrolada brotación CE se ha asociado con la angiogénesis no funcional, la poda inducida por irradiación de brotes vasculares puede resultar en la disminución de la complejidad de la red y la mejora de la perfusión [15]. Sin embargo, no encontramos las características clave que caracterizan a los vasos sanguíneos ya normalizados de ramificación, MVD, tortuosidad y el diámetro de los vasos se mantuvieron sin cambios. Aunque la perfusión fue similar en algunos aspectos a la de la próstata normal, fenotipo recipiente era distinto, con mayor ZO-1 en los vasos irradiados que lo que se encuentra normalmente. Además, en la próstata normal, el perímetro de microvasos fue consistentemente desmina + /SMA-, mientras que la expresión SMA se limita estrictamente a los grandes buques, inter-acinos. Esta jerarquía vascular también se encuentra en muestras humanas [28]. Por el contrario, se irradia el tumor micro-vasos (≈ 10 m de diámetro) ganaron SMA expresión perivascular. Estos datos indican que la pared del vaso podría diferenciar siguiente manera única irradiación, coherente con otros informes sobre la respuesta celular al estrés perivascular inflamatoria (TGFb, PDGFB).
expresión aberrante de proteínas de unión endoteliales, incluyendo ZO-1, puede ocurrir en ausencia de polarización de las células endoteliales [29] o en breve (por ejemplo min.) después de la irradiación [30]. Sin embargo, el aumento del endotelio ZO-1 observados aquí después de 2 semanas probablemente se relaciona con la estabilización recipiente desde 1) nuestros datos de perfusión sugieren que la mayoría de los vasos se lumenized de manera eficiente y 2) el patrón de ZO-1 es membranosa, lineal y continua. En cuanto a la maduración perivascular, la estrecha asociación con las células endoteliales CD31-contratinción y la presencia de dos marcadores (desmina /SMA) identificar las células circundantes, los pericitos [25]. células perivasculares son importantes reguladores de la formación vascular, estabilización, remodelación y funcionan para generar un maduro, vasculatura de reposo [31]. La maduración de los vasos se produce a través de la señalización paracrina recíproca donde los factores derivados de CE atraen pericitos y el favor más tarde el establecimiento de uniones de las células endoteliales [32]. De importancia, las señales de pericitos secretada protegen los CE de la muerte inducida por la radiación
in vitro
[33]. Esto sugiere que los buques que no tienen cobertura de pericitos serían más vulnerables a la radiación, como la hipótesis recientemente por Chen et al [9]. Por lo tanto, los regímenes de irradiación fraccionados, que permiten la maduración vascular, pueden mejorar la función vascular del tumor.
Nuestros datos indican una reducción de la fracción hipóxica después de dos semanas de tratamiento y están de acuerdo con los datos recientes en tumores subcutáneos [9 ], [10], [34]. reoxigenación del tumor se define como el concepto de que las células tumorales hipóxicas crónicamente obtener una mejor acceso al oxígeno durante la terapia de radiación fraccionada porque las células tumorales aeróbicos son eliminados por fracciones anteriores [35]. En nuestro modelo, la reoxigenación tumor ocurrió no sólo en el contexto de disminución de la proliferación de células tumorales y el aumento de la muerte celular, sino también con una funcionalidad mejorada de la vasculatura se evidencia por la perfusión y la difusión de pequeñas moléculas. Esto significa que la reoxigenación tumor no es sólo debido al aumento de la destrucción de células tumorales y menos consumo de oxígeno, sino también a una mejor distribución de oxígeno por los vasos sanguíneos. En diferentes modelos experimentales de tumores, así como en los estudios clínicos, se demostró la heterogeneidad intertumoral en la cinética de la oxigenación durante fraccionado [36], [37], [38], [39]. Por ejemplo, en carcinomas de células escamosas, hipoxia disminuyó durante CFRT en una mayoría de líneas tumorales, mientras que en algunas líneas de células tumorales se observó un aumento temporal o ningún cambio y la fracción de los vasos perfundidos y área vascular mostraron solamente cambios modestos [34]. Por otra parte, nuestros resultados sugieren que durante CFRT, la estabilización de los vasos es necesaria para que los 2
nd fracciones semana a ser más eficientes. Si bien existe un interés creciente en los protocolos hipofraccionados de dosis alta, sobre todo en pacientes con cáncer de próstata [40], estos datos plantean la cuestión de si tales protocolos preservar la ventaja de aumentar los niveles de oxígeno y por lo tanto el índice terapéutico [41]. En otros modelos de tumores sin embargo, hipofraccionada (3 Gy /radioterapia de fracción) mejoró la oxigenación sólo durante la fase inicial del tratamiento, pero condujo a una disminución considerable de la oxigenación del tumor en la fase después de la irradiación (& gt; 45 Gy) [42]. Por lo tanto, se necesita más información acerca de la influencia de la maduración vascular en la radiosensibilidad de las células tumorales.
En resumen, hemos encontrado que la irradiación fraccionada convencional induce la maduración vascular, junto con el aumento de perfusión /disminución de la hipoxia. Estos resultados implican que el microambiente vascular desempeña un papel en la reoxigenación tumor, además de los efectos conocidos sobre las células tumorales. No está claro si los protocolos hipofraccionados pueden permitir la maduración vascular o en vez conducir a la esterilización vascular e hipoxia. El impacto de tales protocolos en los vasos sanguíneos del tumor y en el resultado clínico debe ser la perspectiva de nuevos estudios.
Materiales y Métodos
tumorigénesis de próstata ortotópico y recogida de tejidos
Siete -Semana ratones macho NMRI-edad desnudos (Janvier, de Saint Berthevin, Francia) fueron anestesiados utilizando ketamina /xilazina (50/15 mg /kg) y 2 × 10
6 células PC3-luc (Caliper Life Sciences, Villepinte, Francia ) fueron inyectados en el lóbulo dorsolateral izquierda de la próstata por medio de cirugía. Después de dos semanas, la captación del tumor fue verificado por la luminiscencia usando un PhotonImager (BiospaceLab, París, Francia) y grupos con señal de bioluminiscencia tumor similares se formaron. Los experimentos comenzaron a 3 días más tarde. Cuando se sacrificaron caso, de animales, tejidos fueron extirpados y ponderan si es necesario, y se congelaron (-80 ° C) incrustado en medio OCT (Sakura Finetek, Villeneuve d'Ascq, Francia). Las muestras se recogieron en el momento de la próxima fracción CFRT, para analizar el estado del tumor en el momento en el que debe ser tratada.
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva del Consejo Europeo 2010/63 /UE y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo local (Comité d'Ethique en Expérimentation Animale des Pays-de-la Loire, C2EA-06).
En vivo
hipoxia y la perfusión
La hipoxia y la perfusión se determinaron usando marcadores específicos que se administraron iv en tampón de solución salina. Para la hipoxia, 300 L de 3 mg /ml EF5 (hypoxia-imaging.org) se inyectaron 2 h antes de sacrificar [23], [43] mientras que 300 l de marcadores de perfusión mixtos (1,6 mg /ml de Hoechst 33342, 0,6 mg /ml Alexa
647 a 10 kDa dextrano y 3 mg /ml de rodamina-2 MDA dextrano; Life Technologies, Saint Aubin, Francia) se inyectaron 3 minutos por delante de la recogida de tejidos [44] Los tejidos fueron congelados-snap, cryosected, contrastados con SYBR Green (Fisher Scientific, Illkirch, Francia) para los núcleos de células totales y montado en Prolong oro sin DAPI (Life Technologies).
la radioterapia
Las irradiaciones se realizaron usando un irradiador de rayos X CP-160 (Faxitron, Lincolnshire, IL) con un filtro Cu 0,3 mm, una tensión de aceleración de 160 kV y una dosis de 1,3 Gy /min. Los animales recibieron una dosis (fracción) de 2 Gy diario lunes a viernes durante dos semanas, centrada en un campo abdomen inferior de 2 cm x 2 cm utilizando escudos de plomo diseñados para minimizar la irradiación a los tejidos y huesos (caderas) normales. Este esquema (que se define aquí como la radioterapia fraccionada convencional, CFRT) es la práctica clínica estándar para el cáncer de próstata
La inmunohistoquímica
Los tejidos fueron cryosected a las 5 micras de espesor. (Excepto para el análisis de redes: 100 micras) , se fijaron con 4% de paraformaldehído y se permeabilizaron con 0,05% de Triton-X100. IHC se realizó mediante tinción estándar y los procedimientos de lavado [45]. Para la tinción múltiple, los anticuerpos se incubaron secuencialmente: la primera, durante la noche seguido de su secundario y la fijación, a continuación, CD31 como el segundo y SMA como el tercero. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: rata anti-ratón CD31 (BD Biosciences, Le Pont-de-Claix, Francia), de conejo anti-ZO-1 (Life Technologies), de conejo anti-desmina (Ozyme, Saint-Quentin-en- Yvelines, Francia), de conejo anti-Ki67 (Dako, Les Ulis, Francia), de conejo anti-Fli1 (Fisher Scientific) del ratón Alexa488-conjugado anti-EF5, conjugado con Cy3 de ratón anti-actina alfa de músculo liso (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Francia). Los anticuerpos secundarios fueron: Alexa
647-cabra conjugado anti-conejo, Alexa
488 cabra conjugado anti-rata (Life Technologies). TUNEL se realizó como se recomienda por el fabricante (Roche, Boulogne-Billancourt, Francia) como la última etapa de tinción. Los portaobjetos se montaron en Prolong Oro con DAPI (Life Technologies) para counterstaining núcleos (excepto para el ensayo de perfusión).
Los portaobjetos se observaron bajo un Axiovert 200M ApoTome ( "pseudo-confocal") microscopio, con el software Axiovision 4.8 ( Carl Zeiss, Le Pecq, Francia). Mosaicos de campos de hasta 4 mm
2 se registraron en el objetivo de 63x de aceite, y cuatro Z pasos de 1 m fueron apilados en una sola imagen. Rebanadas de espesor de 100 micras por lo general se registran en ≈ 60 Z-pasos de 1 m, debido al aplanamiento del tejido después de la deshidratación. La microscopía confocal se realizó con un A1R (Nikon Instruments, Champigny-sur-Marne, Francia) con el software de Nis-Elements, una apertura numérica de 1 y una rebanada de promedio de barrido de 4.
Análisis de imágenes
Los análisis se realizaron en las imágenes de 16 bits originales sin comprimir de mosaicos de alta resolución (pseudo-confocal), a excepción de la distribución del color a lo largo de recipiente de secciones transversales (confocal; "análisis de histograma", ver más adelante). Se registraron dos tipos de valores: valores para los análisis basados en la superficie corresponden a superficies de tinción (m
2) considera positivo para la tinción de interés (por ejemplo, el área de CD31) dividido por la superficie de la región de interés (ROI; ex , el tejido total); Los valores para los análisis basados en objetos se corresponden con el número absoluto de elementos considerados positivo (ej, número de vasos) dividido por la superficie del retorno de la inversión (por ejemplo, el tejido total).
análisis basados en superficie se realizaron usando ImageJ 1.46r de software (Institutos nacionales de Salud, EE.UU.).