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PLOS ONE: Función Reguladora de la célula B es suprimida por el tabaquismo y la obesidad en H. pylori Los sujetos infectados y se correlaciona con un riesgo elevado de cáncer gástrico


Extracto


Helicobacter pylori
la infección se produce en más de la mitad de la población del mundo y es la principal causa de cáncer gástrico. Una serie de factores de estilo de vida y nutricionales, tales como el consumo de tabaco y la obesidad, se han encontrado para elevar el riesgo de desarrollar cáncer. En este estudio, hemos tratado de determinar los aspectos inmunológicos durante
H
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pylori
la infección y el desarrollo de cáncer gástrico. Hemos encontrado que las células B de
H
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pylori
pacientes infectados presentó composición y función alterada en comparación con los pacientes no infectados. + CD38
+ B células IL-10 que expresan CD24
se upregulated en
H
.
pylori
pacientes infectados, contenían actividad reguladora potente en la inhibición de las células T secreción de citoquinas pro-inflamatorias, y respondieron directamente a
H
.
pylori
estimulación antigénica. Curiosamente, en
H
.
pylori
sujetos infectados fumadores y los obesos, el número de IL-10
+ B y células CD24
+ CD38
+ se redujeron las células B en comparación con
H
.
pylori
infectados sujetos asintomáticos. funciones de regulación mediada por CD24
+ CD38
también fueron perjudicados + B células. Además, los pacientes con cáncer gástrico positivos habían reducido IL-10 de producción de frecuencias de células B después de
H
.
pylori
-estímulo. En conjunto, estos datos sugieren que en
H
.
pylori
: infección, CD24
+ CD38
+ células B es aumentada y desempeña un papel en la supresión de las respuestas pro-inflamatorias, posiblemente a través de la producción de IL-10, una característica que no se observó en fumadores y los pacientes obesos

Visto:. Li G, H Wulan, canción Z, Paik PA, Tsao ML, Goodman GM, et al. (2015) Función Reguladora de la célula B es suprimida por el tabaquismo y obesidad en
H
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pylori
Los sujetos infectados y se correlaciona con riesgo elevado de cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0134591. doi: 10.1371 /journal.pone.0134591

Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, JAPÓN

Recibido: 3 Febrero 2015; Aceptado: July 13, 2015; Publicado: July 30, 2015

Derechos de Autor © 2015 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel

financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción


Helicobacter pylori (H
.
pylori)
es una especie de bacterias patógenas Gram-negativas que se encuentra en más de la mitad de la población del mundo y preferentemente inhibe el tracto gastrointestinal superior, incluyendo el epitelio del estómago y el tracto duodeno [1,2]. Aunque la gran mayoría (& gt; 80%) de las infecciones son asintomáticas, 10-20% de los sujetos infectados se desarrollan úlceras pépticas, mientras que el 1-2% adquirirá el cáncer [3] gástrica. El mecanismo preciso de desarrollo de cáncer como resultado de
H
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pylori
no está bien definido, pero la inflamación crónica no tratada en el tracto gastrointestinal superior se cree que contribuyen al daño continuado del epitelio del estómago [4,5]. Específicamente, la inflamación asociada a moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) de señalización, se ha encontrado que la promoción de tumorigénesis gástrico y es upregulated en
H
.
pylori
infección [6]. Otras citoquinas pro-inflamatorias secretadas por las células T, incluyendo IL-2, IL-17, e interferón gamma (IFN-g), también están regulados por incremento en
H
.
pylori
infección y están asociados con un mayor riesgo de tumorigénesis gástrica [7-10]. Una serie de otros factores, como la exposición continua al consumo de tabaco y la obesidad, están correlacionados positivamente con un mayor riesgo de cáncer gástrico, aunque el mecanismo subyacente no está claro [3,11].

Recientemente, el papel de tolerance- la inducción de células B se ha caracterizado en una serie de enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes [12]. En ratones, CD1d
hiCD5 han sido encontrados
+ B células para ayudar a establecer entorno tolerogénico en los tejidos y tienen un papel en la prevención de la inducción autoinmune [13]. En los seres humanos, CD19
+ CD24
hiCD38
hi células B tienen que induce tolerancia en función saludable, así como las personas infectadas por el VHB [14] similares; la aparición de la enfermedad autoinmune se correlaciona con la pérdida de la función de regulación en este subconjunto de células B [15]. IL-10 es una citocina inmunorreguladora pleiotrópica que es capaz de inhibir una serie de citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo IL-2, IL-17, IFN-g y TNF-a, y se muestra para suprimir potentemente la capacidad presentadora de antígeno de células presentadoras de antígenos [16]. Central para todos los subconjuntos de células B que induce tolerancia, la producción de IL-10 es fundamental para la regulación B mediada por células T en la supresión de la inflamación mediada por células [12,17]. El papel de la regulación mediada por células B en
H
.
pylori
y la posterior inducción de cáncer gástrico, sin embargo, no fue estudiado previamente.

En este estudio, se analizó el perfil de composición de las células B y la expresión de citoquinas en
H
.
pylori
sujetos infectados. El aumento de los porcentajes de CD24
+ CD38
+ B y células reducidos porcentajes de células B vírgenes y que descansan las células B de memoria se encuentran en
H
.
pylor
sujetos infectados por i. El CD24
+ CD38
+ B en células
H
.
temas pylori infectadas habían aumentado
porcentaje de la producción de IL-10, y se había suprimido la expresión de citoquinas pro-inflamatorias cuando se co-cultivaron con células T autólogas.
H
.
pylori-s
timulated CD24
+ CD38
+ B células de
H
.
pylori
sujetos infectados de forma potente secretadas IL-10. Curiosamente,
H
.
fumar pylori infectadas
sujetos obesos y subects habían disminuido los niveles de CD24
+ CD38
+ B células. Se encontraron además, el CD24
+ CD38
+ células B reguladoras de fumadores y de los sujetos obesos a exhibir pérdida de la función supresora cuando se co-cultivaron con células T autólogas y estimulado los niveles de IL-10 redujo después directa
H
.
pylori
estimulación. Además, con el hábito de fumar y los pacientes obesos que luego desarrollaron cáncer gástrico, las frecuencias de las células B de IL-10 secretoras se redujeron aún más, en comparación con los sujetos que no desarrollaron cáncer gástrico. En conjunto, estos datos demuestran que CD38 +
+ B células CD24
se upregulated en
H
.
pylori
infectado con y había suprimido funcionalmente las células T producción de citoquinas inflamatorias. El CD24
+ CD38
+ células B en sujetos fumadores y los obesos, sin embargo, eran refractarios a
H
.
pylori
-estímulo, produjo menos IL-10, y carecían de la capacidad supresora.

Materiales y Métodos

Los sujetos del estudio

Se obtuvieron muestras de sangre periférica primarias de 55
H
.
pylori
pacientes sin úlcera infectadas, de las cuales 15 son consumidores primarios de humo de tabaco y 15 son con obesidad clase I (30 kg /m
2 & lt; IMC & lt; 35 kg /m
2 sujetos), así como 15 sana
H
.
pylori
libre de las personas con úlcera no infectadas. Los individuos con la exposición crónica al humo de segunda mano fueron excluidos del estudio. No se encontraron diferencias significativas en cuanto a edad, sexo, y la historia de una infección previa entre los grupos de estudio. Todos los sujetos fueron seguidos durante 5 años para el estado de desarrollo del cáncer. Todos los sujetos eran individuos no relacionados de la provincia de Henan y su región circundante. Los pacientes fueron reclutados entre Enero de 2008 y Dec 2013, desde la 155ª Hospital Central de PLA en China. Los controles fueron individuos libres de cáncer seleccionados al azar de un programa de cribado del cáncer de la comunidad para la detección precoz del cáncer llevado a cabo en las mismas regiones durante el mismo período los pacientes fueron reclutados. La tasa de respuesta para ambos casos y controles fue de 95%. Los criterios de selección de los controles sanos incluyen individuos libres de cáncer y frecuencia de juego a los casos por sexo y edad (± 5 años). Durante el reclutamiento, consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada uno de los interesados ​​y personales como el sexo, la edad, el peso, la altura y el consumo de tabaco fueron recogidos a través de un cuestionario. No se utilizaron muestras de todos los sujetos en todos los experimentos debido a la conformidad del paciente incompleta y células insuficientes en algunos pacientes. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la 155ª Hospital Central de PLA.

se aislaron de preparación de muestras

periféricos células mononucleares de sangre (PBMCs) a partir de muestras de sangre periférica con el procedimiento estándar de Ficoll-Hypaque y se congelarse inmediatamente a -150 ° C hasta su uso, o usado en los experimentos de inmediato si se indica. medio de cultivo regular es RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 5 ml de 100 U de penicilina /0,1 mg /ml de estreptomicina, y 5 ml de 2 mM de L-glutamina. Las células fueron cultivadas en 5% de CO
2 a 37 ° C durante el período de tiempo establecido.

Se aislaron células Célula de aislamiento

T y B utilizando células T humanas o células B Negativo Kit de Selección (Stemcell, Vancouver, Canada), siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante. Las purezas de aislamientos de células T y B fueron mayores que 94% por citometría de flujo. Para el agotamiento de CD24
+ CD38
+ células B en algunos experimentos, las células B purificadas se tiñeron con CD24 PE anti-humana y APC CD38 anti-humano durante 30 min. Se enviaron entonces las células para vivir clasificación de células y se agotaron las células CD24
+ CD38
+. En el entorno general de las células B, las células fueron enviados total de B a vivir clasificación de células sin los anticuerpos

La citometría de flujo

Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales anti-humanos:. IL-10, TNF un (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.); CD3, CD4, CD19, CD20, CD21, CD24, CD27, CD38 (Biolegend, San Diego, CA, EE.UU.); IFN-g (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.); CD8 (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.). Purificada IgG humana (Biolegend, San Diego, CA, EE.UU.) se utilizó para bloquear los receptores Fc cuando la tinción de las poblaciones de células B que contienen. Para algunos experimentos, forbol-12-miristato-13-acetato (PMA, Sigma), ionomicina (Sigma, Munich, Alemania), o muertos por calor
H
.
pylori gratis (Sigma, Munich, Alemania) fueron utilizados para estimular las células. GolgiStop y GolgiPlug se añadieron 6 h antes de la cosecha celular para la tinción intracelular de IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a, y IL-10. FlowJo se utilizó para el análisis de citometría de flujo.

Luminex ensayo

IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a y IL-10 a partir de células T y células B se midieron cuantitativamente por ensayo de Luminex multiplex siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante con modificaciones (EMD Millipore, Etobicoke, Canadá). Un total de 2x10
5 células T y /o células B se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Corning, Tewksbury, MA, EE.UU.). Para la estimulación de las células B, muertos por calor
H
.
pylori
se añadieron a las células B, que se sembraron en la parte inferior de un pozo 96 transwell placa (Corning, Tewksbury, MA). Para la estimulación de células T, la parte inferior de la placa transwell se pre-incubaron con CD3 (OKT3 clon) anti-humana durante la noche y se lavó, después de lo cual se purificaron células T se transfirieron a la placa. perlas de anticuerpo de captura de citocinas humanas se añadieron a la cámara superior del pozo 96 transwell placa. Doce horas más tarde, se recogieron las perlas, se lavaron y se leen de acuerdo con el protocolo del fabricante.

El análisis estadístico

D'Agostino y prueba de normalidad ómnibus Pearson se utilizó para examinar si los datos se distribuyen normalmente. Se utilizó el análisis de una vía de la varianza (ANOVA) para las comparaciones entre múltiples grupos, seguido por la prueba de Dunn. Se utilizó la prueba t de Student para las comparaciones entre los dos grupos. Si los conjuntos de datos desviación significativa en la distribución normal, se utilizaron pruebas no paramétricas. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism (GraphPad Software). P & lt; 0,05 se consideró significativo. Los resultados se muestran como media ± E.E.M.

Resultados


H
.
pylori
sujetos infectados habían alterado la composición de circulación de células B Opiniones
Para analizar los posibles cambios en el papel de las respuestas de células B en
H
.
pylori
la infección y la forma en que podría verse afectada por el tabaquismo y la obesidad, 15 sanos
H
.
pylori
no infectadas (
H
.
pylori
no infectadas) voluntarios, 20
H
.
pylori
infectados sujetos asintomáticos no fumadores no obesos (asintomáticos), 15
H
.
pylori
infectados por fumar sujetos no obesos (fumadores), y 15
H
.
pylori
infectado con no fumadores obesos (obesos) sujetos fueron reclutados para este estudio. Los datos demográficos y clínicos se resumen en la Tabla 1.

Las células circulantes B en la sangre periférica de sujetos sanos se componen principalmente de IgD
+ CD27
- células B vírgenes y CD21
+ CD27
+ descansando células B de memoria, mientras que en las infecciones crónicas, frecuentemente hay una disminución de las células B vírgenes y descansando células B de memoria, y un incremento en CD21
lo activan las células B y CD24
+ CD38
+ B células [15,18]. Primero examinamos la composición de las células B circulantes en
H
.
pylori
sujetos infectados. células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se tiñeron para la expresión de marcadores de superficie directamente
ex vivo
(Fig 1A). Se encontró que en comparación con
H
.
pylori
no infectadas sujetos sanos, todos los
H
.
pylori
grupos infectados contenían porcentajes más bajos de IgD
+ CD27
- células B vírgenes (P & lt; 0,001 para todos, la figura 1B y 1C). Los porcentajes de CD21
+ CD27
+ células B de memoria en reposo se redujeron en
H
.
pylori
sujetos infectados por fumadores y los obesos en comparación con sujetos sanos (P & lt; 0,001 para ambos), y el porcentaje de CD21
+ CD27
+ células B en sujetos obesos se redujo en comparación con
H
.
pylori
infectados sujetos asintomáticos (P & lt; 0,01). Curiosamente, los porcentajes de CD24
+ CD38
+ B células se variaron entre los diferentes grupos de
H
.
pylori
sujetos infectados.
H
.
pylori
infectados sujetos asintomáticos contenían mucho más altos porcentajes de CD24
+ CD38
+ B células que en los controles sanos (P & lt; 0,001). El porcentaje de CD24
+ CD38
+ B células se redujo en sujetos fumadores en comparación con la de los sujetos asintomáticos (P & lt; 0,05), pero sigue siendo superior a la de los sujetos sanos (P & lt; 0,001). En los sujetos obesos, el porcentaje de CD24
+ CD38
+ B células no fue significativamente diferente de la observada en sujetos sanos, pero se redujo de que en sujetos asintomáticos (P & lt; 0,001).

(A ) La estrategia de apertura de puerta para las células B en PBMC. Todas las poblaciones posteriores mostrados fueron cerrada en consecuencia en el CD3
-CD19
+ linfocitos singlete en vivo. (B) que representan gráficos de puntos representativos IgD frente a CD27, CD27 vs. CD21, CD38 y CD24 vs. expresión en las células B en sana
H
.
pylori
sujetos no infectadas (
H
.
pylori
no infectadas, N = 20),
H
.
pylori
infectado con no fumadores no obesos asintomáticos (asintomática, N = 15),
H
.
pylori
infectados por fumar no obsesas (fumar, N = 15), y
H
.
pylori
infectados no fumadores obesos (Obeso, N = 15) de los sujetos. (C) Los porcentajes de IgD
+ CD27
- células B vírgenes, CD21
+ CD27
+ células de memoria clásica B y CD24
+ CD38
+ células B reguladoras en estudio grupos. *: P & lt; 0,05. **: P & lt; 0,01. ***: P & lt; 0,001. (Kruskal-Wallis ANOVA de una vía y la prueba de Dunn). Para el análisis de citometría de flujo, se recogieron más de 10
6 eventos en la puerta de linfocitos.


H
.
pylori
sujetos infectados habían alterado B de citoquinas de células perfil de expresión

Anteriormente, se encontró que las células B para amplificar o suprimir la respuesta inmune a través de la producción de una serie de citocinas con diferentes funciones, incluyendo pro- citoquinas inflamatorias tales como IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IFN-g y TNF-a, así como IL-10 y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-b) como citoquinas reguladoras [19] . Aquí, hemos examinado la expresión de citoquinas de las células B en los sujetos de estudio. Se encontró que el
ex vivo
expresión de IL-2, IFN-g y TNF-a por células B se incrementaron en
H
.
pylori
infectado con sujetos fumadores y los obesos que en los sujetos sanos (Figura 2A). No se encontraron diferencias significativas en la expresión de TGF-b.

(A) Los porcentajes de células B que expresan el total de la IL-2, IFN-g, TNF-a, y TGF-b en
H
.
pylori
no infectados (N = 7),
H
.
pylori
infectados asintomáticos (N = 8),
H
.
pylori
infectado con el tabaquismo (N = 6), y
H
.
pylori
infectados sujetos obesos (n = 6) en virtud de estimular (sin /ionomicina PMA) condición. (B) gráficos de puntos representativos de células B tinción intracelular de citoquinas o sin estimulación con PMA /ionomicina, a partir de un sujeto no infectado. Las expresiones de citoquinas de las células B totales menos CD24
+ CD38
+ células B (no-CD24
+ CD38
+ células B) y la de CD24
+ CD38
+ B las células se muestran por separado. (C) Los porcentajes de IL-10 que expresan, no CD24
+ CD38
+ B células y CD24
+ CD38
+ B células en todos los grupos de estudio, en tanto no estimulada y PMA /ionomicina condiciones estimulado. (D) Los números de IL-10
+ B células en grupos de estudio, calculado por el porcentaje de células-10 que expresan IL en CD24
+ CD38
+ B células multiplicado por el porcentaje de CD24
+ CD38
+ en células totales B (como se muestra en la figura 1C). *: P & lt; 0.05. **: P & lt; 0,01. ***: P & lt; 0,001. (Kruskal-Wallis ANOVA de una vía y la prueba de Dunn). Para gráficos de puntos, se muestra 5000 eventos en cada puerta.

CD24
+ CD38
+ B células tienen funciones reguladoras en otros estudios y tenía interesantes niveles de expresión en diferentes
H
.
pylori
grupos infectados (Figura 1C). Se examinó la expresión de citoquinas intracelulares por CD24
+ CD38
B + células. Como se muestra en la figura 2B, la expresión de citoquinas de CD24
+ CD38
+ B células eran diferentes de los no-CD24
+ CD38
+ B (células B total menos el CD24
+ CD38
+ B) en las células que no producen altos niveles de IFN-g y TNF-a cuando son estimuladas con PMA /ionomicina, pero expresó niveles muy altos de IL-10, tanto en condiciones no estimuladas y estimuladas. Se comparó la producción de IL-10 de diferentes subconjuntos de células B y encontramos que CD24
+ CD38
+ B células en todos los grupos de estudio secretan mucho más altos de IL-10 que no CD24
+ CD38
+ células B, tanto en condiciones no estimuladas, así como las condiciones de PMA /ionomicina estimuladas (Fig 2C). Por tanto, consideramos la CD24
+ CD38
+ fracción como el subconjunto principal de IL-10 de producción de células B. Dentro de la
H
.
pylori
grupo infectado con, los sujetos asintomáticos tuvieron mayor porcentaje de células IL-10 que expresan CD24 en
+ CD38
+ B células que los sujetos sanos, mientras que
H
.
pylori
infectados pacientes obesos tenían menores células IL-10 que expresan CD24 en
+ CD38
+ B células de pacientes asintomáticos (Figura 2C). Luego multiplicamos la frecuencia de IL-10
+ células en el CD24
+ CD38
+ B células con el porcentaje de CD24
+ CD38
+ células en el total de células B para obtener el "número" de las células IL-10 que expresan en las células B, y se encontró que ambos
H
.
pylori
infectados por sujetos asintomáticos y sujetos fumadores tenían niveles más altos de IL-10
+ B células que los sujetos sanos (P & lt; 0,001 y P & lt; 0,01, respectivamente). Dentro de la
H
.
pylori
infectados grupo, el tabaquismo y la obesidad redujeron significativamente las frecuencias de IL-10
B + células (P & lt; 0,001 para ambos).
de sujetos asintomáticos
En conjunto, estos datos demostró que la citocina reguladora IL-10 es producida principalmente por CD24
+ CD38
+ B y las células se incrementa en
H
.
pylori
infectados sujetos asintomáticos. El tabaquismo y la obesidad reducen IL-10 expresión en CD24
+ CD38
+ B células.


H
.
pylori
infectados por sujetos asintomáticos tenían más actividad tolerogénico mediada por CD24
+ CD38
+ B células que fumar y en obesos

Se sabe que las células B reguladoras para inhibir las respuestas de células T en las infecciones crónicas, tales como la infección por hepatitis B y la infección por virus de la inmunodeficiencia humana [14,20], mediante el establecimiento de entorno tolerogénico a través de IL-10 antes de la inducción de la inflamación [15,21]. Hemos examinado si CD38 +
+ B células de la IL-10 de producción de CD24
tuvieron efectos reguladores similares en
H
.
pylori
: infección. CD4
+ T células co-cultivadas con autólogo CD24
+ CD38
+ - células B agotados habían elevado significativamente la producción de IL-2, IL-17, IFN-g y TNF-a, de CD4
+ células T con las células B cocultured enteros, en
H
.
pylori
pacientes infectados asintomáticos (Figura 3A). En fumadores y los obesos, no se observó tal efecto. Del mismo modo, CD8
+ células T de
H
.
pylori
infectados sujetos asintomáticos co-cultivadas con autólogo CD24
+ CD38
+ - células B agotamiento mejorado significativamente IFN-g y TNF-a la secreción de los co-cultivadas con células B enteros ( Fig 3B). Una vez más, este efecto no se observó en los sujetos fumadores y los obesos. La supresión de la expresión de citoquinas de células T parece estar mediado por CD24
+ CD38
+ células B, ya que la producción más baja de citoquinas se observó en las células CD4
+ y CD8
+ T células co-cultivadas con CD24
+ CD38
+ B células solas. En conjunto, estos datos demuestran que el CD24
+ CD38
+ B en células
H
.
pylori
sujetos infectados suprimen CD4
+ T cell producción de citoquinas pro-inflamatorias
+ y CD8 en
H
.
pylori
infectados sujetos asintomáticos. El tabaquismo y la obesidad inhiben las acciones de regulación de CD24
+ CD38
+ B células. Se aislaron

Las células B y células T puros a partir de PBMCs enteros a través de la selección negativa magnética. Las células B purificadas se tiñeron con anticuerpos CD38 CD24 anti-humano y anti-humanos y se envían para la clasificación de células en vivo. Las células B enteros, CD24
+ CD38
+ - células B agotados, o purificado CD24
+ CD38
+ B células fueron co-cultivadas con células T autólogas in vitro en 1-a 1 relación durante 72 h, después de lo cual las células T se separaron adicionalmente a través de la selección magnética en CD4
+ y CD8
+ fracciones y se cultivaron en presencia de anticuerpos y citoquinas perlas de captura anti-CD3 unido a la placa durante 6 días. N = 8 para cada grupo. Las producciones de citoquinas a partir de (A) CD4
+ células T y (B) CD8
+ células T se midieron mediante el ensayo de Luminex sensible. *: P & lt; 0.05. **: P & lt; 0,01. ***: P & lt; 0,001. (Kruskal-Wallis ANOVA de una vía y la prueba de Dunn).

IL-10 secreción de las células CD24 + CD38 + B cuando
H
.
estimulación pylori
en diferentes materias

A continuación trató de examinar el mecanismo de la regulación positiva de IL-10 en las células B de
H
.
pylori
sujetos infectados. la producción de IL-10 es fundamental para la función de las células B reguladora [12,13]. señalización de los receptores Toll-like es un mecanismo de regulación positiva de IL-10 en las células B grandes, y se demostró que modulan la expresión de citoquinas en
H
.
pylori
infección [22,23]. Hemos probado si la presencia de
H
.
pylori
puede regular al alza directamente la secreción de IL-10 en CD24
+ CD38
+ B células. células B purificadas a partir de PBMC se cultivaron en ausencia o presencia de muertos por calor
H
.
pylori
bacteria. Después de la incubación de 72 h, la secreción de IL-10 en el sobrenadante se midió mediante Luminex. Las células B también se recogieron para intracelular de IL-10 de la tinción. Como se muestra en la figura 4A, IL-10 secreción en el sobrenadante se incrementa en ambos
H
.
pylori
no infectadas sujetos sanos y
H
.
pylori
infectado con no fumadores sujetos asintomáticos no obesos después de
H
.
pylori
-estímulo (P & lt; 0,01 y P & lt; 0,05, respectivamente). La figura 4B muestra que el porcentaje de células B de IL-10 secretoras se reguló en CD24
+ CD38
+ B células después de
H
.
estimulación pylori Hoteles en sujetos sanos y asintomáticos (P & lt; 0,001 y P & lt; 0,05, respectivamente). En contraste, la concentración de IL-10 en el sobrenadante y el porcentaje de IL-10 de producción de CD24
+ CD38
+ B células de
H
.
pylori
sujetos infectados fumadores y los obesos fueron no aumentó significativamente después de
H
.
pylori
: infección. Estos datos demuestran que el tabaquismo y la obesidad presentaron una disminución de la inducción de IL-10 a partir de células B después de
H
.
estimulación pylori
, y sugirió que, en parte, la pérdida de la función reguladora de CD24
+ CD38
+ B células de sujetos fumadores y los obesos fue posiblemente debido a una incapacidad para regular al alza IL-10 la secreción en respuesta a la estimulación antígeno bacteriano (véase la discusión).

total de células B se aislaron de PBMC por selección negativa y después se cultivaron en ausencia o presencia de muertos por calor
H
.
bacteria pylori
, junto con la IL-10 perlas de captura. Después de la incubación de 72 h, la secreción de IL-10 en el sobrenadante se recogió por perlas de captura y se mide mediante el ensayo Luminex. Las células B también se recogieron para intracelular de IL-10 de la tinción. N = 8 para cada grupo. (A) secretada concentración de IL-10 en el sobrenadante. (B) Porcentaje de IL-10
+ en las células CD24
+ CD38
+ B células al final de la incubación de 72 h. *: P & lt; 0.05. **: P & lt; 0,01. ***: P & lt; 0,001. (
t de Student
).

pacientes con cáncer gástrico positivo en el
H
.
pylori
fumar infectado con y
H
.
pylori
infectados grupos obesos tenían frecuencias más bajas de IL-10
+ B células

El fumar y la obesidad se sabe que aumenta el riesgo de desarrollo de cáncer gástrico en
H
.
pylori
sujetos infectados. Dado que el tabaquismo y la obesidad también suprimieron funciones de las células B normales de regulación, se examinó si estos dos fenómenos estaban vinculados. Hemos encontrado que en sujetos fumadores y los obesos, los que se volvieron positivos para el estado de cáncer gástrico tenían frecuencias significativamente más bajos de IL-10
+ células de CD24
+ CD38
+ B células después de
H
.
estimulación pylori
que los que permanecieron negativos para el desarrollo del cáncer gástrico (Fig 5A P. & Lt; 0,05 para ambos). Por otro lado, no hemos encontrado que los pacientes negativos y positivos de cáncer de cáncer fueron significativamente diferentes en términos de sus frecuencias de CD24
+ CD38
+ células B en células totales B (figura 5B). No
H
.
pylori
infectados pacientes asintomáticos en este estudio se convirtió en el cáncer gástrico positivo.

Estado de cáncer gástrico de los pacientes fue rastreado por 5 años después de la recogida de la muestra inicial. (A) Las frecuencias de IL-10
+ células CD24 en
+ CD38
+ B células después directa
H
.
estimulación pylori Hoteles en
H
.
pylori
sujetos fumadores infectados y los sujetos obesos (B) Los porcentajes de CD24
+ CD38
+ células B en células totales B en
H
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pylori
infectado con sujetos fumadores y los obesos. N = 8 para cada grupo. *: P & lt; 0.05. (
t de Student
).

Discusión


H
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pylori
es la principal causa de la aparición de cáncer gástrico. Aunque la mayoría de las infecciones fueron asintomáticos y tratable, un subgrupo de sujetos falla el tratamiento y el progreso de cáncer gástrico. Además, el tabaquismo y la obesidad aumentan el riesgo de desarrollo de cáncer, mientras que los mecanismos no están del todo claras. En este estudio, se observó por primera vez una alteración en la composición de las células B circulantes en
H
.
pylori
infectados sujetos asintomáticos en comparación con sujetos sanos no infectados, con una reducción de IgD
+ CD27
- células B vírgenes y una regulación positiva de CD24
+ CD38
+ células B . El CD24
+ CD38
+ B también se encontraron células siendo el principal subconjunto de células B de IL-10 que secretan. A continuación realizó por células B experimentos de cocultivo de células T y encontramos que las células T en CD24
+ CD38
+ B empobrecido células co-cultivos secretadas niveles más elevados de citoquinas proinflamatorias que las células T co-cultivadas con células B enteros, mientras que las células T cocultured con CD24
+ CD38
+ B solamente las células tenían la menor producción de citoquinas pro-inflamatorias. Además, hemos descubierto que la presencia de
H
.
pylori
podría mejorar directamente la IL-10-expresión de CD24
+ CD38
+ células B. En conjunto, estos datos demuestran que
H
.
pylori
sujetos infectados habían upregulated frecuencias circulantes CD24
+ CD38
+ células B, que expresa altos niveles de IL-10 y exhibió función reguladora. Curiosamente, en
H
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pylori
sujetos infectados fumadores y los obesos, el circulante CD24
+ CD38
+ B células se redujeron en comparación con la frecuencia de
H
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pylori
infectados sujetos asintomáticos, no fueron capaces de suprimir las células T producción de citoquinas pro-inflamatorias en los experimentos de co-cultivo, y no regulan al alza de manera significativa la expresión de IL-10 después de
H
.
pylori
estimulación. Además, se han seguido los sujetos para cinco años y posteriormente se encontró que en comparación con los pacientes con cáncer gástrico-positivo, los pacientes con cáncer gástrico-negativo tuvieron una mayor producción de IL-10 después de
H
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pylori
estimulación. lesiones y destrucción de tejidos celulares crónicas persistentes en
H
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pylori
eran los principales factores que contribuyen al desarrollo del cáncer gástrico [24]. A partir de los resultados presentados en este documento, es posible que el aumento de IL-10-expresión de las células B puede proteger el
H
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pylori
sujetos infectados por la reducción de la inflamación mediada por células T y limitar las lesiones de tejidos, pero en sujetos fumadores y los obesos, la protección de los tejidos mediada por células B no estaba presente. Se necesitan más estudios en el futuro para examinar si la presencia de IL-10
B + células se correlaciona con alteraciones del tejido reducidos en
H
.
pylori
. Esto, sin embargo, no era factible en este estudio, ya que requiere muestras de tejidos gástricos.

Se ha informado de que el consumo de tabaco se asocia con un aumento del estrés oxidativo y la liberación de citoquinas pro-inflamatorias, posiblemente debido a tejido inducido por fumar daños [25,26]. La obesidad también se asocia con aumento de bajo grado, la inflamación crónica [27]. En este estudio, se encontró que los
H
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pylori
sujetos infectados fumadores y los obesos tenían menos de IL-10
+ B células que
H
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pylori
infectados sujetos asintomáticos. Posteriormente, a diferencia de la de los sujetos asintomáticos, la presencia de CD24
+ CD38
+ B células de sujetos fumadores y los obesos en la célula de células-B co-cultivo T no redujeron las células T producción de citoquinas pro-inflamatorias. La reducción en la producción de IL-10 y la falta de la función reguladora de las células B pueden ser consecuencia del estado inflamatorio aumentado en su conjunto en el tabaquismo y la obesidad. De hecho, nuestros datos muestran que las células B de
H
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pylori
fumar infectado con y sujetos obesos, pero no los de los sujetos asintomáticos, tenía niveles de IL-2, IFN-g, y TNF-a la producción de células B de sujetos sanos no infectados, lo que sugiere un sesgo hacia una más fenotipo proinflamatorio. Al mismo tiempo, la exposición al tabaquismo crónico y la obesidad son conocidos por asociarse con mayor riesgo de cáncer gástrico.
pylori
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