Extracto
invasión de células de cáncer, uno de los acontecimientos cruciales en el crecimiento local y la propagación metastásica de tumores, poseen un amplio espectro de mecanismos, especialmente la expresión alterada de metaloproteinasas de la matriz. GRS-500 es una novela de flavonoides sintetizados con una fuerte actividad anti-cáncer, cuyo mecanismo molecular exacta se conoce por completo. Este estudio fue diseñado para examinar los efectos de GRS-500 en la metástasis tumoral utilizando
in vitro
in vivo
ensayos y. LFG-500 podría inhibir la adhesión, la migración y la invasión de MDA-MB-231 células de carcinoma de mama humano. Mientras tanto, se reduce la actividad y la expresión de MMP-2 y MMP-9 a través de la supresión de la activación transcripcional de NF-kappa B en lugar de AP-1 o STAT3. Por otra parte, el GRS-500 reprimido inducida por TNF-α invasión celular través de la inhibición de NF-kB y la posterior actividad de MMP-9. Además elucidación del mecanismo reveló que PI3K /AKT pero no MAPK vía de señalización estuvo implicado en el efecto inhibidor de LFG-500 sobre la activación de NF-kB. GRS-500 también podría suprimir la metástasis de pulmón de células B16F10 melanoma murino
in vivo
. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el biogás-500 podría bloquear la invasión de las células cancerosas a través de la baja regulación de la PI3K /AKT /vía de señalización NF-kB, que proporciona nueva evidencia de la actividad anticancerosa del GRS-500.
Visto: Li C, F Li, Zhao K, Yao J, Cheng Y, Zhao L, et al. (2014) LFG-500 inhibe la invasión de las células cancerosas a través de la baja regulación de PI3K /Akt /NF-kB vía de señalización. PLoS ONE 9 (3): e91332. doi: 10.1371 /journal.pone.0091332
Editor: Zhe Zhang, Xuzhou Medical College, China
Recibido: 1 Noviembre 2013; Aceptado: 9 Febrero 2014; Publicado: 11 de marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China (nº 21.072.232), el Programa de Proyectos de Laboratorio Estatal clave de medicinas naturales, Universidad Farmacéutica de China (nº JKGZ201101, SKLNMZZ201210, SKLNMZZCX201303, SKLNMZZJQ201302), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (n . BK2011620, BK20130220), el Programa de Changjiang eruditos y Equipo de investigación innovadora en la Universidad (IRT1193), la Ciencia y amplificador Nacional; Proyecto de Tecnología Mayor (núm 2013ZX0 9103-001-007, 2012ZX09304-001), el proyecto financiado por la Fundación de China Postdoctoral Ciencia (2013M 541.733), los proyectos previstos para Jiangsu postdoctorales Fondos de Investigación (1301015B), y la Fundación de Ciencias Naturales de la Superior Las instituciones educativas de la provincia de Jiangsu (13KJB350007). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la activación de la invasión y la metástasis, la característica principal del cáncer [1], ha sido ampliamente reconocido como una causa principal de la mortalidad relacionada con el cáncer. membranas basales excesivas y la matriz de degradación extracelular (ECM) es crucial para la invasión tumoral y la metástasis [2]. Las metaloproteinasas de matriz (MMP), una familia de endopeptidasas dependientes de cinc, se asocian con invasión de células tumorales y la metástasis [3], [4]. MMPs tumorales-secretada pueden hidrolizar los componentes de ECM en los tejidos que rodean al tumor, lo que facilita la invasión de las células tumorales a través de la membrana basal a órganos distantes y resultando en metástasis [5]. Entre las MMP, MMP-2 (gelatinasa A, 72 kDa) y MMP-9 (gelatinasa B, 92 kDa) desempeñan un papel fundamental en la degradación de ECM [6]. En consecuencia, se expresan en abundancia en varios tumores malignos [7]. Por lo tanto, las MMP y sus vías de regulación se consideran como dianas prometedoras para fármacos contra el cáncer y los agentes quimioterapéuticos [8].
En general, se demostró que la proteína quinasa fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /AKT y mitógeno activada (MAPK) vías de señalización regulan metástasis en una variedad de células de cáncer [9], [10]. La activación de factores de transcripción aguas abajo incluyendo activador de la proteína-1 (AP-1), STAT3, y el factor nuclear-kB (NF-kB) se reportan para estimular la expresión de MMPs a nivel transcripcional [11]. Especialmente, NF-kappa B, el factor de transcripción extremadamente importante en las células de cáncer, se ha implicado en muchas características del desarrollo del cáncer, incluyendo la proliferación factor de crecimiento independiente, la apoptosis prevenir, ilimitado potencial invasión y el tejido replicativa y metástasis [12], [13] . proteínas NF-kB comprenden una familia de factores de transcripción relacionados estructuralmente, incluyendo p50 (NF-κB1), p65 (de RelA), c-Rel, p52, y RelB. Entre estos factores, solamente p65, RelB, y c-Rel contiene potentes dominios de transactivación dentro de las secuencias C-terminales al dominio de homología Rel (RHD), que contiene las regiones de unión a ADN y de dimerización. Activado NF-kappa B está presente en el núcleo donde se une a secuencias específicas de ADN denominadas elementos de respuesta y regula la transcripción de genes diana. Mientras que en el citoplasma, el NF-kappa B se mantiene en un estado inactivo, que forma complejos con las proteínas I? B inhibidoras. NF-kB se puede activar a través de la vía dependiente de IKK clásica conduce a la translocación nuclear de heterodímeros p50 /p65 [14].
Los flavonoides son un grupo de compuestos ricos en semillas, frutos cítricos, aceite de oliva, té, y vino tinto. En los últimos años, los efectos antitumorales de los flavonoides han sido ampliamente reconocido y estudiado, especialmente su actividad anti-metástasis potente [15], [16]. De acuerdo con los estudios anteriores, los flavonoides pueden inhibir la formación de invadopodios y MMP secreción de [17] y prevenir la migración de células por hasta la regulación de la expresión de transgelin [18]. Las múltiples acciones son atribuibles a su estructura poli-fenólico. Sin embargo, los flavonoides tienen muy baja biodisponibilidad oral debido a su extenso metabolismo de primer paso, que sería más probable ocurrir en sus grupos hidroxilo. Por lo tanto, basado en la estructura de los flavonoides, LFG-500 (C
30H
32N
2O
5, Fig. 1A) fue diseñada para mejorar la biodisponibilidad oral y evitar el metabolismo de flavonoides en su hidroxilo grupos mediante la introducción de una piperazina y unos grupos bencilo. Estas sustituciones también dieron LFG-500 mejor solubilidad en lípidos, por lo que es más fácilmente para entrar en el espacio intracelular. Nuestro estudio anterior demostró que el biogás-500 induce apoptosis a través de una especie de oxígeno reactivo (ROS) vía--mitochondrial mediada en células HepG2 [19]. Desde la metástasis es extremadamente importante en la progresión del cáncer, es esencial para investigar el efecto de LFG-500 en la metástasis del cáncer y del mecanismo implicado. Los consiguientes resultados pueden proporcionar nuevas evidencias de la actividad anticancerígena de GRS-500, así como los flavonoides.
(A) Estructura química de GRS-500. (B) Efecto inhibidor de LFG-500 sobre el crecimiento de células MDA-MB-231 por 24 h. Se empleó el ensayo de MTT. (C) Trypan colorante azul de ensayo de exclusión de LFG-500 sobre el crecimiento de células MDA-MB-231. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de LFG-500 para 24 h. (D) LFG-500 (8 mM) no tiene influencia sobre el tamaño y la forma de las células normal (× 200, la barra de escala representa 30 micras). (E) Efecto inhibidor de LFG-500 en la adhesión de células MDA-MB-231 a la fibronectina. La suspensión celular (100 l, 2 × 10
5 células /ml) se añadió a las placas pre-recubiertas de fibronectina y se incubaron a 37 ° C durante 1 h. A continuación, los medios de cultivo se succiona con cuidado. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS. se adoptó el ensayo de MTT para determinar el número de células adherentes. (F) LFG-500 inhibe la migración celular. monocapa celular fue herido por una punta de pipeta 200 l amarillo seguido de tratamiento con diferentes concentraciones (2, 4, 8 y M) de biogás-500 durante 24 h. El número de las células en la zona desnuda se cuantificó en un microscopio invertido. Las líneas blancas indican el borde de la herida. Las células migraron a través de las líneas blancas se contaron en seis campos aleatorios de cada tratamiento. Las fotografías de la herida de las células tratadas con GRS-500, × 100 (izquierda). La cuantificación de las células migradas (derecha). (G) GRS-500 inhibe la invasión de células. Las fotografías de la célula invadida manchado por la hematoxilina y eosina, × 200 (izquierda). La cuantificación de las células invadidas (derecha).
P * Hotel & lt; 0,05 o
** P
. & Lt; 0,01 representa una diferencia significativa entre el grupo de control
Materiales y Métodos
Declaración de ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de China Farmacéutica. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Materiales
GRS-500 (99,1% de pureza), suministrado por el profesor Zhiyu Li (China Pharmaceutical University, China), se disolvió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración de 10 mM como la solución de reserva primaria. La solución se almacenó a -20 ° C, y se diluyó con medio antes de cada experimento. Los controles fueron tratados con la misma cantidad de DMSO (0,1%) tal como se utiliza en experimentos correspondientes. Para
in vivo
estudio, solución GRS-500 se preparó por la Facultad de Farmacia de la Universidad de China Farmacéutica. Dacarbazina (DCTC, Nanjing empresa de productos farmacéuticos, China) fue adoptado como el control positivo, que se disolvió en NaCl al 0,9% antes de su uso. La fibronectina y matrigel se compraron de BD Biosciences (Bedford, MA, EE.UU.) [20]. Los anticuerpos frente a MMP-9 (H-129) (sc-10737), MMP-2 (H-76) (sc-10736), c-Jun (D) (sc-44), c-Fos (4) (sc -52), NF-kB p65 (C-20) (sc-372), Lamin A (133A2) (sc-56137), IKK /β (H-470) (sc-7607), IgG (H-270) (sc-66913), GFP (FL) (sc-8334), p-ERK1 /2 (Thr 177 /Thr 160) -R (sc23759-R), JNK (D-2) (sc-7345), p- JNK (G-7) (sc-6254), p38 (H-147) (sc-7149), p-p38 (Thr 180) (sc-101758), AKT1 /2/3 (H-136) (SC- 8312), β-actina (sc-130301), y la proteína A-agarosa (sc-2001) se obtuvieron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra STAT3 (T721) (BS-1336), p-STAT3 (S727) (BS-4180), p-STAT3 (Y705) (BS-4181), ERK1 /2 (L352) (BS1112), PI3K p85 /γ (Y463) (BS-3006), y p-AKT (S246) (BS-4286) fueron adquiridos de Bioworld (St. Louis Park.nneapoli, MN, EE.UU.). Los anticuerpos frente a p-IKK /β (Ser176 /180) (16A6) (# 2697), I? B? (44D4) (# 4812), y p-I? B? (Ser32) (14D4) (# 2859) eran de Cell Signaling Technology, Inc . (Beverly, MA, EE.UU.). MTT, azul de tripano, gelatina, paraformaldehído, formaldehído, glicina, Triton X-100, DAPI, Tris, NaCl, HEPES, KOH, KCl, EDTA, NP-40, PMSF, NaF, SDS, DTT, y NaHCO
3 fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).
Animales
Hombre C57BL /6 ratones (6-8 semanas de edad) que pesaban 20-25 g se obtiene a partir de la Shanghai Laboratory Animal Center (Shanghai, china). Los animales se mantuvieron en un ambiente de temperatura y humedad controladas con un 12: ciclo de 12 h de luz /oscuridad. El alimento y agua estaban disponibles
ad libitum
. Todos los procedimientos experimentales y quirúrgicos con animales se realizaron en estricta conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
Cultivo de células
MDA-MB-231 (una línea celular de carcinoma de mama humano) y B16F10 (una línea celular de melanoma murino altamente metastásico) se adquirieron en el Banco de células del Instituto de Biología celular de Shanghai (Shanghai, china). MDA-MB-231 células y B16F10 células se cultivaron en L15 de Leibovitz y medio DMEM (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), respectivamente, ambos de los cuales contiene suero bovino fetal 10% (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU. ), 100 U /ml de penicilina (Beyotime, Nantong, china), y 100 mg /ml de estreptomicina (Beyotime, Nantong, china). Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada de 95% de aire /5% de CO
2 a 37 ° C.
colorimétrico MTT ensayo
Las células (10
4 /pocillo) se sembraron en Falcon placas de 96 pocillos (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.) durante 24 h y luego se exponen a diferentes concentraciones de LFG-500. Después de incubación durante 24 h, 20 l de 5 mg /mL de MTT se añade al medio, y se incubaron las células a 37 ° C durante otras 4 h. A continuación, el medio de cultivo se descartó y 100 l de DMSO se añadió a cada pocillo para disolver el precipitado. La absorbancia (A) se midió a 570 nm utilizando un sistema automatizado Microplated lector ELx800 (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT, EE.UU.). tasa inhibidora del crecimiento de la célula (I%) se calculó mediante la siguiente ecuación: donde A
tratada y A
control fueron la absorbancia promedio de tres experimentos paralelos de los grupos tratados y de control, respectivamente. IC
50 se tomó como la concentración que provocó una inhibición del 50% del crecimiento de las células y se calculó por el método Logit.
El azul tripán colorante de exclusión ensayo
Después expuesto a GRS-500 en concentraciones indicadas durante 24 h, se recogieron las células y se mezcla con 0,4% de azul de tripano. Entonces, ambos sin teñir (viables) y se tiñeron las células (no viables) se cuentan por separado con una cámara de recuento celular (Qiujing, Shanghai, China) bajo el microscopio. (CX21; Olympus, Tokio, Japón)
Cell evaluación morfológica
Las células se sembraron en placas de cultivo celular de 6 pocillos (Corning, Nueva York, NY, EE.UU.) y se trataron con GRS-500 (8 M) durante 24 h. Al final de la incubación, la morfología celular se controló usando un microscopio de luz invertida (IX51, Olympus Corp., Tokio, Japón).
Se realizó ensayo de adhesión celular
ensayo de adhesión celular como se describe [ ,,,0],20] con modificaciones. placas de 96 pocillos se recubrieron con fibronectina (5 mg /ml) a 4 ° C durante la noche y después se bloquearon en BSA (1%) durante 1 h. células privadas de suero se expusieron a LFG-500 (2, 4, 8 o M) durante 24 h antes de la siembra. Se recogieron las células diana y se suspendieron en medio libre de suero. Las células (2 × 10
5 /ml) se sembraron en placas de recubiertas de fibronectina y después se incubó a 37 ° C durante 1 h. Las células no adherentes se eliminaron mediante un lavado suave con PBS. A continuación, se empleó el ensayo de MTT colorimétrico para analizar la capacidad de adhesión de las células.
cicatrización de heridas ensayo
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer hasta 80% de confluencia. Posteriormente, monocapa de células se raspó con una punta de pipeta (Axygen, Union City, CA, EE.UU.) para crear un espacio estrecho herida similar. Poco después de la herida, las células se lavaron con PBS dos veces y se incubaron con LFG-500 (2, 4, 8 o M). Las placas fueron fotografiados a 0, 12, y 24 h utilizando un microscopio de luz invertida. El número de células migradas se cuantificó mediante conteo manual y seis campos elegidos al azar fueron analizados para cada pocillo [21].
invasión de la célula de ensayo
sistema de cámaras Transwell (10 mm de diámetro, 8 micras de poro se empleó tamaño con membrana de policarbonato, Corning Costar, Cambridge, MA) recubiertas con matrigel para examinar la capacidad invasiva de las células cancerosas
in vitro
como se describe anteriormente [22]. En pocas palabras, transwell cámaras se recubrieron inicialmente con matrigel (40 g /100 l /cámara) a 37 ° C durante 1 h. Las células tratadas con o sin LFG-500 (2, 4, o 8 M, 24 h) se suspendieron en medio L15 de Leibovitz (5 × 10
5 células /ml) y se sembraron en el compartimiento superior, mientras que el medio que contiene suero bovino fetal al 10% se añadió en el compartimiento inferior. Después de la incubación en una atmósfera humidificada de 95% de aire /5% de CO
2 a 37 ° C durante 24 h, las células no invadidos en el lado superior de la membrana se eliminaron con un hisopo de algodón. Las células invadidas en la superficie inferior se fijaron con metanol al 100% y se tiñeron con hematoxilina y eosina (Nanjing Sol Biotechnology Ltd., Nanjing, China). Las células invadidas se cuantificaron por recuento manual y seis campos elegidos aleatoriamente se analizaron para cada grupo.
Gelatina zimografía ensayo
Las células fueron tratadas con o sin LFG-500 (2, 4, 8 o M) en medio libre de suero durante 24 h, y luego se recogieron los sobrenadantes de las muestras. ensayo de gelatina zymography se realizó de acuerdo con el método anterior [16]. Después del tratamiento, se observaron regiones de la enzima-digerido como bandas blancas sobre fondo azul. Las zonas de actividad enzimática se observaron bandas como tinción negativa.
PCR en tiempo real análisis
Las células se trataron con LFG-500 (2, 4, 8 o M) durante 12 h, y a continuación, se determinaron los niveles de MMP-9 y MMP-2 mRNA. El primer secuencias sintetizadas por Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) se enumeran de la siguiente manera: MMP-9: 5'-GCA GAG GAA TAC TAC CTG CGC-3 '(hacia delante) y 5'-GGA AGG TTT ATC TGC CCA GGT-3 '(hacia atrás); MMP-2: 5'-CAG GCT CTT CTT CTC TCA CAA C-3 '(hacia delante) y 5'-AAG CTT CCA CGG GGT TTT CCT C-3' (hacia atrás); ß-actina: 5'-CTG TCC CTG TCT GCC TAT G-3 '(hacia delante) y 5'-ATG ACG TCA CGC TCA TCC-3' (hacia atrás). Las reacciones se llevaron a cabo como se describe [23]. Las muestras se analizaron en el Real-Time PCR sistema ABI 7500 (ABI, Foster City, CA, EE.UU.) de la siguiente manera: 30 s a 95 ° C, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60ºC durante 34 s . Cada reacción se realizó por triplicado. Los valores de umbral (CS) para cada ARNm se restaron de la de ARNm β-actina, en promedio, y convierten de log-lineal de términos lineales. Los datos se analizaron con el programa SDS 2.1.
análisis de transferencia de Western
Las células se trataron con varias concentraciones de LFG-500 (2, 4, 8 o M) durante 24 h, después se recogen y se lisadas. análisis de transferencia de Western se llevó a cabo de acuerdo con métodos anteriores [24]. La detección se realizó con el Sistema de Odyssey Infrared Imaging (LI-COR Inc., Lincoln, NE, EE.UU.). Todas las transferencias se desnudaron y se volvieron a sondar con el anticuerpo policlonal anti-β-actina para verificar la carga igual de proteínas.
Preparación de extractos nucleares y citosólicas
Las células recogidas se lisaron con tampón A (10 mM Hepes-KOH (pH 7,9), KCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, 0,5% NP-40, 1 mM de DTT, y PMSF 0,5 mM) en hielo durante 15 min para permitir que las células se hinchen, y luego se centrifuga a 14 000 ×
g
a 4 ° C durante 15 minutos. Los sobrenadantes se guardan como las fracciones citosólicas. Los gránulos nucleares se incubaron con tampón de alta salinidad (Hepes 20 mM, 0,5 M KCl, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, y PMSF 1 mM, pH 7,9) en hielo durante 30 min, y después se centrifugaron a 12 000 rpm a 4 ° C durante 15 min para obtener fracciones nucleares.
inmunofluorescencia detección
Las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio y se incubaron con o sin 8 M LFG-500 durante 24 h. los pasos siguientes se realizaron como se describe [24], con modificaciones. Las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído en PBS a intervalos de 1 h, se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100, y se bloquearon con 2% de BSA durante 30 min. La incubación con el anticuerpo primario contra p65 NF-kB (diluido 1:50) se llevó a cabo durante la noche a 4 ° C. Después del lavado, las células se expusieron secuencialmente a anticuerpos secundarios conjugados con FITC (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU., L42001) y DAPI. Se observaron imágenes y capturaron con un microscopio de barrido láser confocal (FV1000; Olympus, Tokio, Japón)
ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)
Las células fueron tratadas con 2, 4 y 8. M-500 GRS durante 24 h. Las actividades de unión a ADN de NF-kB en extractos nucleares se evaluó por la EMSA [25] utilizando el kit de EMSA (Beyotime, Nantong, China) con oligonucleótidos NF-kB de doble cadena marcados con biotina (Beyotime, Nantong, China). Las secuencias de los oligonucleótidos adoptadas fueron las siguientes: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3 'y 3'-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5'. Brevemente, los extractos nucleares (6 g /muestra) se incubaron con los oligonucleótidos en tampones de reacción para 30 min. complejos de ADN de proteína se separaron en un gel de acrilamida no desnaturalizante al 6%, transferidos a membranas de nylon cargada positivamente, y reticuladas en un Stratagene reticulante. cambios en la banda fueron detectados por método de quimioluminiscencia con ChemiDoc Sistema XRS + (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ensayo de
Las células fueron incubadas con GRS-500 ( 2, 4, 8 o M) durante 24 h, y luego se realizó chip de ensayo como se describe [26] con algunas modificaciones. En resumen, las células fueron reticulados con formaldehído, se inactivó con glicina, se sonicó en hielo, y se centrifugó a 4 ° C. Alícuotas de los lisados que contienen 200 g de proteína se utilizaron para cada reacción de inmunoprecipitación con anti-NF-KB p65 o IgG pre-inmune. Las mezclas se hicieron girar a 4 ° C durante la noche y después se incubaron con proteína A-agarosa durante 6 h. Finalmente, los complejos inmunes capturados se eluyeron con tampón de elución (1% SDS y 0,1 M NaHCO
3) a 37 ° C durante 30 min. reticulaciones de proteínas de ADN se invirtieron a 65 ° C durante 4 h en un tampón de alta concentración de sal (0,2 M NaCl, 50 mM Tris, pH 6,5, EDTA 10 mM, y 0,2 mg /ml de proteinasa K). Extraídos y ADN inmunoprecipitado disuelto se cuantificó por análisis de PCR en tiempo real con cebadores que abarca los sitios de unión de NF-kB. Los cebadores para la MMP-9 promotor de cuantificación fueron 5'-CAG TGG AAT TCC CCA CCG TTG CCT-3 'y 5'-CCA CAC TCC AGG CTC TGT CCT C-3'.
transfección celular y NF kappa B dependiente del gen reportero ensayo de expresión
El efecto del GRS-500 de NF-kB dependiente de la transcripción del gen indicador se analizó mediante ensayos de gen reportero de luciferasa [27]. Las células (5 × 10
5 células /pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos. A continuación, el PNF-B-luc (Beyotime, Nantong, China) que contiene cuatro motivos de unión a NF-kappa B (GGGAATTTCC) se transfectadas transitoriamente en las células utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc., Grand Island, NY, EE.UU.), de acuerdo a la fabricación de instrucción. Se añadió el plásmido pCDNA3.2 para hacer que la cantidad total de ADN igual (4 mg /pocillo en una placa de 6 pocillos) con GFP sirvió como control de normalización. Después de LFG-500 (2, 4, o 8 mM) de tratamiento durante 24 h, ensayos de luciferasa se realizaron con el kit Luciferase gen reportero de ensayo (Promega, Madison, WI, EE.UU.), utilizando ascenso Luminoskan (Thermo, Waltham, MA, EE.UU.) . se recogieron
In vivo metástasis tumoral ensayo
células de melanoma B16F10 a una concentración apropiada en PBS y se inyectaron a través de la vena de la cola en ratones C57BL /6 singénicos. Los ratones se aleatorizaron por igual en cinco grupos (10 ratones /grupo): 0,9% grupo de control de solución salina normal, DCTC 100 mg /kg /2 días grupo de control positivo, LFG-500 de grupo /kg /día 12,5 mg, de biogás-500 25 mg /kg /día del grupo, y GRS-500 50 mg grupo /kg /día. Después de la inoculación durante 24 h, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con los compuestos de ensayo durante 21 días. A continuación, los ratones se pesaron y se sacrificaron. de glóbulos blancos (WBC) fue analizada por el K-4500 analizador hematológico Sysmex (Sysmex Inc., Kobe, Japón). Los pulmones se retiraron, y se lavaron con PBS. El número de nódulos tumorales superficiales se contó con un microscopio de disección [20].
El análisis estadístico
Todos los datos en los diferentes grupos experimentales se expresan como la media ± S.E.M. Los datos mostrados se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes. Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante ANOVA de una vía y prueba post hoc de Dunnett. Las diferencias significativas fueron representados como
P * Hotel & lt; 0,05 o
** P
. & lt; 0,01
Resultados
GRS-500 inhibe la adhesión, migración , y la invasión de MDA-MB-231 células en
ensayo MTT vitro mostró que el crecimiento celular se redujo de forma sistemática con concentraciones crecientes de LFG-500 (Fig. 1B). El IC
50 valor de GRS-500 en las células MDA-MB-231 durante 24 h fue 15,67 ± 0,82 M. Sin embargo, LFG-500 (hasta 8 M) no tenía ninguna influencia evidente sobre el crecimiento de células MDA-MB-231 (Fig. 1B), lo cual fue confirmado por el ensayo de exclusión del colorante azul de tripano (Fig. 1C). Cell examen morfología también mostró que LFG-500 (8 M) no afectó el tamaño y la forma de las células (Fig. 1D) normal. Por lo tanto, 8 M de LFG-500 se determinó como la concentración más alta para los experimentos posteriores.
metástasis del tumor se produce a través de una serie compleja de eventos. Las células tumorales exhiben una variedad de propiedades, incluyendo adhesividad alterada, aumento de la motilidad y capacidad invasiva, para completar el proceso metastásico [28]. Por lo tanto, la adhesión de células tumorales a ECM y la membrana basal se considera como un paso fundamental para la metástasis del cáncer. Se examinó la influencia de LGF-500 de la capacidad adhesiva de las células MDA-MB-231 a los sustratos pre-recubiertas con fibronectina, un componente importante de la ECM. tratamiento de biogás-500 (4 y 8 M) suprimió MDA-MB-231 células de adhesión a la fibronectina por 33,6 ± 8,6% (n = 3,
P
& lt; 0,05) y 42,7 ± 9,1% (n = 3 ,
P
. & lt; 0,05), respectivamente (figura 1E). Por otra parte, se detectan los efectos de GRS-500 sobre la migración celular y la invasión. Como se muestra en la Fig. 1F, las células migraron a través del espacio de heridos se redujo en un 41,2 ± 8,4% (n = 3,
P Hotel & lt; 0,05), 64,9 ± 9,2% (n = 3,
P & lt
; 0,01), y 89,1 ± 4,2% (n = 3,
P
& lt; 0,01), respectivamente, cuando las células se trataron con 2, 4, y 8 M LFG-500 durante 24 h. Además, LFG-500 (4 y 8 M) reduce la capacidad de invasión de las células MDA-MB-231 por 51,9 ± 9,3% (n = 3,
P
& lt; 0,05) y 74,7 ± 10,2% ( n = 3,
P
& lt;.. 0,01), respectivamente (Fig 1G)
LFG-500 suprime la actividad y la expresión de MMP-2/9 en las células MDA-MB-231
MMP-2/9, secretada y activado por las células cancerosas, hidrolizar la membrana basal y ECM, lo que facilita la invasión de las células malignas y los resultados en la metástasis [29]. Para explorar el posible mecanismo anti-metástasis de GRS-500, la actividad gelatinolytic de MMP-2/9 secretada por las células MDA-MB-231 se detectó después del tratamiento del GRS-500. Como se muestra en la Fig. 2A, LFG-500 (8 M), obviamente, suprimió la actividad de MMP-2 y MMP-9, con tasas de inhibición de 62 ± 8,2% (n = 3,
P
& lt; 0,01) y 81 ± 7,9 % (n = 3,
P
& lt; 0,01), respectivamente. Además, el efecto inhibidor sobre la actividad de MMP-9 era más significativa.
(A) LFG-500 inhibe la actividad de MMP-2/9 en las células MDA-MB-231. Las células se trataron con diversas concentraciones (2, 4, y 8 M) de biogás-500 durante 24 h. Se recogieron los medios condicionados, y luego la actividad de MMP-2/9 se determinó mediante el ensayo de zimografía de gelatina. (B) GRS-500 disminuye los niveles de MMP-2/9 ARNm. Las células se incubaron con las concentraciones indicadas de LFG-500 para 12 h. Los niveles de ARNm se detectaron por análisis de PCR en tiempo real. (C) LFG-500 suprime la expresión de la proteína de MMP-2/9. lisados de células MDA-MB-231 se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos contra MMP-2 (1:400) y MMP-9 (1:400).
P * Hotel & lt; 0,05 o
** P
. & Lt; 0,01 representa una diferencia significativa entre el grupo de control
Con el fin de entender mejor el down-regulación efectos de LFG-500 en MMP-2 y MMP-9, se realizó un análisis de PCR en tiempo real. Como se muestra en la Fig. 2B, la inhibición de la expresión génica se observó obviamente, con el nivel de MMP-2 mRNA reducido en 47,5 ± 9,5% (n = 3,
P
& lt; 0,05) y ARNm de MMP-9 se redujo en 68,1 ± 7,1% (n = 3,
P
& lt; 0,01), respectivamente, después del tratamiento de 8 M LFG-500 durante 12 h. Los cambios mediados por LFG-500 en los niveles de MMP-2 y MMP-9 mRNA fueron consistentes bien con su expresión de la proteína, como se evidencia por análisis de transferencia Western (Fig. 2C). Estos resultados indicaron que el biogás-500 podría regular la MMP-2/9 en el nivel transcripcional. Más importante aún, los efectos inhibidores sobre la MMP-9 fueron más notable.
LFG-500 reprime la invasión celular a través de la inhibición de la activación transcripcional de NF-kappa B y la posterior actividad de MMP-9
En general, es informó de que la regulación transcripcional mediante la activación de factores de transcripción incluyendo AP-1 [30], STAT3 [31], o NF-kappa B [32] se produce durante la modulación de la MMP-9 expresión génica. Para aclarar aún más el mecanismo subyacente GRS-500 supresión de MDA-MB-231 células invasión, se investigaron los efectos de GRS-500 de estos factores de transcripción. Los datos en la Fig. 3A demostrado que el biogás-500 no tuvo efectos significativos sobre los niveles nucleares de componentes de (AP-1) c-jun o c-Fos. Además, no hubo ningún cambio notable en la fosforilación de STAT3 cuando se le da el mismo tratamiento (Fig. 3A). Sin embargo, LFG-500 inhibe la translocación nuclear de p65 NF-kappa B, con un nivel nuclear disminuido, pero un mayor nivel citoplásmica (Fig. 3B), que fue confirmada por el ensayo de inmunofluorescencia (Fig. 3C). Por otra parte, la cantidad total de NF-kB p65 se redujo después del tratamiento del GRS-500 (Fig. 3D). Por la razón que NF-kB resultados de la activación de la fosforilación rápida, ubiquitinación y degradación en última instancia proteolítica de I? B [33], así como se requiere IKK para la fosforilación de I? B, se detectaron [34] los niveles de fosforilación de IKK /β y I? B? . GRS-500 (4 M y 8 M) inhibe eficazmente la fosforilación de IKK /β y I? B, mientras que los niveles totales de estado estable se mantuvo sin cambios (Fig. 3D). Estos resultados indican que NF-KB en lugar de AP-1 o STAT3 podrían estar involucrados en el efecto anti-invasivo inducido por GRS-500.
(A) GRS-500 no tiene efectos significativos sobre la AP-1 o STAT3. Las células se trataron con diversas concentraciones (2, 4, y 8 M) de biogás-500 durante 24 h. Los niveles nucleares de las proteínas se detectaron por ensayo de transferencia de Western usando anticuerpos específicos. Lamin-A se utilizó como control de carga nuclear. (B) LFG-500 inhibe la translocación nuclear de NF-kB. Citosólicas y nucleares extractos en las células se prepararon de acuerdo con los "Materiales y métodos". Los niveles nucleares y citoplasmáticos de NF-kB p65 se determinaron mediante un ensayo de Western blot. (C) El efecto inhibidor de LFG-500 en la translocación nuclear de NF-kB. Las células MDA-MB-231 se immunostained con p65 anti-NF-kB (1:50) y DAPI (× 400, la barra de escala representa 30 micras). (D) Los efectos de la GRS-500 sobre los niveles de fosforilación de IKK /β y I? B. Las células se trataron con diversas concentraciones (2, 4, y 8 M) de biogás-500 durante 24 h, y la expresión de proteínas diana se detectó por transferencia Western utilizando anticuerpos específicos en los que se utilizó β-actina como control de carga.
P * Hotel & lt; 0,05 o
** P
. & Lt; 0,01 representa una diferencia significativa entre el grupo de control
A continuación, la actividad de unión a ADN de translocado NF-kB se evaluó adicionalmente.
in vitro
, los extractos nucleares fueron incubadas con sondas de ADN específicas para la NF-kB, y su unión fue evaluada por cambio de movilidad. Como se muestra en la Fig. 4A, GRS-500 notablemente bloqueó la actividad de unión al ADN de NF-kB. Para confirmar aún más este hallazgo, chip de ensayo se realizó para probar la actividad de unión de NF-kappa B al promotor de MMP-9, que es el gen diana NF-kB. Los resultados mostraron que la actividad de unión se inhibió de manera significativa tras el tratamiento de biogás-500 (Fig. 4B). Ya que el ADN vinculante por sí sola no siempre se correlacionan con la transcripción del gen NF-KB dependiente [35], también se analizaron los efectos de la GRS-500 en la actividad del indicador NF-KB-dependiente. células MDA-MB-231 fueron co-transfectadas con GFP y plásmidos pNF-B-luc. GRS-500, obviamente, suprimió la actividad de luciferasa, con una disminución de 3 veces después de 8 M de tratamiento (Fig. 4C). Como se muestra en la Fig. β-actina se utilizó como control de carga.