Extracto
señalización /β-catenina Wnt aberrante ha sido fuertemente asociada con el proceso tumoral en el cáncer colorrectal humano. Los inhibidores de esta vía puede entonces ofrecer estrategias terapéuticas, así como la quimioprevención para esta enfermedad maligna. Henryin es una ent-kaurane diterpenoid aislado de
Isodon
rubescens
var.
lushanensis
, una planta de larga sido utilizado en la medicina popular para evitar la inflamación y la enfermedad gastrointestinal. En el presente estudio, mostramos que henryin selectivamente inhibe la proliferación de células de cáncer colorrectal humano con un IG
50 valor en el rango nano-molar. el análisis de microarrays y reportero ensayos mostraron que henryin trabajó como un nuevo antagonista de la vía de señalización de Wnt. Henryin redujo la expresión de ciclina D1 y C-myc, e inducida G1 detención en la fase /S en las células HCT116. Al mismo tiempo, henryin no afectó a la distribución citosol-nuclear de soluble β-catenina, pero deteriora la asociación de β-catenina /TCF4 transcripcional complejo probablemente a través de bloqueo directamente la unión de β-catenina a TCF4. También se analizó la relación estructura-actividad entre los diterpenos tipo ent-kaurane. Nuestros datos sugieren que henryin, como un nuevo inhibidor de la señalización de Wnt, podría ser un candidato potencial para una evaluación adicional preclínico para el tratamiento del cáncer de colon, y como tal, garantiza una mayor exploración
Visto:. Li X, Pu J, Jiang S, Su J, L Kong, Mao B, et al. (2013) Henryin, un ent-kaurane diterpenoid, inhibe la señalización de Wnt a través de la interferencia con la interacción β-catenina /TCF4 en células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (7): e68525. doi: 10.1371 /journal.pone.0068525
Editor: Chunming Liu, de la Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 4, 2013; Aceptado: 30-may de 2013; Publicado: 2 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada tanto por el Programa de Talentos 100 (YL) y la Fundación del oeste (JP) de la Academia china de Ciencias, el Programa de Desarrollo de la Investigación básica del Estado Mayor de china (Nº 2009CB522300), la Fundación de Ciencias Naturales de china (Nº 81173076, 81172939), y el reclutar talentos de Ciencias y Tecnología de la provincia de Yunnan (2009C1120), china. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una enfermedad común que, a pesar de los avances en el tratamiento de drogas y diagnóstico mejorado, sigue siendo un reto importante para la comunidad médica mundial. Aunque la patogénesis exacta de la enfermedad no se entiende claramente, la enfermedad de inflamación intestinal crónica se considera un factor de riesgo que contribuye al desarrollo y la metástasis de cáncer colorrectal [1]. Numerosos estudios han, sin embargo, sugerido que la activación aberrante de la vía de señalización Wnt /β-catenina canónica juegan un papel importante en la tumorigénesis. En ausencia de ligandos Wnt, β-catenina es fosforilada por un complejo que incluye la poliposis adenomatosa coli (APC) /DSH /Axin /GSK3, que luego se ubiquitinated y degrada a través de la vía del proteasoma. Cuando la vía se activa por la unión de ligandos Wnt a su complejo receptor de membrana, la destrucción β-catenina complejo se disocia y β-catenina se estabiliza y entra en el núcleo para activar la expresión del gen diana en conjunto con los factores de transcripción TCF [2,3 ].
En las células de cáncer de colon, la vía /β-catenina vía frecuencia se activa de forma aberrante [4-6]. De acuerdo con informes recientes de la Red Atlas del Genoma del Cáncer, la vía Wnt es constitutivamente activado en más de 90% de cáncer colorrectal humano por ambas alteraciones genéticas y epigenéticas a una serie de genes que están implicados en la vía de señalización Wnt, tales como β-catenina , APC y AXIN2 [7]. La activación de la señalización /β-catenina Wnt posteriormente aumenta la expresión de genes Wnt objetivo, tales como la ciclina D1 [8], C-myc [9] y survivina [10], todos los cuales están involucrados en la proliferación celular, la apoptosis y el ciclo celular desregulación en el desarrollo y progresión de fenotipos malignos de cáncer colorrectal [11-13].
hasta la fecha, los avances en el tratamiento y diagnóstico del cáncer colorrectal todavía están limitados en su eficacia, nos impulsa a considerar opciones alternativas en movimiento adelante. En la medicina popular, algunos
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especies, plantas de amplia distribución, se utilizan como bebida de té para prevenir la inflamación, infecciones bacterianas gastrointestinales e incluso tumores. La hipótesis de que las sustancias químicas presentes en una muestra de
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especies que probablemente poseían propiedades quimiopreventivos así como los efectos quimioterapéuticos contra el cáncer. En nuestro trabajo anterior, muchos componentes químicos se aislaron y caracterizaron de
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especies, pero el estudio de su perfil bioactivo es muy limitada y se carece de mecanismos [14-16].
Nuestro presente estudio se centra en la detección de los compuestos que confieren efectos anti-tumorales, especialmente en las células de cáncer colorrectal humano. Se encontró que henryin, un diterpenoid ent-kaurane, aislado de
Isodon
rubescens
var.
lushanensis
, mostraron efectos inhibidores del crecimiento selectivos sobre las células del cáncer colorrectal humano mediante la inhibición de la señalización de Wnt. Nuestros datos muestran que henryin interfiere con la β-catenina /TCF interacción compleja e induce la detención S G1 /fase en células de cáncer colorrectal. En consecuencia, henryin, como nuevo inhibidor de la vía /β-catenina vía, podría hacer que un candidato a fármaco prometedor tanto para la prevención del cáncer colorrectal, así como un agente terapéutico novedoso.
Materiales y Métodos
Reactivos
RPMI 1640, medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), suero bovino fetal (FBS), solución de antibióticos, y la tripsina-EDTA se adquirieron de HyClone (Logan, UT, EE.UU.). El cóctel completo de inhibidor de proteasa fue adquirido de Roche Applied Science (Indianapolis, IN, EE.UU.). monoclonal de ratón anti-CyclinD1 y anticuerpos anti-β-catenina se compraron de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.). monoclonal de conejo anti-TCF4 y el anticuerpo anti-fosfo-β-catenina policlonal se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.). Conejo monoclonal anti-p21 fue adquirido de Epitomics, Inc (Burlingame, CA, EE.UU.). Ratón monoclonal anti-lamin A /C, anti-β-actina, los anticuerpos anti-c-myc y otros reactivos, a menos que se indique lo contrario, se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). proteínas recombinantes humanos purificados β-catenina se adquirió de inc biológica chino. proteínas recombinantes humanos purificados TCF4 se adquirió de OriGene. sistema de ensayo de gen informador de luciferasa Dual-se adquirió de Promega (Madison, WI, EE.UU.). Lipofectamine 2000 fue adquirido de Invitrogen (Camarillo, CA, EE.UU.). El kit QuantiTect SYBR, Green PCR se obtuvo de Qiagen (Alemania).
Los compuestos
Henryin y sus análogos se extrajeron de
Isodon
rubescens var
.
lushanensis
, tal como se describe anteriormente [14-16]. Los compuestos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO).
Las líneas celulares
líneas celulares de cáncer de colon (SW480, HT-29 y HCT116), pulmón A549 línea celular de cáncer humano, humano epitelial pulmonar normal línea celular (BEAS-2B) y HEK293T fueron adquiridos de ATCC. La línea normal de las células epiteliales del colon (CCD-841-CON) [17] fue amablemente dotado por el Dr. Lin, Li, del Instituto de Bioquímica y Biología Celular, Academia de Ciencias de China (Shanghai, China). Las células se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Todo el medio se suplementó con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibióticos antimicóticos (100 unidades /ml de penicilina G sódica, 100 mg /ml de estreptomicina) (Gibco, Invitrogen, EE.UU.).
MTS ensayo y GI
50 determinación
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 x 10
3cells /pocillo y se incubaron durante 12 h en un CO
2 incubadora. Las células se trataron con la dosis que van desde 0,008 a 4 micras de henryin y sus análogos, con cisplatino como control positivo durante 48 h. Después, se añadieron 20 l de CellTiter 96® acuosa un reactivo Solution (Promega, Madison, EE.UU.) y las células se incubaron adicionalmente a 37
° C durante 1-2h. a continuación, la viabilidad celular se midió mediante la lectura de la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm. Se utilizó la siguiente fórmula para determinar valores de la relación de crecimiento de células: 100 * (A490 (muestra, T) - A490 (muestra, T0)) /(A490 (control, T) - A490 (control, T0)). El IG
50 valores-las concentraciones que causan el 50% de inhibición del crecimiento celular-se determinó mediante análisis de regresión no lineal utilizando el software TableCurve.
Microarray y análisis de datos
Se incubaron células SW480 con 4 micras de henryin o sulfóxido de dimetilo (DMSO) como control durante 12 h. Las células se lisaron con TRIzol (Invitrogen, EE.UU.) y ARN totales se aislaron con el Kit de QIAGEN RNeasy Mini (QIAGEN, Alemania) antes de la transcripción inversa, el etiquetado y la hibridación con Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray (4 × 44K) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). El ensayo de microarrays se llevó a cabo por Shanghai Bio Corporation. Después de GO anotación y análisis de la vía, se seleccionaron los genes con más de 2 veces en la alteración del nivel de expresión para su posterior análisis.
transfección celular y ensayos de reportero de luciferasa
Para los ensayos de gen reportero, se sembraron las células en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C en 5% CO incubadora
2 durante 12 h. células SW480 y HCT116 se co-transfectaron con 100 ng de los plásmidos en total, incluyendo 80ng de una vía bien caracterizado Wnt /β-catenina de respuesta de luciferasa de luciérnaga plásmido reportero SuperTOPflash (ST-Luc) y 20 ng de pRL SV40-(Promega) reportero de control plásmido utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Cada pocillo de células HEK293T se transfectaron con 200 ng de los plásmidos en total, incluyendo 80ng de ST-Luc y 20 ng de PRL-SV40 y 10 ng de β-catenina o 64ng de Wnt1 y plásmidos vector vacío como se indica. Algunos 3h después de la transfección, las células se incubaron con diversas concentraciones de compuestos durante 24 h. Las células se lisaron con 50 l de tampón de lisis Promega en cada actividad bien y luciferasa se midió y normalizado por la actividad del indicador PRL-SV40. Todos los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado. Los resultados se presentan como medias y desviaciones estándar (DE).
transcripción inversa y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN total fue extraído a partir de células cultivadas con TRIzol y la transcripción inversa se realizó utilizando el superíndice III Reverse Transcription Kit (Invitrogen) con oligo de cebado (dT) según las instrucciones del fabricante. transcripciones de genes se cuantificaron por PCR en tiempo real utilizando SYBR Green I y β-actina se utilizó como control. Los números primos utilizados fueron:
CyclinD1 humano cebador directo: 5'-AAGTGCGAGGAGGAGGTCTT-3 'y el cebador inverso: 5'-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGA-3'
c-myc humano cebador directo: 5. '-CTTCTCTCCGTCCTCGGATTCT-3' y el cebador inverso: '.
β-actina humana cebador directo: 5'-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3' 5 'GAAGGTGATCCAGACTCTGACCTT-3 y el cebador inverso: 5'-3-GATAGCACAGCCTGGATAGCAAC '.
RT-PCR experimentos se realizaron por triplicado y la eficiencia de PCR con cebadores que se dio fue entre el 95 y el 100%. Las curvas de fusión se realizaron también para el seguimiento de las amplificaciones de cebadores específicos.
El citosol y fraccionamiento núcleo y las células SW480 análisis de Western Blot
fueron tratados con el henryin en placas de 6 pocillos. lisados nucleares y citosólicas fraccionadas se obtuvieron utilizando tampón de extracción nuclear y tampón de lisis hipotónica, respectivamente. Todos los tampones de extracción de proteínas se complementaron con cóctel inhibidor de proteasa completo y cóctel inhibidor de fosfatasa (Roche). La concentración de proteínas de cada lisado crudo se determinó usando el kit de ensayo de proteína BCA (Enhanced Beyotime, Shanghai, China). Las cantidades normalizadas de las muestras de lisado se cargaron en SDS-PAGE y se transfirieron a la difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). La inmunotransferencia se realizó usando anticuerpos de detección fosfo-β-catenina (Ser33 /37 /Thr41), β-catenina, AXIN2, CyclinD1, C-myc, survivina, P21, TCF4, con Lamin A /C y β-actina utilizados como controles de carga . HRP conjugado anti-IgG de ratón y anti-IgG de conejo se utilizaron como anticuerpos secundarios. SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Thermo Scientific) se utilizó para detectar quimioluminiscencia, y borrones fueron imágenes utilizando el analizador de imágenes luminiscentes Sistema LAS-4000mini (GE, EE.UU.).
Co-inmunoprecipitación análisis
células SW480 se cultivaron en placas de 6 pocillos, se trató con henryin y sus análogos enmenol y minheryin C durante 12 h, se lisaron en tampón de lisis de proteína (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM de EDTA e inhibidores de proteinasas) y se centrifugó a 14.000 × g durante 15 min a 4 ° C. El sobrenadante se incubó con un anticuerpo primario específico durante la noche a 4 ° C y después se incubó con A /G PLUS agarosa (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) durante al menos 2 h. Las perlas se lavaron a continuación cinco veces y se resuspendieron en tampón de SDS de carga 50 l. Western blot se realizó en las muestras.
in vitro
ensayo de unión
Para ensayar el efecto de los compuestos en la inhibición de β-catenina /unión TCF4, proteínas recombinantes purificadas beta -catenina (0.8μg) y TCF4 (0.5μg) se incubaron con henryin y sus análogos enmenol y minheryin C a las concentraciones indicadas a 4 ° C durante 2 h, respectivamente. β-catenina complejos /TCF4 fueron derribadas utilizando /G PLUS perlas de agarosa con proteína A saturadas con anticuerpo β-catenina. a continuación, la detección se realizó utilizando anticuerpos TCF4 en el análisis de Western Blot.
Análisis del ciclo celular
HCT116 células (5 × 10
5cells /pocillo en placas de 12 pocillos) se incubaron con henryin de 0h, 12h y 24h, respectivamente. Se recogieron todas las células adherentes y se lavaron dos veces con PBS. Las células fueron fijadas con 70% durante la noche etanol. Las células fijadas se lavaron con PBS, y luego se tiñeron con un 50? g /ml de yoduro de propidio solución (PI) que contiene 50? g /ml de RNasa A durante 30 minutos a temperatura ambiente. La intensidad de fluorescencia se analizó mediante flujo FACSCalibur1 citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Los porcentajes de las células distribuidas en diferentes fases del ciclo celular se determinaron utilizando ModFit LT 2.0.
Estadísticas
Los datos se presentan como la media ± desviación estándar para los números indicados de experimentos llevados a cabo de forma independiente. El análisis de regresión no lineal para el cálculo de GI
50 o IC
50 valores fue realizada por TableCurve. La significación estadística se analizó por el estudiante de
t-test
o ANOVA de una vía en SigmaStat 3.1. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando P & lt; 0.05.
Resultados
Henryin inhibe selectivamente el crecimiento de células de cáncer colorrectal y induce la detención fase G1 del ciclo celular
Los efectos de inhibición del crecimiento de henryin sobre las células cancerosas humanas fueron evaluado principalmente con los ensayos de MTS. Como se muestra en la Figura 1B, henryin exhibió un crecimiento más fuerte efectos inhibidores sobre las células de cáncer de colon (SW480, HT-29 y HCT116) que cualquier otro tipo de canceroso (cáncer de pulmón línea celular A549) o células normales (colon epitelial CCD línea celular humana normal -841-con y línea de células epiteliales de pulmón normal de BEAS-2B). Como control, cisplatino tenía efectos inhibidores similares entre todos los diferentes líneas celulares estudiadas (Figura 1C). Análisis de la GI
50 valores de henryin y cisplatino en las diferentes líneas celulares también apoya la observación de que henryin tenía un efecto inhibidor selectivo sobre las células de cáncer de colon (Figura 1D). Los efectos inhibidores del crecimiento de células SW480 en henryin mostraron una manera dependiente de la dosis el tiempo (datos no presentados). Análisis del ciclo celular mostró que las células fueron detenidas en la fase G1 en las células HCT116 tratados con henryin de una manera dependiente del tiempo (Figura 1E). Estos resultados en conjunto sugieren que henryin exhibieron una inhibición del crecimiento selectivo en células de cáncer colorrectal.
(A) se muestran las estructuras de henryin y ent-kaurane. (B) La inhibición del crecimiento de henryin en varias líneas celulares, incluyendo líneas de cáncer colorrectal celulares (SW480, HCT116 y HT29), la línea normal de las células epiteliales del colon CCD-CON-841, el cáncer de pulmón línea celular A549, y la línea de células epiteliales de pulmón normal Beas- 2B, determinado mediante ensayos de MTS con cisplatino utilizados como control (C). Las células se trataron con henryin hasta 72 horas a varias concentraciones. La absorbancia se midió a 490 nm. Todo el muestreo se realizó por triplicado y los datos se presentan como media ± desviación estándar. (D) La concentración de inhibición del crecimiento de la mediana (GI
50, 72h) los valores de henryin y cisplatino para diversas líneas celulares. (E) Histogramas representativos que muestran la distribución del ciclo celular tal como se analizó mediante citometría de flujo en células HCT116 tratados con 4 micras de henryin de 0h, 12h y 24 h, respectivamente. Los recuentos de células en fase G1 se incrementaron notablemente en las células tratadas de una manera dependiente del tiempo.
Henryin interfiere con la señalización de Wnt en las células CRC
Con el fin de investigar los mecanismos subyacentes a través del cual henryin inhibe el crecimiento de células de cáncer colorrectal, se realizó un análisis de microarrays y alteraciones de la expresión génica se analizaron en las células SW480 tratadas henryin. Los genes fueron filtradas mediante el establecimiento de criterios de alteración pliegue & gt; 2 (hasta reguladas) o & lt; 0,5 (el regulado) como los genes expresados diferencialmente. Ambos van anotación y vía de análisis mostraron que henryin afecta fuertemente la ruta de señalización Wnt, así como otras vías alterados que están asociados con los procesos biológicos cáncer colorrectal en las bases de datos KEGG y BioCarta (Figura 2A-B).
( A) (B) ensayo de Microarray y análisis de datos de expresión génica diferencial en tratamiento henryin. células SW480 se trataron durante 12 h con 4 micras de henryin con 0,5% de DMSO como control en el ensayo. Se emplearon anotación y vía GO análisis de las bases de datos y BioCarta KEGG, respectivamente. Los genes con alteración pliegue de al menos & gt; 2 (hasta reguladas) o & lt; 0,5 (el regulado) se tomaron como los genes expresados diferencialmente. Análisis de datos y las estadísticas se generaron sólo cuando los golpes & gt; 5 en cada vía de señalización. se muestran las vías representativos obtenidos tras el análisis de datos de microarrays. (C) Henryin inhibe la expresión reportero Wnt de una manera dependiente de la dosis en las células HEK293T transfectadas Wnt1, y en células de cáncer colorrectal, SW480 y HCT116. Tres horas después de la transfección de la Wnt1 y /o ST-Luc, DMSO o henryin con dosis indicada se añadió a las células durante 24 h adicionales y la actividad luciferasa se midió a continuación. (D) Henryin (4 micras) inhibe preferentemente la señalización Wnt (ST-Luc) sobre la vía de señalización NF-kB (NF-kB-Luc) en células HEK293T. la señalización de Wnt se vio estimulado por la transfección de Wnt1 y la señalización NF-kB se estimuló con 25 ng /ml TNFa. Cada barra es la media ± SD de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, en relación con el control del vehículo. NS: no significativo.
Tras el análisis de microarrays, se comprobó el efecto de henryin en la señalización de Wnt /β-catenina usando el ensayo indicador TOPflash. En las células HEK293T transfectadas Wnt1, henryin inhibió la expresión del indicador de señalización Wnt de una manera dependiente de la dosis después de 24 horas de tratamiento (Figura 2C). la señalización de Wnt se activa constitutivamente en las células SW480 y HCT116 debido a APC de truncamiento y la mutación β-catenina, respectivamente. En ambas líneas celulares, la señalización de Wnt también se inhibió por dosis-dependiente henryin (Figura 2C). Al mismo tiempo, henryin no mostró ningún efecto evidente sobre la actividad de NF-kB de señalización informador de luciferasa sensible (NF-kappa B-Luc) (Figura 2D). Estos datos sugieren que henryin específicamente inhibe la señalización de Wnt /β-catenina.
Para caracterizar la relación estructura-actividad de henryin, se investigó la actividad de los análogos henryin adicionales (Figura 3A) y se examinaron sus efectos sobre la señalización Wnt con ST-Luc reportero de ensayo. Dos de los compuestos, phyllostachysin F y oridonin, que poseen un grupo cetona en C-15 y 14β-OH, similar a henryin, también mostraron efectos inhibidores distintos en la actividad ST-Luc. Mientras tanto, los análogos de henryin enmenol, minheryin y eriocalyxin B, que carecen del grupo cetona en C-15 o 14β-OH, no mostró ningún efecto sobre la actividad de reportero Wnt (Figura 3B-C). Posteriormente, se examinaron también los efectos de inhibición del crecimiento de enmenol, minheryin y eriocalyxin B. Enmenol y minheryin C, en consonancia con sus actividades no inhibitorios sobre la señalización de Wnt, exhibió ningún efecto inhibidor del crecimiento de las células del cáncer colorrectal (Figura 3D). En particular, eriocalyxin B mostró una fuerte citotoxicidad contra las células de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células e incluso las líneas de células normales (Figura 3D). Este amplio espectro de citotoxicidad eriocalyxin B podría ser debido a su actividad inhibidora sobre la vía de NF-kappa B, como informaron inhibidor NF-kappa B [18]. Estos datos sugieren que el grupo cetona en C-15 y 14β-OH son responsables de un efecto inhibidor de henryin en la señalización de Wnt.
(A) Estructuras de henryin y sus análogos. (B) Efectos de henryin análogos sobre la actividad Topflash en células HEK293T. Las células fueron transfectadas con Wnt1 y ST-Luc durante 3 h y después se incubaron con henryin y sus análogos de diferentes dosis para 24 horas y las actividades de luciferasa se midieron después. Se muestran los valores (C) La inhibición del crecimiento medio (GI
50, 72h) y la inhibición ST-Luc (IC
50, 24) de henryin y sus análogos en las células SW480. (D) Efectos de henryin análogos en el crecimiento de diversas líneas celulares (48hours). Los datos mostrados son la media ± SD de tres experimentos independientes.
Henryin inhibe la expresión del gen diana endógeno Wnt
Se verificó la expresión de los genes diana de Wnt endógeno en nuestros datos de microarrays y encontramos que la expresión de los genes Wnt objetivo, incluyendo AXIN2, ciclina D1, SP5, DKK1, NOS1, PPAR y FGF20, fueron significativamente las reguladas después del tratamiento con henryin (Figura 4A). Para confirmar los efectos inhibidores de henryin sobre la expresión de los genes Wnt objetivo de señalización, se trataron las células HEK293T y SW480 transfectadas con Wnt1 henryin durante 12 horas y se controló la expresión de c-myc y ciclina D1 por RT-PCR. Los resultados mostraron que henryin reduce su expresión de una manera dependiente de la dosis (Figura 4B-C). También empleamos análisis de Western blot para detectar la expresión de la proteína de la ciclina D1, survivina, AXIN2 y C-myc en HEK293T, células SW480 y células HCT116 tratados con henryin. En consonancia con los resultados anteriores, el nivel de proteína de AXIN2, ciclina D1, C-myc y survivina se redujeron en henryin dentro de 24 horas de tratamiento (Figura 4D-F).
(A) Henryin regula a la baja la expresión de los genes diana de Wnt en ensayo de microarrays. (B-C) Henryin inhibe la ciclina D1 y expresión de c-myc en Wnt1 células transfectadas HEK293T y células SW480. Las células se trataron con las dosis indicadas de henryin de 12 horas. Los niveles de ciclina D1 y mRNAs C-myc se determinaron mediante PCR en tiempo real y se normalizó para beta-actina. (D) Los efectos de henryin sobre la expresión de las proteínas AXIN2, cyclinD1 y Survivin en las células HEK293T transfectadas Wnt1. Las células fueron transfectadas con Wnt1 3 horas antes del tratamiento henryin. (E) Los efectos de henryin sobre la expresión de las proteínas AXIN2, cyclinD1 y Survivin en las células SW480. (F) Los efectos de henryin sobre la expresión de CyclinD1, survivina, C-myc y proteínas p21 en células HCT116. Las células fueron tratadas con henryin de 6, 12, extractos 24h y de células se ensayaron con el Western Blot de las proteínas indicadas. β-actina se utilizó como control de carga. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0.01, en relación con el control del vehículo
Henryin interfiere con la asociación de β-catenina /TCF complejo
Un sello distintivo de la activación de la señalización de Wnt es la estabilización y acumulación nuclear de β-catenina en células de cáncer colorrectal. Se verificaron el efecto de henryin en el nivel y distribución de β-catenina en las células SW480. SW480 células fueron tratadas durante 24 horas con henryin a diversas concentraciones y β-catenina total y forma fosforilada de la β-catenina fueron examinados (Figura 5A). Mientras tanto, el β-catenina nuclear y citoplásmica también se examinó utilizando análisis de transferencia Western. Los resultados revelaron que henryin tratamiento afecta ni el nivel de la forma total y fosforilada de β-catenina, ni la distribución de β-catenina en los compartimientos nucleares y citoplasmáticos (Figura 5B), lo que sugiere que henryin se dirige a la vía Wnt aguas abajo de β-catenina . De acuerdo con el resultado anterior, la actividad de ST-Luc en las células HEK293T con β-catenina sobreexpresa se redujo significativamente por henryin, así como la forma estabilizada de β-catenina debido a la mutación S37A (Figura 5C). LiCl es un inhibidor de GSK-3β que bloquea la fosforilación y posterior degradación de β-catenina, lo que resulta en la estabilización de β-catenina [19]. Como era de esperar, henryin antagoniza la activación inducida por LiCl de la canónica de Wnt de señalización, así (Figura 5C). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que henryin no afecta a la estabilización de β-catenina o su translocación nuclear, sino que se dirige a la señalización Wnt aguas abajo de la misma.
(A) Henryin no afecta a la cantidad de β total de catenina y pho-β-catenina en las células SW480. (B) Henryin no afecta a la distribución de β-catenina en fracciones de citosol y el núcleo en las células SW480. células SW480 se trataron con las dosis indicadas de henryin durante 24 h. Los extractos de células o fracciones se prepararon y analizaron mediante transferencia de Western. Lamin A /C y β-actina se utilizaron como controles de carga de núcleos y citoplasma proteínas, respectivamente. (C) Henryin antagoniza la señalización de Wnt se estimularon con LiCl o β-catenina. células HEK293T fueron transfectadas transitoriamente con plásmidos constitutivamente activa β-catenina (S37A) ST-Luc y β-catenina o, respectivamente, o se trata con LiCl (20 mM). Alrededor de 3 horas después de la transfección o el tratamiento, se añadió henryin y se incubaron las células durante 24 horas más. Cada barra es la media ± SD de tres experimentos independientes. (D) Henryin, pero no enmenol y minheryin C, redujo los niveles TCF4 asociados con β-catenina en las células SW480 de una manera dependiente de la dosis. Las células se trataron con las dosis indicadas de henryin y sus análogos enmenol y minheryin C durante 12 h y inmune-precipitación se llevó a cabo por el anticuerpo β-catenina con IgG de ratón como control, y luego TCF4 se detectó por Western Blot. (E) Henryin interrumpe directamente la interacción de β-catenina con TCF4 en el ensayo de unión in vitro. β-catenina humana recombinante (0.8μg) y TCF4 (0.5μg) se mezclaron, se incubaron con diferentes concentraciones de henryin y sus análogos enmenol y minheryin C, y la mezcla se sometió a co-inmunoprecipitación con anticuerpo β-catenina y el análisis Western Blot con anticuerpo TCF4, con IgG de ratón utilizado como control. (F) La cuantificación de las transferencias de Western se muestran en D y E. El software ImageJ se utilizó para analizar las intensidades de las bandas. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos. Gallina, henryin, con baño propio, enmenol, Min, minheryin C.
En el núcleo, β-catenina tiene que fijar factores de transcripción de la familia TCF para regular la expresión del gen diana. Hemos comprobado si henryin perjudica la interacción /TCF β-catenina. células SW480 tratadas con henryin eran inmunes precipitado por el anticuerpo β-catenina o IgG de ratón como control, y TCF4 se detectó mediante transferencia Western y las transferencias se analizaron con ImageJ para intensidades de las bandas. Los resultados mostraron que henryin fuertemente inhibida la unión de TCF4 a ß-catenina de una manera dependiente de la dosis en las células SW480, pero no sus análogos enmenol y minheryin C (Figura 5D, 5F), que es compatible con las actividades inhibidoras de la señalización de Wnt y el crecimiento de las células cancerosas de los compuestos.
con el fin de determinar si henryin puede alterar directamente la interacción de β-catenina con TCF4, in vitro ensayos de unión se realizaron con purifica β-catenina recombinante y proteínas TCF4. El resultado mostró que henryin fuertemente inhibida la catenina ß unión de TCF4 en los ensayos de unión in vitro, mientras que sus análogos enmenol y minheryin C no mostró ningún efecto como se esperaba (Figura 5E, 5F).
Discusión
Orientación de señalización Wnt puede representar una estrategia prometedora para erradicar la enfermedad maligna con la activación anormal de esta vía. En consecuencia, la identificación de nuevos inhibidores de la vía de señalización /β-catenina vía son de gran importancia y significación. Esta inhibición puede conseguirse mediante la interrupción de la interacción de /TCF [20] o de la proteína β-catenina CREB vinculante (CBP) [21]. La estabilización de AXIN2 [22,23] y la activación de CK1α también se tomaron como mecanismos eficaces para inhibir la señalización de Wnt para terapias dirigidas contra el cáncer de colon [24]. En la investigación anterior, varios compuestos se ha encontrado que poseen la capacidad de interrumpir β-catenina asociación /TCF directamente, como PKF115-854 y CGP049090, y similares.
En los últimos años, ha habido un interés significativo en la búsqueda de Wnt /β-catenina señalización antagonistas de productos naturales [25]. De hecho, se han identificado muchos tipos de estructuras de productos naturales que inhiben la señalización de Wnt /β-catenina, incluyendo el Murrayafoline A [26], Tetrandrine alcaloide [27], la curcumina [28], EGCG [29,30], fl flavonoides [31, 32], Magnolol [33] y otros [34,35]. Recientemente, el resveratrol se informó como capaz de inhibir la señalización Wnt aguas abajo de β-catenina, contribuyendo de este modo a la represión de la tumorigénesis del cáncer de colon [36].
Henryin, un diterpenoid ent-kaurane, aislado de
Isodon
rubescens
var.
lushanensis
preferentemente induce células de cáncer colorrectal muerte dejando a las células normales del colon CCD-CON-841 y del epitelio pulmonar normal BEAS-2B menos afectado (Figura 1 B, C). Se identificaron las vías de señalización afectadas por henryin en células de cáncer de colon en un ensayo de microarray, entre las que se encontró la vía de señalización Wnt ser la fuertemente alterado uno. Consistente con los datos de microarrays, en ambos Wnt1 células transfectadas HEK293T y células de cáncer colorrectal, henryin inhibió la actividad de reportero Wnt-sensible de una manera dependiente de la dosis (Figura 2C). Henryin disminuyó la expresión de los genes diana de Wnt endógeno (Figura 4A-F) e interfirió con la asociación de β-catenina /TCF transcripción complejo probable directamente bloqueando la unión d e la β-catenina de TCF 4 (Figura 5D, 5E, 5F). En conjunto, estos datos sugieren que la actividad anti-proliferación de henryin en células de cáncer colorrectal se asoció con la inhibición de la señalización de Wnt.