Extracto
El cáncer de pulmón es la neoplasia maligna más letal en el mundo, y cada año miles de personas mueren a causa de esta enfermedad. La detección temprana ha demostrado aumentar la supervivencia a 5 años para este cáncer en general, independiente del sitio de origen en el pulmón. Para hacer frente a este reto, hemos utilizado a base de células SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) para seleccionar un panel de aptámeros capaces de distinguir las células de adenocarcinoma de pulmón de células epiteliales de pulmón normales. Estos aptámeros se unen a nivel fisiológico y las condiciones fijadas en formalina y afinidad de visualización para sus objetivos con aparente K
d's en el rango nanomolar. Nuestros hallazgos sugieren que los aptámeros seleccionados tiene el potencial para ser utilizado en la práctica clínica, así como para mejorar la clasificación de los especímenes quirúrgicos, otro de los retos actuales en el cáncer de pulmón
Visto:. Jiménez E, K Sefah, López- Colón D, Van Simaeys D, Chen HW, Tockman MS, et al. (2012) Generación de adenocarcinoma de pulmón Los aptámeros de ADN para Estudios sobre el Cáncer. PLoS ONE 7 (10): e46222. doi: 10.1371 /journal.pone.0046222
Editor: Muy-Teck Teh, Barts & amp; La London School de Medicina y Odontología de la Universidad Queen Mary de Londres, Reino Unido
Recibido: May 7, 2012; Aceptado: 28 Agosto 2012; Publicado: 17 de octubre 2012
Copyright: © Jiménez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La publicación de este artículo fue financiada en parte por la Universidad de Florida Fondo editorial Acceso libre y por los Institutos nacionales de Salud de subvención#69953, Washington, DC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es el segundo tipo de cáncer más común y la causa principal de las muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [1]. En los Estados Unidos, se estima que 226,160 nuevos casos y 160,340 muertes ocurrirán en 2012 (para células no pequeñas y de células pequeñas combinadas). En comparación con otros tipos de cáncer, los tumores de pulmón son muy heterogéneas, con tumores se presentan más de un subtipo como una característica común [2]. La gran mayoría de los tumores de pulmón son carcinomas, que por lo general se clasifican como no pequeñas carcinomas de pulmón no microcítico (CPNM) o carcinomas de pulmón de células pequeñas (SCLC) sobre la base del análisis morfológico de muestras histológicas teñidas [3] - [4]. NSCLC es el tipo de cáncer de pulmón más común, que comprende 85% de todos los casos de cáncer de pulmón; sin embargo, es un tipo de cáncer más pasiva. CPNM se compone de tres diferentes subtipos: adenocarcinoma (ADC), el carcinoma de células escamosas (SCC), y carcinoma de células grandes (LCL). Por otro lado, SCLC es menos común, que comprende 15% de todos los casos de cáncer de pulmón, pero es más agresivo. El tabaquismo es un factor de riesgo fuertemente asociado con el cáncer de pulmón, específicamente SCC [5] - [10]. Adenocarcinoma de pulmón se desarrolla comúnmente por los pacientes que nunca han fumado, y los cambios genéticos se asocian a menudo con su aparición.
Como la mayoría de las personas con cáncer de pulmón en la etapa inicial no presentan síntomas, más del 70% de cáncer de pulmón los casos se diagnostican en etapas posteriores, por lo que la tasa de supervivencia a 5 años es pequeña. Por lo tanto, la investigación dirigida a la detección temprana, la cual es fundamental para reducir la mortalidad y la morbilidad, se ha dirigido al desarrollo de aptámeros adecuados. Los aptámeros son oligonucleótidos de ADN o ARN cortos, de cadena sencilla que son elementos muy específicos de reconocimiento de destino en función de sus formas tridimensionales únicas [11] - [12]. Mientras que el proceso conocido como SELEX (evolución sistemática de ligandos por Enriquecimiento Exponencial) se utilizó originalmente para seleccionar aptámeros contra objetivos tales como proteínas purificadas [13] - [14], SELEX basado en células se ha convertido en el método más nuevo de selección de aptámeros contra células enteras , especialmente los aptámeros dirigidos proteínas de la superficie sobreexpresados en las células cancerosas.
Entre sus muchas ventajas, los aptámeros no han mostrado, o extremadamente baja, inmunogenicidad, permitiendo
in vivo
estudios que utilizan estas sondas [15] - [18]. También se han popularizado como alternativas a los anticuerpos, debido a bajo coste aptámeros '(sin animales necesarios para la producción), modificación química fácil, y la capacidad de absorción celular. Además, debido a los aptámeros son pequeños en longitud con generalmente 15 a 100 nucleótidos (nt), tienen mejor penetración en el tejido en comparación con anticuerpos. En 2004, Macugen, un anti-VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) inhibidor, se convirtió en el primer aptámero aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para Edad Degeneración Macular Relacionada (AMD) [19]. Otros aptámeros permanecen en los ensayos clínicos [20], y han demostrado un gran potencial en el campo de la biomedicina, incluyendo la separación, la administración de fármacos y evaluación de los objetivos-sonda. Este informe describe el uso de células-SELEX para seleccionar un panel de aptámeros capaces de distinguir entre el adenocarcinoma de pulmón y las células epiteliales de pulmón normales.
Resultados y Discusión
Desde su descubrimiento, los aptámeros se han generado contra diferentes objetivos, que incluyen proteínas, péptidos y células vivas [21] - [22]. Para aislar aptámeros capaces de diferenciar las células de adenocarcinoma de pulmón de células epiteliales pulmonares normales, se utilizó la estrategia de SELEX basado en células. H23 adenocarcinoma de pulmón y HBE 135-E6 /E7 normal de pulmón epitelial se utilizaron como líneas celulares positivas y negativas, respectivamente. Una biblioteca aleatoria ssDNA inicial que contiene aproximadamente 10
14 secuencias diferentes de 80 nucleótidos (nt) se enriqueció con la unión secuencial con las células diana, la elución y la posterior amplificación por PCR durante 18 rondas. Estas secuencias de ADN podrían reconocer proteínas de la membrana de la superficie celular H23 que son marcadores potenciales para terapia dirigida. En las rondas anteriores del proceso, selección del contador se introdujo con el fin de eliminar los posibles secuencias de proteínas comunes en ambas líneas celulares negativas de destino y de unión. Este procedimiento se realizó cada dos redondo en toda la selección. Secuencias de unión a las células diana se eluyeron y amplificado por PCR, después de lo cual ssDNA se recuperó y se utilizan para controlar el proceso de selección por citometría de flujo. Debido a que las piscinas ssDNA se enriquecieron con secuencias específicas para la diana, un aumento en la intensidad de fluorescencia se observó primero en la ronda 12 (Figura 1A), lo que indica que esas secuencias mostraron una mejor unión en la superficie de las células H23 en comparación con la biblioteca inicial. A medida que avanzaba la selección, la intensidad de fluorescencia de las piscinas posteriores aumenta gradualmente hasta que se observó un estado estable en la intensidad de fluorescencia en las rondas 17 y 18 (Figura 1B), lo que indica que la unión máxima se había logrado. En contraste, no se observó tal enriquecimiento cuando las combinaciones enriquecidas se ensayaron frente a las células epiteliales del pulmón normal (Figura 1D), lo que implica que las secuencias contenidas en esas piscinas eran capaces de distinguir las células de adenocarcinoma de pulmón de células epiteliales de pulmón normales. Por lo tanto, las piscinas 14, se seleccionaron 16 y 18 para ser secuenciados como candidatos de aptámero (Figura 1C).
Ensayo de unión de piscinas 11-18 con H23 (A-B) y piscinas 15-18 con HBE135 E6 /E7 (C). La citometría de flujo ensayo para vigilar la unión de la piscina seleccionado con H23 células (células diana) y HBE135 E6 /E7 (células negativas). La curva verde representa la unión de la biblioteca de ADN no seleccionado fondo. Por H23 células, hubo un aumento en la capacidad de las piscinas de unión como la selección progresó, mientras que hubo poco cambio de las células de control, HBE 135 E6 /E7. Apunta la figura 1: El objetivo de esta figura es mostrar cómo el proceso de selección de la celda se enriqueció para la línea celular H23 pero no para la línea celular HBE135E6 /E7
El proceso de secuenciación se inició con la construcción de. la biblioteca 454 secuenciación por PCR-adición de 454-cebadores específicos para los extremos 3 'y 5' extremos de las combinaciones enriquecidas. Para identificar el grupo para cada secuencia, un código único de identificación (código de identificación del centro, MID) también fue PCR-presentó a la biblioteca de la secuencia 454. La inserción de cebadores en las combinaciones enriquecidas se confirmó por electroforesis en gel (datos no mostrados). Después de la secuencia 454 en el núcleo UF ICBR, alrededor de 7.000 secuencias fueron recuperados y analizados. Ellos se agruparon sobre la base de la MID correspondiente a la misma piscina, y los cebadores se eliminaron mediante un programa de Perl. Las secuencias que contienen únicamente la región aleatoria fueron alineados utilizando el programa en línea MAFTT 6,0 [23], y seis familias de aptámero correspondientes a las secuencias más abundantes fueron elegidos como candidatos de aptámero. Ellos se sintetizaron químicamente, marcado con biotina en el extremo 3 ', se purificó por HPLC, y se cuantifica. Todos los aptámeros de unión muestran con células de adenocarcinoma de pulmón H23, mientras que no se observó una unión significativa con la línea celular de control HBE 135 E6 /E7, las células pulmonares epiteliales normales (Figura 2 y Figura S1). Estos resultados indican que el éxito de la selección negativa se había llevado a cabo y que los aptámeros seleccionados podía distinguir entre adenocarcinoma de pulmón y las células epiteliales de pulmón normales, un resultado que confiere estos aptámeros con el potencial para su uso en el diagnóstico de cáncer de pulmón, el seguimiento de la progresión del tumor y el tratamiento, u otro aplicaciones pertinentes.
la citometría de flujo ensayo para la unión del aptámero EJ4 seleccionado con H23 (línea de células diana) y HBE135 E6 /E7 (línea celular negativa). La curva verde representa la unión de una secuencia aleatoria (biblioteca) de fondo. Objetivo Figura 2: El objetivo de esta figura es mostrar que los aptámeros candidatos son de hecho los aptámeros porque se unen con la línea celular positiva (H23), pero no se unen con la línea celular negativa (HBE135E6 /E7)
.
Todos los aptámeros seleccionados mostraron afinidades (Ki aparente
d's) a la línea de células H23 en el rango nanomolar (45-250 nM) (Tabla 1 y Figura S6) de unión. Estos resultados sugieren que estos aptámeros serán ampliamente aplicable, ya que bien se unen a su objetivo. Otros estudios se llevaron a cabo para caracterizar los aptámeros seleccionados. La unión se ensayó adicionalmente contra líneas celulares de cáncer de pulmón, así como otras líneas celulares, incluyendo ovario y colon, como se muestra en la Tabla 2. Los aptámeros EJ2, EJ4 y ade1 muestran cierto reconocimiento hacia una o más de las siguientes líneas celulares: TOV21G, DLD1, y H460. En el caso de DLD1, una línea celular de adenocarcinoma de colon, fue interesante ver algunos reconocimiento por los aptámeros seleccionados, lo que sugiere que un posible objetivo de la superficie celular común está presente en estas dos líneas celulares, ya que pertenecen al mismo grupo histológico. En un estudio previo en nuestro laboratorio, la proteína diana de Sgc8 aptámero se demostró que era PTK7 [24], una proteína pseudo-quinasa presente en las células CEM (la línea de célula diana para la que la selección), así como otros tipos de cáncer, incluyendo ovario , pulmón, colon, mama y algunas líneas celulares de leucemia, lo que indica que las proteínas comunes pueden estar presentes como resultado de cáncer [25] - [26]. Los aptámeros, EJ4 y ade1 también mostraron particular, especificidad hacia la línea celular de adenocarcinoma de pulmón con aumento significativo de la intensidad de fluorescencia con respecto a una secuencia aleatoria, pero no a las células pulmonares normales. Estos resultados sugieren que estos aptámeros podrían ser utilizados para estudios de cáncer de pulmón.
Flexible unión de aptámeros a diferentes temperaturas puede ampliar su repertorio de aplicaciones. Dado que la selección se realizó a 4 ° C, se realizó los ensayos de unión a 25 ° C y 37 ° C (Figura 3 y Figura S2). Como se muestra en la Figura 3 y la Figura S3, aptámeros ade1, ADE2, EJ2, EJ5 y EJ7 conservadas de unión a 25 ° C y 37 ° C con intensidades de fluorescencia similares a los de 4 ° C. Esto es particularmente importante en ensayos realizados en condiciones fisiológicas, tales como los que evaluaron
sobre las aplicaciones en vivo.
La citometría de flujo ensayo para aptámero seleccionado EJ4 con H23 (línea celular diana) a temperatura fisiológica ( 37 ° C). Encuadernación a 4 ° C se utilizó como control positivo. La curva verde representa la unión de una secuencia aleatoria (biblioteca) de fondo. Objetivo Figura 3: El objetivo de esta figura es demostrar la unión del aptámero seleccionado EJ4 a 25 ° C y la temperatura fisiológica, 37 ° C
Detección de cáncer se basa en la evaluación del tejido de biopsias. , que están fijados en condiciones químicas para preservar la integridad y la antigenicidad de muestras de tumor para su uso posterior. Un ensayo importante en el diagnóstico del cáncer se inmunotinción, en el que los tejidos recién disecados se fijan antes del tratamiento con sondas, tales como anticuerpos y aptámeros, específicamente para marcadores tumorales. Estudios anteriores han mostrado que los aptámeros son capaces de tejido etiquetado fijado con formalina en parafina (FFPE) después de la desparafinación y el antígeno de recuperación de [27] - [28]. Para determinar la capacidad de unión de los aptámeros seleccionados bajo esas condiciones, las células se fijaron con formalina al 10% antes de la incubación con aptámeros marcados. Como control para estos experimentos, dos aptámeros conocidos para la leucemia, Sgc8 y TD05, y sus correspondientes líneas de células de unión se utiliza para mostrar que el proceso de fijación no produce ninguna señal de fluorescencia. Por tanto, cualquier fluorescencia detectada debe ser una indicación de un suceso de unión entre los aptámeros y su objetivo. Como se muestra en la figura S3, ambos controles retuvieron su perfil de unión inicial, que indica que no incremento artificial en la intensidad de fluorescencia se produjo como resultado de las condiciones de fijación. aptámeros EJ2, EJ5, EJ7, ade1, y ADE2 mantienen una unión similar a la que se muestra a 4 ° C (Figura 4), indicando que los aptámeros se pueden unir a sus objetivos, incluso en condiciones fijas. Estos resultados sugieren fuertemente que los aptámeros seleccionados tienen el potencial de ser usado como moléculas de reconocimiento en muestras clínicas.
Ensayo de unión de aptámeros con células pre-fijadas con formalina al 10% H23 (objetivo). Columna de la izquierda muestra la unión de aptámeros seleccionados con las células no tratadas a 4 ° C. columna de la derecha muestra la unión de aptámeros seleccionados células fijadas. La curva de color verde claro representa la unión de una secuencia aleatoria (biblioteca) de fondo. Objetivo Figura 4: El objetivo de esta figura es mostrar la capacidad de unión del aptámero seleccionado EJ4 a las células que se han fijado con formalina al 10%
Durante la selección de células, se espera que los aptámeros interactúan. específicamente con las superficies de las células diana; este comportamiento ha sido reportado en varios estudios [29] - [31]. En nuestro experimento, las células se trataron con dos enzimas, tripsina y proteinasa K, para los 3 y 10 minutos, se lavaron con PBS, y luego incubadas con aptámeros. Todos los aptámeros seleccionados perdidos de unión después del tratamiento con las dos proteasas (Figura 5 y la Figura S5 Para todos los experimentos, la intensidad de fluorescencia se redujo significativamente;. Sin embargo, la señal correspondiente a ensayos con proteinasa redujo a un segundo plano, lo que indica que la proteína diana se eliminó completamente . después del tratamiento
citometría de flujo ensayo para aptámeros seleccionados después del tratamiento con proteasas; se utilizaron células no tratadas como control positivo células (a) tratados con tripsina durante 3 y 10 minutos antes de la unión con aptámero seleccionado EJ4 (B).. las células tratadas con proteinasa K durante 3 y 10 min de unión previa con aptámero EJ4 objetivo Figura 5:. el objetivo de esta figura es demostrar que los objetivos de los aptámeros seleccionados son proteínas presentes en la superficie celular de las células cancerosas (H23).
conclusión
En conclusión, hemos seleccionado un panel de aptámeros capaces de distinguir el carcinoma de pulmón de células epiteliales de pulmón normales. Estos aptámeros muestran una alta afinidad hacia la línea de células H23 con aparente K
d '
s en el rango nanomolar, pero ninguna afinidad detectable por las células epiteliales de pulmón normales. Los aptámeros también mostraron unión en condiciones fisiológicas, así como después de la fijación química, lo que sugiere que pueden ser aplicables a
in vivo
experimentos. tratamiento de proteinasa indicó que todos los aptámeros en este bind panel de a las proteínas en la superficie de la célula diana. Todos estos resultados sugieren amplias aplicaciones potenciales de los aptámeros seleccionados debido a su especificidad para tejidos cancerosos pero no para las células sanas. Estos aptámeros también se pueden utilizar como sondas moleculares en muestras clínicas, tales como tumores recién extraídos y especímenes conservados histología.
Materiales y Métodos
Biblioteca de diseño em
Los cebadores se diseñaron para satisfacer las siguientes características: una estructura mínima de la horquilla, la temperatura de fusión similar (T
m) y el apareamiento de bases mínimas. Los cebadores y una biblioteca de 80-mer fueron diseñados utilizando el software Oligo IDT Analizador de 3,1 [32]. El cebador directo se marcó con isotiocianato de fluoresceína (FITC) en el extremo 5 ', y el cebador inverso se marcó con biotina en el extremo 5'. La biblioteca consistía en una región de 44-nt aleatorizado flanqueado en el extremo 5 'por el FITC etiquetado imprimación y flanqueado en el extremo 3' por la cadena no marcada complementaria del cebador inverso.
instrumentación y reactivos
las bibliotecas y los cebadores se sintetizaron utilizando el sintetizador de ADN 3400 (Applied Biosystems). Todos los reactivos para la síntesis de ADN se adquirieron de Glen Research. secuencias de ADN se purificaron por HPLC de fase inversa (Varian Prostar usando una columna C18 y acetato de acetonitrilo /trietilamonio como fase móvil). PCR se realizó en un termociclador Biorad, y todos los reactivos se adquirieron de Takara. La supervisión del proceso de selección, los ensayos de unión, y la determinación de las constantes de disociación para los aptámeros seleccionados se realizaron mediante análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro FACScan (BD Immunocytometry Systems).
Cultivo de células y Buffers
Un total de ocho líneas celulares establecidas se utilizaron en este proyecto, todos los adquirió de la American Tissue Culture Collection (ATCC). H23 (CRL-5800) adenocarcinoma CPNM fue elegida como la línea celular positiva, mientras que la línea celular negativa fue elegido HBE135-E6 /E7 (CRL-2741), células epiteliales bronquiales humanas normales. La línea de células H23 se mantuvo en medio RPMI-1640 (ATCC) de cultivo suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS inactivado por calor) y 1% de penicilina-estreptomicina. La línea celular de pulmón bronquial normal se mantiene en un medio de queratina libre de suero suplementado con 5 ng /ml de EGF humano recombinante, 0,05 mg /ml bovina extracto de pituitaria (Invitrogen), 0,005 mg /ml de insulina, y 500 ng /ml de hidrocortisona (Sigma -Aldrich). Las células fueron incubadas a 37 ° C en 5% de CO
2 atmósfera. Otras líneas celulares usadas para el ensayo de selectividad fueron el Caov3 y líneas celulares de cáncer de ovario TOV21G, adenocarcinoma de pulmón A549, carcinoma de células escamosas de pulmón H520, grande de carcinoma de pulmón de células H460, y de adenocarcinoma de colon DLD1, y todos se mantuvieron de acuerdo con las especificaciones de la ATCC. Durante la selección, se usaron dos tampones: Tampón de Lavado (BM) (glucosa 0,45% w /v y MgCl
2 5 mM en PBS) y tampón de unión (BB) (1 mg /ml de ARNt y 1 mg /ml de BSA en BM). Todos los reactivos anteriores se adquirieron de Sigma-Aldrich.
in vitro
Selección
Debido a que ambas líneas celulares utilizadas durante la selección, adenocarcinoma y células epiteliales bronquiales humanas normales, son adherentes líneas de células, la selección se realizó sobre monocapas de células. Acerca de 20 nmol de la biblioteca sintetizada se disolvió en 700 l de tampón de unión. Antes de que se inició el proceso, la piscina de ADN se desnaturalizó por calentamiento a 95 ° C durante cinco minutos, seguido por enfriamiento rápido en hielo. Esto obligó a las secuencias de ADN de adoptar las estructuras secundarias más favorables. A continuación, la biblioteca de ADN se incubó con aproximadamente 3 × 10
6 células diana (H23) a 4 ° C durante 30 minutos. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con tampón de lavado para eliminar las secuencias no unidos. Después, las secuencias unidas se recuperaron mediante calentamiento a 95 ° C durante 10 minutos y después de centrifugar a 14.000 rpm para eliminar los restos celulares.
Se recogió el sobrenadante que contiene las secuencias de ADN, y la piscina seleccionado se amplificó-PCR utilizando FITC y cebadores marcados con biotina. Entonces, la generación de ADN de cadena simple (ssDNA) se logró mediante la incubación con perlas de sefarosa recubiertas con estreptavidina, la obtención de la hebra biotinilada. selección de contador se llevó a cabo después de observar algunos de enriquecimiento con las células diana. Con el fin de seleccionar los aptámeros con una alta especificidad y selectividad, la rigurosidad de los lavados (número de lavados, el tiempo de lavado, y el volumen de tampón de lavado) se incrementó en las rondas posteriores. El enriquecimiento de las piscinas se controlará mediante citometría de flujo, secuenciado con 454 tecnología, y se analiza para candidatos aptámeros.
Análisis de citometría de flujo
La citometría de flujo se utilizó para controlar el enriquecimiento de secuencias con destino a ssDNA dentro de las piscinas durante el proceso de selección, así como para evaluar la afinidad de unión y la especificidad de los aptámeros seleccionados. Las células cultivadas se lavaron con WB antes y después de la incubación con el FITC piscina ssDNA o secuencias de ADN seleccionadas. La intensidad de fluorescencia se determinó en un citómetro FACScan (BD Immunocytometry).
454 Secuenciación y Análisis
Después de 18 rondas de selección, combinaciones enriquecidas 14, 16, y 18 fueron seleccionados para la secuenciación. cebadores específicos y 454-MID se amplificó por PCR y se añaden a cada secuencia contenida en cada grupo, dando un producto de 125 pb. Las reacciones fueron confirmados por electroforesis en gel, limpiar usando un kit de purificación de PCR (Qiagen), y se sometieron al núcleo ICBR de la Universidad de Florida para su análisis.
Alrededor de siete mil secuencias fueron recuperados y analizados. En primer lugar, las secuencias se agruparon sobre la base de su MID para determinar el grupo enriquecido correspondiente. En segundo lugar, los cebadores y MID se eliminaron mediante el programa de Perl con el fin de dejar sólo la parte aleatoria de la secuencia para el análisis de homología con el programa MAFFT 6.0.
Ensayos de unión
Diferentes familias de secuencias recuperadas a partir de secuencias múltiples análisis se sintetiza, marcado con biotina en el extremo 3 ', y se prueba para la unión con la línea celular positiva y negativa. Además, la selectividad de unión de cada candidato se determinó mediante la incubación de una solución aptámero 250 nM con 4 × 10
5 diana o células de contador durante 30 minutos a 4 ° C. Las células se lavaron dos veces con WB y se incubaron con perlas de estreptavidina PE durante 20 minutos a 4 ° C. Después del lavado, las células se suspendieron en 200 l WB. La fluorescencia se determinó con un FACScan citómetro contando 3 × 10
4 eventos. Una secuencia de 80-mer aleatorizado se utilizó como control.
Ensayos con células fijadas
Para determinar la capacidad de los aptámeros que se unen a células fijadas Encuadernación, se siguieron procedimientos similares a los descritos anteriormente , con la excepción del tratamiento inicial de las células. Brevemente, las células H23 adherentes se desprendieron de la placa por incubación con una solución de disociación celular no enzimática, y después se fijaron con solución de formalina al 10% durante 15 min a 4 ° C, se lavaron, y se suspendieron en tampón de unión.
selectividad y especificidad los ensayos
Para determinar la especificidad de estos aptámeros, diferentes líneas de células, incluyendo Caov3, DLD1, A549, H520, H460, y TOV21G, se utilizaron en ensayos de unión. La intensidad de fluorescencia se midió con el fin de confirmar la unión. Todos los experimentos siguieron la citometría de flujo procedimiento experimental descrito anteriormente.
Efecto de la temperatura sobre el aptámero de unión a
La selección se lleva a cabo a 4 ° C.To determinar si la temperatura afectaría a la unión entre aptámero y las células diana , ensayos de unión se llevaron a cabo a dos temperaturas adicionales, 25 ° C y 37 ° C.
Determinación de la constante de disociación
la afinidad del aptámero y su objetivo se evaluó por el ensayo de saturación. Una muestra que contiene 5 × 10
5 H23 células se lavaron y se incubaron con diferentes concentraciones de aptámero hasta que se consiguió la saturación. Todos los ensayos de unión se repitieron tres veces, y la intensidad de fluorescencia media se calculó restando la intensidad de fluorescencia de una secuencia codificada. Se recogieron los datos, y se obtuvo la constante de disociación (K
d) mediante ajuste a un modelo único sitio de unión de saturación usando SigmaPlot 11.2v (Jandel, San Rafael, CA).
proteasa digestión
tripsina y proteinasa K tratamiento.
H23 células se lavaron dos veces con PBS y después se incubaron con 3 ml de o bien 0,05% de tripsina /EDTA 0,53 mM en solución salina equilibrada de Hank (HBSS), Cellgro, o 0,1 mg /ml de proteinasa K en PBS a 37 ° C durante 3 minutos y 10. FBS se añadió para extinguir la actividad de la proteinasa. Las células se lavaron con BM y posteriormente utilizados para los ensayos de unión descritos anteriormente.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Caracterización de los aptámeros seleccionados. La citometría de flujo ensayo para la unión de los aptámeros ade1, ADE2, EJ2, EJ5 y EJ7 con H23 (línea de células diana) y HBE135 E6 /E7 (línea celular negativa). La curva verde representa la unión de una secuencia aleatoria (biblioteca) de fondo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s001 gratis (TIF)
figura S2.
aptámero de unión en condiciones fisiológicas. La citometría de flujo ensayo para la unión de aptámeros ade1, ADE2, EJ4, EJ5 y EJ7 con H23 (línea celular diana) a 25 ° C y 37 ° C. En esta serie de experimentos, la unión a 4 ° C se utilizó como control positivo. La curva verde representa la unión de una secuencia aleatoria (biblioteca) de fondo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
experimento de control para las células tratadas fijos. Ensayo de unión de Sgc8 aptámero con células CEM (A) (destino) y células (B) Ramos (control) antes (izquierda) y después de la fijación (derecha), lo que demuestra que no se produjo ninguna señal de fluorescencia artificial
doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s003 gratis (TIF)
figura S4.
Los ensayos de unión después de la fijación con formalina al 10%. ensayo de aptámeros de unión con H23 (objetivo) de las células pre-fijadas con formalina al 10%. columnas de la izquierda muestran la unión del aptámero ade1, ADE2, EJ2, EJ5 y EJ7 con las células no tratadas a 4 ° C. Columna derecha muestra la unión de los mismos aptámeros EJ5 con células fijadas. La curva de color verde claro representa la unión de una secuencia aleatoria (biblioteca) de fondo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s004 gratis (TIF)
Figura S5.
Ensayos de unión después del tratamiento de proteinasa. La citometría de flujo ensayo para aptámeros ade1 y ADE2, EJ5 y EJ7 después del tratamiento con proteasas; las células no tratadas se utilizaron como control positivo. (A) y las células (C) tratadas con tripsina durante 3 y 10 minutos antes de la unión con aptámeros ade1 y ADE2, EJ5, y EJ7 respectivamente. (C) y las células (D) tratados con proteinasa K para 3 y 10 minutos antes de la unión con aptámeros respectivamente
doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s005
(TIF)
Figura S6.
aparente Kd para aptámeros seleccionados. Saturación curvas para los aptámeros seleccionados ade1, ADE2, EJ2, EJ5 y EJ7 unión. Las células se incubaron con diferentes concentraciones de aptámero por triplicado. La intensidad de fluorescencia media de la biblioteca no seleccionada se restó de cada concentración de aptámero correspondiente
doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s006 gratis (TIF)
Reconocimientos
Agradecemos el Dr. Tahir Bayrac por los consejos útiles que contribuyeron a este trabajo, la doctora Kathryn Williams por su revisión crítica del manuscrito y el núcleo de la secuenciación del ADN, ICBR, de la Universidad de Florida, por su ayuda durante la secuencia 454.