Extracto
mebutate Ingenol está aprobado para el tratamiento tópico de la queratosis actínica y en última instancia puede también encontrar utilidad en el tratamiento de cánceres de piel. Aquí nos muestran que las tasas de recaída de tumores de melanoma B16 subcutánea tratados tópicamente con mebutate ingenol no fueron significativamente diferentes en ratones C57BL /6 y Rag1
- /- ratones, lo que sugiere B y células T no juegan un papel importante en la lucha contra el cáncer eficacia de mebutate ingenol. Las tasas de recaída fueron, sin embargo, aumentaron significativamente en MyD88
- /- ratones y en ratones C57BL /6 ratones tratados con el anticuerpo anti-IL-1 agente, anakinra. tratamiento Ingenol mebutate induce una infiltración pronunciada de neutrófilos, que han demostrado que tienen actividad contra el cáncer en ratones. Aquí nos proporcionan la prueba de que la IL-1 promueve el reclutamiento de neutrófilos al tumor, disminuye la apoptosis de los neutrófilos infiltrantes y aumenta la actividad de destrucción de tumores de neutrófilos. Estos estudios sugieren IL-1, a través de su acción sobre neutrófilos, promueve la eficacia anti-cáncer de mebutate ingenol, con tratamiento ingenol mebutate causando tanto la inducción de IL-1β y IL-1α liberado de queratinocitos
Visto:. Le TT, Skak K, Schroder K, Schroder WA, Boyle GM, Pierce CJ, et al. (2016) IL-1 contribuye a la eficacia anti-cáncer de Ingenol mebutate. PLoS ONE 11 (4): e0153975. doi: 10.1371 /journal.pone.0153975
Editor: Irina Lebedeva V., Universidad de Columbia, Estados Unidos |
Recibido: 7 Octubre 2015; Aceptado: 6 Abril de 2016; Publicado: 21 Abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Le et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. la investigación se llevó a cabo principalmente en QIMR Berghofer Instituto de investigación médica y fue financiado en gran parte por Leo Pharma, y en parte por una subvención de la Australian National Health & amp ; Consejo de Investigación Médica (APP1043104). Leo proporcionó apoyo en forma de salarios para los TTL y consumibles, participó en el diseño del estudio inicial, pero no participó en la recopilación y análisis de datos. Leo estuvo involucrado en la decisión de publicar, pero proporciona una entrada mínima en la redacción del manuscrito. K. Schroder es apoyada por un Consejo de Investigación Australiano futuro Fellowship (FT130100361), y el Fondo inteligentes Futuros Queensland. AS es un Investigador Principal con el National Health & amp; Consejo de Investigación Médica, Australia (APP1058391)
Conflicto de intereses:. K. Skak es un empleado de Leo Pharma. Como era un consultor pagado por Leo Pharma en 2011. Como es un inventor en una serie de patentes que cubren mebutate ingenol (Picato), pero no recibe regalías o beneficios financieros (u otros) como resultado. Estas afiliaciones comerciales no alteran la adherencia de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
mebutate Ingenol (Picato
®) es un medicamento tópico aprobado para el tratamiento de campo de la queratosis actínica (AKS) [1,2,3]. QA son lesiones que normalmente se encuentran en la piel expuesta al sol causada por la exposición UV y se caracterizan por la proliferación de los queratinocitos atípicamente [4]. En aproximadamente el 8% de los casos, las QA puede progresar a carcinoma invasivo de células escamosas (SCC) [5], la segunda forma más común de cáncer de piel. La eliminación de las QA y queratinocitos mutados por tratamiento mebutate ingenol por lo tanto busca reducir el riesgo subsiguiente de los CE en desarrollo [1,6,7,8]. mebutate Ingenol última instancia, puede también encontrar utilidad en el tratamiento de otros cánceres de piel [9,10], con eficacia demostrada en estudios en humanos para los CE y carcinomas de células basales [11,12,13]. mebutate Ingenol se deriva de la savia de
Euphorbia peplo Opiniones y activa la proteína quinasa C (PKC) [14,15].
In vivo
aplicación tópica del fármaco induce necrosis primaria de (i) queratinocitos, incluyendo manchas de queratinocitos que llevan mutaciones de p53 y (ii) células de tumores subcutáneos en crecimiento por debajo del sitio de tratamiento [16,17]. El tratamiento tópico en humanos [7,18,19] y ratones [16] da como resultado un eritema transitorio rápido inicio y una pronunciada reclutamiento de neutrófilos [17,20,21]. Los neutrófilos reclutados y estimulados por mebutate ingenol también parecen mediar la actividad anti-cáncer mediante la reducción significativamente las tasas de recaída tumoral en modelos tumorales de ratón, incluyendo el modelo de melanoma B16 [21].
Para investigar el papel de la adaptativa e innata la respuesta inmune a la eficacia contra el cáncer de mebutate ingenol, se investigaron las tasas de recaída después del tratamiento tópico de los tumores subcutáneos B16 con mebutate ingenol en una serie de ratones modificados genéticamente. Aunque las respuestas de células T y B no parecen desempeñar un papel importante, aportar pruebas de que la IL-1 juega un papel significativo en la eficacia contra el cáncer de mebutate ingenol.
Materiales y Métodos
ética Animal comunicado
Todo el trabajo del ratón se llevó a cabo de conformidad con las buenas prácticas animal definidos por el Consejo de Investigación médica de Australia Nacional de Salud e. El trabajo del ratón fue aprobado por el comité de ética animal QIMR Berghofer Instituto de Investigación Médica. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron 100 mm
2, un tamaño del tumor que no causa angustia excesiva a los animales.
ratones, la inoculación del tumor y el tratamiento mebutate ingenol
ratones hembra, 8 se inyectaron a 12 semanas de edad con células de melanoma B16 (4-5x10
5 células /ratón en 50 l de medio) por sc poco profunda inyección. Se obtuvieron células B16 de la ATCC (CRL-6322) a pases no más de 10 veces y se muestra para ser Mycoplasma negativo por MycoAlert
™ Kit Mycoplasma detección (Lonza, Basilea, Suiza) y Hoechst tinción [22]. Cuando el tamaño medio de tumor alcanzó 10 a 20 mm
2 (2-4 días después de la inyección) los ratones fueron elegidos de modo que cada grupo tenía un tamaño del tumor y el tamaño del tumor distribución media similar; Los ratones con tamaños de los tumores que no podían ser igualados apropiadamente se eliminaron. Los sitios de tumor se trataron entonces por vía tópica una vez con 10 l placebo o 0,1% de gel de ingenol mebutate al día durante 2 días consecutivos (inicio del tratamiento considerará como día 0). Cuando los tumores alcanzaron 100 mm
2 ratones se sometieron a eutanasia usando gas dióxido de carbono. El gel 0,1% comprende 1 mg /g de ingenol-3 angelato en un excipiente que contiene alcohol isopropílico, hidroxietilcelulosa, ácido cítrico monohidrato, citrato de sodio, alcohol bencílico y agua purificada. Esta dosis y el horario fue elegido como trabajos anteriores habían demostrado que proporciona una tasa de regresión 50-100% en el modelo de ratón B16 [16,21].
C57BL /6 ratones fueron adquiridos de ARC, Perth, Australia. MyD88
- /- (B6.129P2 (SJL) -
Myd88
TM1
1Defr
/J.), Rag1
- /- (B6.129S7-
Rag1
tm1Mom
/J) y μMT (B6.129S2-
Igh
-6
tm1Cgn
/J) los ratones en un fondo C57BL /6 se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE.UU.), y fueron criados en el local en ratones con deficiencia de cadena gamma QIMR B. FcR común (FcyR
- /-.) (B6.129P2-
Fcer1g
tm1Rav
N12) en un fondo de C57 /BL6 fueron adquiridos de Taconic (Hudson, Nueva York, EE.UU.)
anakinra tratamiento
Kineret (anakinra) SOBI (Swedish Orphan Biovitrum) se le dio ip a 1 mg /ratón (en 100 l en PBS) al día, el día 0 (3-4 horas antes del inicio del tratamiento mebutate ingenol) a través de el día 7. Se da el mismo volumen de PBS a los ratones de control.
Histología e inmunohistoquímica
hematoxilina y eosina (H & amp; e), ApoTag tinción (ApoTag Plus de peroxidasa
In situ
kit de detección de apoptosis, Millipore) y anti-manchas Ly6G (usando rata anti-ratón Ly6G; número de catálogo NMP-R14; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) se llevaron a cabo como se describe anteriormente [23,24]. Las diapositivas fueron escaneadas digitalmente mediante un escáner de diapositivas de escaneo ScopeXTdigital (Aperio, Vista, CA) y análisis de imágenes de secciones por duplicado fueron llevadas a cabo utilizando el software Aperio ImageScope (v10) y el píxel positiva Count algoritmo v9 con la configuración predeterminada.
Killing ensayos
células B16 (5x10
3) fueron sembradas en placas de 96 pocillos en DMEM planas 100 l suplementado con suero de ternera fetal al 5% y HEPES 10 mM pH 7,2. se recogieron al día siguiente (día 1) células de médula ósea, se lavaron una vez, y se añadieron dentro de los 45 minutos de la recogida en el efector indicado a diana con 6 repeticiones. Anakinra (100 mg /ml final) o IL-1β (Shenandoah Biotechnology Inc., Warwick, PA, EE.UU.) (40 ng /ml final) y luego se añadió, seguido de mebutate ingenol (40 ng /ml final). Las células en suspensión día siguiente (día 2) se eliminaron mediante la inversión de las placas se añadió en papel de seda y medio fresco. Después de 2 días de incubación (día 4), se eliminó el medio por inversión de las placas en papel de seda y la célula se fijaron y tiñeron con violeta cristal. Las placas se secaron, 100 l de metanol por pocillo y la absorbancia medida a 595 nm. La matanza se calculó en relación con las células B16 sin efectores después de la sustracción de fondo. Mediciones de proteína
IL-1a e IL-1ß
Los ratones con tumores B16 fueron tratados con ingenol mebutate día 0 y 1, el tratamiento sitios fueron extirpados en los tiempos indicados, se homogeneizó (homogeneizador de tejidos utilizando Precellys24 y granos de cerámica) en PBS suplementado con 0,1% de Igepal CA-630 detergente no iónico (Sigma) y cóctel inhibidor de la proteasa (Roche). los niveles de IL-1a e IL-1ß se midieron en los sobrenadantes utilizando BD ™ citométricos de bolas de matriz Flex Set reactivos (BD Biosciences).
cultivos de queratinocitos y anti-IL-1α inmunotransferencia
adulto humano queratinocitos epidérmicos (Heka-APF, Cascade Biologics, Oregón, EE.UU.) se cultivaron según las recomendaciones del proveedor en matriz de recubrimiento y en medio-bajo de calcio (EpiLife con S7) sin suero (Gibco). Las células que hacen crecer hasta la confluencia en placas de 6 pocillos, a continuación, se añaden calcio a una concentración final de 1 mM y las células se cultivaron durante 48 horas. Las células se trataron luego con las concentraciones indicadas de mebutate ingenol durante 16 horas en 1 ml de medio que contiene calcio EpiLife 1 mM. Se recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron a 1000 g durante 5 minutos, y las proteínas en el sobrenadante se precipitaron usando metanol como se describe [25]. Los precipitados se analizaron entonces mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-IL-1α (Abcam; número de catálogo 9614) y de cabra anti-conejo HRP anticuerpo secundario (Merck Millipore). Las transferencias fueron escaneados utilizando ImageQuant LAS 500.
Estadísticas
El análisis estadístico se realizó utilizando IBM SPSS Statistics (version19). Las tasas de supervivencia y recaída se representan como gráficos de Kaplan-Meier, con significación estadística determinada por pruebas de log-rank (Mantel-Cox). Para otros conjuntos de datos se utilizó la prueba t si la diferencia en las varianzas era & lt; 4, asimetría era & gt; -2, y curtosis era & lt; 2; donde los datos eran no paramétrico y la diferencia en las variaciones era & lt; 4, se utilizó la prueba U de Mann Whitney, si & gt; 4 se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov. A 2 vías ANOVA se utilizó para la tinción ApoTag, con datos que muestran una distribución paramétrica y las diferencias en la varianza. & Lt; 4
Resultados
Las tasas de recaída en ratones deficientes en T y las respuestas de células B
Tanto las células T contra el cáncer y los anticuerpos anti-cáncer se inducen después del tratamiento tópico ingenol mebutate (y regresión) de un número de tumores por vía subcutánea crecido en ratones [9,10,21]. Los experimentos utilizando la línea de carcinoma de células escamosas LK2 crecido en
Foxn1
nu
ratones también sugiere un papel de los anticuerpos y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en la prevención de la recaída [21]. Para investigar más a fondo la contribución de la respuesta inmune adaptativa a la actividad anti-cáncer de mebutate ingenol, tumores B16 se hicieron crecer por vía subcutánea a 10-20 mm
2 en Rag1
- /- ratones (C57BL /6 de fondo), el cual son incapaces de generar B adaptativo o respuestas de células T, y en ratones C57BL /6 de control. Los sitios de tumor se trataron a continuación dos veces por vía tópica (día 0 y día 1) con mebutate ingenol o gel placebo, y el crecimiento tumoral se controló con el tiempo. Las tasas de recaída no fueron significativamente diferentes entre Rag1
- /- y ratones C57BL /6 ratones (Figura A en S1 File), lo que sugiere ni B ni las células T juegan un papel importante en la eficacia anti-tumor de mebutate ingenol en el modelo B16 .
Otros experimentos para investigar el papel de (i) ADCC [21] utilizando el receptor Fc de la cadena gamma común ratones deficientes (FcyR
- /-) ratones (Figura B en S1 de archivos) y (ii) anticuerpos usando ratones deficientes μMT células B (Figura C en S1 archivo) no fueron concluyentes, ya que las tasas de crecimiento de B16 (en ausencia de tratamiento ingenol mebutate) eran diferentes en estos ratones.
el aumento de las tasas de recaída en MyD88
- /- ratones
para investigar más a fondo la contribución de la respuesta inmune innata [21] a la eficacia anticancerosa del tratamiento ingenol mebutate, las células fueron cultivadas B16 por vía subcutánea a 10-20 mm
2 en MyD88
- /-. y ratones C57BL /6 y luego fueron tratados dos veces (día 0 y el día 1) con mebutate ingenol o gel placebo, y el crecimiento del tumor monitorizado con el tiempo
Las tasas de recaída en MyD88
- /- ratones fueron significativamente mayores (84%) que en ratones C57BL /6 (50%) de tratamiento post ingenol mebutate (Fig 1A), con una reducción significativa subsiguiente en la supervivencia de 50% en ratones C57BL /6 a 16% en MyD88
- /- ratones (figura 1B)
(a) Las tasas de recaída siguientes (i) el tratamiento ingenol mebutate de tumores B16 cultivadas en MyD88
-. /- ratones (n = 25), ( ii) tratamiento ingenol mebutate de B16 tumores crecido en ratones C57BL /6 (n = 21), (iii) tratamiento con placebo de B16 tumores que crecen en MyD88
- ratones (n = 18) y (iv) tratamiento con placebo de - /tumores B16 cultivadas en 6 ratones C57BL /(n = 19). Los ratones se puntuaron positivo cuando un tumor era claramente visible (≥1-2 mm de diámetro). Los datos de dos experimentos independientes. grupos de tratamiento mebutate Ingenol fueron significativamente diferentes p = 0,021, log-rank (Mantel-Cox) prueba. (B) Las tasas de supervivencia de los mismos ratones descritos en A; los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron 100 mm
2. grupos de tratamiento Ingenol mebutate fueron significativamente diferentes p = 0,018, prueba de log-rank (Mantel-Cox).
En contraste con un informe anterior [26], no se observaron diferencias significativas en el crecimiento de B16 en MyD88
- /- y ratones C57BL /6 en los ratones tratados con placebo (Figura D en S1 archivo). Las tasas de supervivencia eran en realidad marginalmente (pero no de forma significativa) aumentó en MyD88
- /- ratones en comparación con ratones C57BL /6 en ausencia de mebutate ingenol (Fig 1B, comparar los grupos de placebo). Las dos últimas observaciones indican que el aumento de las tasas de recaída en MyD88
- /- ratones después del tratamiento mebutate ingenol no eran inherentemente debido al crecimiento más robusto de tumores B16 en MyD88
- /-.
Ratones
tratamiento anakinra aumento de recaída
MyD88 está implicado en la transducción de señales tanto para los receptores de tipo Toll y el receptor IL-1, e IL-1β mRNA se induce en ratones después del tratamiento ingenol mebutate tópica [21]. Los queratinocitos expresan altos niveles de IL-1α constitutiva, que se libera después de la aplicación tópica de éster de forbol [27]; éster de forbol, como mebutate ingenol, se activa la PKC [14]. El uso de IL-1 ratones deficientes se complica por las muy diferentes tasas de crecimiento de B16 en estos animales en comparación con los ratones de tipo salvaje [28]. Así, para investigar el papel de IL-1, los ratones fueron tratados con anakinra, un antagonista del receptor de IL-1 recombinante utilizado en el tratamiento de la artritis reumatoide. tratamiento anakinra aumentó significativamente las tasas de recaída de 0% a 50% (Fig 2A) y disminución de la supervivencia de 100% a 0% (Fig 2B), lo que sugiere que la IL-1 juega un papel en la eficacia anti-tumor de mebutate ingenol. anakinra tratamiento no afectó el crecimiento de tumores B16 establecidos
in vivo gratis (Figura E en Archivo S1), en consonancia con los resultados anteriores [29,30,31].
Las tasas de recaída (A) después de C57BL /6 ratones portadores de tumores B16 fueron tratados con mebuate ingenol o placebo, y las inyecciones diarias recibidas de PBS o anakinra, días 1-7. (N = 9-12 ratones por grupo). Los ratones se puntuaron positivo cuando un tumor era claramente visible (≥1-2 mm de diámetro). Estadísticas comparadas con anakinra + + PBS en los grupos tratados ingenol mebutate utilizando la prueba (Mantel-Cox) de log-rank. (B) supervivencia de los ratones se describe en A; los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron 100 mm
2. Estadística como en A.
anakinra y neutrófilos reclutamiento y la apoptosis
Topical resultados del tratamiento ingenol mebutate en una contratación pronunciada de neutrófilos al sitio de tratamiento [9,17,20,21] , que en este documento se cuantificó mediante tinción de anticuerpos anti-Ly6G, inmunohistoquímica y análisis de imágenes (recuento Aperio positiva Pixel). Como era de esperar, se observó significativa reclutamiento de neutrófilos al sitio de tratamiento (con un pico en el inicio del tratamiento de post día 2) (Fig 3A, las instalaciones de aguas, comparar día 0 con 2 días PBS). Aunque la IL-1 se ha demostrado para promover el reclutamiento de neutrófilos en varias configuraciones [32,33,34] anakinra tratamiento no afectó significativamente la contratación al lugar de tratamiento (figura 3A, las instalaciones de aguas, compare los días 2, en comparación con PBS anakinra). Sin embargo, en las secciones donde el tumor se pudo ver claramente, la densidad de neutrófilos dentro de ≈200 m de la masa tumoral era ligeramente (& gt; 2 veces), pero de manera significativa, más bajo en tratados anakinra animales (Fig 3A, dentro de ≈200 m de tumoral, compare los días 2, en comparación con PBS anakinra). Ejemplos de esto último se muestran en la figura 3B, con los neutrófilos tinción marrón y la masa tumoral fácilmente identificable por los melanosomas negro (Fig 3B, óvalos blancos). así anakinra pareció reducir el reclutamiento de neutrófilos al tumor, con IL-1β derivado del tumor se informó anteriormente para reclutar neutrófilos contra el cáncer para el tumor [35].
(A) de neutrófilos a los sitios de reclutamiento tratamientos (bar izquierda gráfico) y dentro de ≈200 m del tumor (gráfico de barras a la derecha). Los sitios de tratamiento; día de la iniciación del tratamiento posterior 2 ingenol mebutate, sitios de tratamiento fueron extirpados y procesados para inmunohistoquímica y se tiñó con el marcador de neutrófilos, anti-Ly6G. Las láminas fueron escaneados y analizados por el software Aperio número de píxeles para la tinción de color marrón (configuración predeterminada) excluyendo las áreas que contienen tumor (como melanosomas proporcionan una señal de falsos positivos). Dos secciones por ratón, 6 ratones por grupo. Estadísticas de las pruebas de Kolmogorov-Smirnov (diferencias en la varianza entre los grupos fue & gt; 4). Dentro de ≈200 micras de tumor; en las secciones donde se pudo identificar fácilmente la masa tumoral (por la presencia de melanosomas negro), la tinción marrón que rodea el tumor (a menos de ≈200 m) se cuantificó como anteriormente. Una de las secciones por ratón, 4-5 ratones por grupo. Estadísticas por prueba de Mann-Whitney U (distribución de datos no paramétricos, y las diferencias en la varianza & lt; 4). (B) Las imágenes que ilustran la densidad reducida de los neutrófilos de tinción anti-Ly6G (mancha marrón) dentro de ≈200 m de la masa tumoral en anakinra versus PBS ratones tratados. Los tumores son delineados por líneas blancas y se identificaron por la presencia de melanosomas negros. Secciones están orientados con la piel (no mostrado) en la parte superior, con los tumores localizados en la dermis. tinción (C) ApoTag de las secciones descritas en A. Seis ratones por grupo, 2/3 secciones por ratón, estadísticas de 2 vías ANOVA (distribución de datos paramétricos y las diferencias en la varianza & lt; 4, las drogas y el ratón como factores fijos, 2 /3 secciones por ratón como variables dependientes). (Ejemplos de la tinción se muestran en la Figura F en S1 File).
IL-1 se ha informado que inhiben la apoptosis de neutrófilos [36,37,38]. por lo tanto, secciones paralelas a los descritos anteriormente se tiñeron con ApoTag y análisis de imágenes (como anteriormente) de las zonas ricas de neutrófilos realizados para medir el grado de apoptosis. Ejemplos de la tinción Apotag se muestran en la Figura F en S1 Archivo. tratamiento anakinra más del doble de la densidad de tinción ApoTag en zonas ricas de neutrófilos en los sitios de tratamiento en la dermis 2 días del inicio del tratamiento de post ingenol mebutate (figura 3C), lo que sugiere la IL-1 promueve la supervivencia de los neutrófilos reclutados por el tratamiento ingenol mebutate.
mebutate Ingenol e IL-1β promover la muerte de las células B16
in vitro
Hemos demostrado anteriormente que los neutrófilos humanos muestran una mayor destrucción de células de melanoma humano
in vitro en
la presencia de ingenol mebutate [21]. Para investigar más a fondo la capacidad de mebutate ingenol para promover la eliminación de los tumores por los neutrófilos, hemos desarrollado un sistema murino utilizando células B16 y células de médula ósea, que comprenden ≈ 40% de neutrófilos, células ≈40% de B, ≈10% de células monocíticas y un pequeño número de otros tipos de células. mebutate Ingenol fue consistentemente capaz significativamente para promover la destrucción de células B16 por estas células por ≥ 2 veces (Fig 4A, p = 0,005 y 0,002). Esta muerte no fue inhibida en presencia de anakinra (Fig 4A, líneas de trazos) que sugiere que ni los neutrófilos mebutate estimulada Ingenol [39] ni células B16 generan suficiente IL-1 para estimular la destrucción de células tumorales [35]. Sin embargo, en presencia de exógenamente añadido IL-1β, matando fue marginalmente pero consistentemente, y a menudo de manera significativa, el aumento tanto en la presencia y ausencia de ingenol mebutate (Fig 4B). Estos datos apoyan la opinión de que la IL-1 mejora la actividad anti-cáncer de neutrófilos
in vitro
, coherente con los informes anteriores que muestran que IL-1 puede promover la actividad estallido respiratorio desgranulación y en los neutrófilos humanos [40,41] . (No se pudo excluir formalmente la posibilidad de que otras células en la médula ósea fueron responsables de la actividad de las células contra el cáncer, como la purificación de los neutrófilos murinos dio lugar a resultados inconsistentes).
Las células de médula ósea (A) (≈ 40% de neutrófilos) se incubaron con células B16 en placas de 96 pocillos (6 repeticiones) en el efector indicado a diana y la destrucción de células calculados en relación con células B16 con ningún fármaco o efectores. Estadísticas de Kolmogorov-Smirnov (diferencia en la varianza & gt; 4) p = 0,005, y la prueba U de Mann Whitney (no paramétrico de distribución y la diferencia en la varianza & lt; 4) p = 0,002. mebutate Ingenol (40 ng /ml final) y /o anakinra (100 mg /ml final) estuvo presente durante el ensayo. (B) En cuanto a A, excepto una amplia gama de de efector a diana (es decir, 15: 1 a 250: 1) se usaron y se añadió IL-1β (40 ng /ml final). Estadísticas de Kolmogorov-Smirnov (para conjuntos de datos donde la diferencia en la varianza era & gt; 4) y pruebas t (para los conjuntos de datos con distribución paramétrica y las diferencias en la varianza & lt; 4).
IL-1 de proteínas niveles en los sitios de tratamiento ingenol mebutate
los datos hasta ahora apoya la opinión de que la IL-1 promueve la eficacia contra el cáncer de mebutate ingenol mediante la promoción de la actividad anticancerígena de los neutrófilos, con MyD88 requerida para la señal del receptor de IL-1 transducción [42]. Para obtener más conocimientos sobre la producción de IL-1, IL-1α tejido y los niveles de proteína IL-1ß en los sitios de tratamiento se cuantificaron antes y después del tratamiento ingenol mebutate. los niveles de proteína IL-1a en los sitios de tratamiento fueron de alta antes del tratamiento (Fig 5A), con la expresión de IL-1α restringido a la piel en lugar de que el tumor B16 (Figura G en S1 File). Esta observación es consistente con la expresión conocida alta constitutiva pro-IL-1α proteína en queratinocitos [27]. los niveles de proteína IL-1a se redujeron significativamente (≈3 veces) tratamiento posterior (figura 5A), probablemente asociado con una extensa necrosis de queratinocitos inducida dentro de 6-24 h de tratamiento ingenol mebutate [17]. Este patrón de expresión de la proteína IL-1α fue similar en MyD88
- /- ratones (Fig 5A, MyD88
- /-; Figura G en S1 File).
(A, B) C57BL /6 y MyD88
- /- ratones con B16 tumores fueron tratados tópicamente con ingenol mebutate días 0 y 1, los sitios de tratamiento se extrajeron y se midieron los niveles de IL-1a y IL-1ß en los extractos utilizando BD BD ™ citométricos de bolas array ( n = 6 ratones por grupo y el tiempo de punto). Estadísticas de las pruebas de Kolmogorov-Smirnov (diferencias en la varianza & gt; 4). (C) queratinocitos humanos adultos cultivadas se trataron con la concentración indicada de mebutate ingenol durante 16 horas y los sobrenadantes analizados por Western utilizando un anticuerpo anti-IL-1α. La flecha indica la posición de la forma bioactiva de 18 kDa de IL-1α.
niveles de proteína IL-1β en ratones C57BL /6 fueron bajas antes del tratamiento ingenol mebutate y el aumento (≈3 veces) después de ingenol tratamiento mebutate, con este aumento alcanzar significación en día 6 (Fig 5B, C57BL /6) consistente con los datos de ARNm anteriores [21]. En el día 6 niveles de proteína IL-1β también fueron significativamente mayores en mebutate ingenol tratada ratones C57BL /6 en comparación con los tratados con MyD88 ingenol mebutate
- /- ratones (Figura 5B, día 6). Por lo tanto MyD88
- /-. Ratones tienen un defecto en la inducción de la proteína IL-1β después del tratamiento ingenol mebutate, coherente con la inducción de IL-1β dependiente de MyD88 visto en varios contextos [43,44]
La con base de talón IL-1 ensayos, que se utiliza en el presente documento en lisados de tejidos, son incapaces de diferenciar entre los inactivos (-IL-1 pro) y se escindió-activa IL-1 especie, con los datos recientes que sugieren pro-IL-1α también necesita ser escindido de la forma 18 kDa sea activo a concentraciones fisiológicas [45]. Por lo tanto la IL-1α liberado de los queratinocitos [27] y /o la inducción de IL-1β puede proporcionar la IL-1 después del tratamiento ingenol mebutate.
mebutate Ingenol provoca la liberación de IL-1α a partir de queratinocitos
in vitro
Los niveles considerablemente más altos de IL-1α, en comparación con la IL-1β (figura 5A vs 5B), podrían argumentar que la IL-1α es un jugador importante en este contexto. La caída en los niveles totales de IL-1α después del tratamiento ingenol mebutate (figura 5A) (contemporáneo de la necrosis de queratinocitos [17]) sugiere queratinocitos IL-1α puede ser puesto en libertad, ya que otra aplicación tópica activadores de PKC causan la liberación de IL-1α a partir de queratinocitos [27 ]. Los queratinocitos expresan constitutivamente altos niveles intracelulares de los pro-IL-1α [27], que se une a IL-1 receptor 2 (IL1R2) [46], con IL1R2 realidad regulada hasta después de ingenol mebutate Treament [15]. Producción de fisiológicamente activa IL-1α se cree que requiere (i) la liberación de pro-IL-1α de IL-1R2, un proceso mediado por la escisión mediada por caspasa-1 de IL-1R2, y (ii) la posterior escisión de la lanzado pro-IL-1α por calpaína para generar fisiológicamente bioactivo 18 kDa de IL-1α [45].
para determinar si ingenol tratamiento mebutate de queratinocitos provoca la liberación de IL-1α, cultivadas queratinocitos humanos primarios se trataron con ingenol mebutate
in vitro
durante 16 horas y el sobrenadante se analizaron para la presencia de las 18 especies kDa de IL-1α por Western. El tratamiento con mebutate ingenol a 50 g /ml, pero no 20 o 5 mg /ml, dieron como resultado la liberación de 18 kDa de IL-1α (Fig 5C, flecha). La concentración de 50 mg /ml causa aumentos en el calcio citosólico, pero es sólo por debajo de la concentración que causa citotóxico abierta afecta en los queratinocitos [47]; (También se observó ninguna muerte celular manifiesta en estos cultivos).
Discusión
Aquí nos proporcionan la prueba de que la eficacia contra el cáncer de tratamiento tópico ingenol mebutate requiere tanto MyD88 e IL-1. El aumento de las tasas de recaída de tumores se observaron en MyD88
- /- ratones, y en ratones C57BL /6 después de anakinra (anti-IL-1) de tratamiento, con MyD88 requerido para la señalización de IL-1 receptor [42]. tratamiento tópico ingenol mebutate se sabe que causa una pronunciada el reclutamiento de neutrófilos al sitio de tratamiento [9,17,20,21], con la IL-1 se mostró previamente para promover las actividades contra el cáncer de neutrófilos en el modelo B16 [35,48 ]. (IL-1β no tiene un efecto directo sobre el crecimiento B16 [35]). Los neutrófilos también son conocidos para mediar en las actividades contra el cáncer en otros sistemas [49,50]. Se demuestra en este documento que la IL-1 afecta a tres aspectos del comportamiento de los neutrófilos después de la administración ingenol mebutate; (I) aumento de la contratación en el tumor (figura 3B), en consonancia con el papel informado ampliamente de la IL-1 en la promoción del reclutamiento de neutrófilos [32,33,34,35,51,52,53], (ii) reduce la apoptosis de neutrófilos ( Fig 3C), con IL-1 se informó anteriormente para inhibir la apoptosis de neutrófilos [36,37,38], y (iii) aumento de la muerte del tumor, consistente con la función informó de IL-1 en la promoción de la activación de neutrófilos [40,41]. IL-1 e IL-1 receptor de señalización tanto, parecen jugar un papel en la reducción de las tasas de recaída después del tratamiento ingenol mebutate mediante la promoción de las actividades contra el cáncer de neutrófilos
.
El tratamiento de los queratinocitos
in vitro
, con una dosis de mebutate ingenol que es capaz de elevar el calcio intracelular [47], dio lugar a la liberación de la forma bioactiva 18 kDa de IL-1α. Queratinocitos derivados de IL-1α puede por lo tanto (al menos inicialmente) ser una fuente importante de IL-1 después del tratamiento ingenol mebutate. Las dosis más bajas ingenol mebutate no indujeron la liberación de IL-1α, lo que sugiere la activación de PKC (que se produce a concentraciones tan bajas como 10 ng /ml [21]) no es suficiente para la liberación de IL-1α. El aumento de calcio intracelular [16] se podría esperar para activar la calpaína [54], con la calpaína activa requerida para la escisión de pro-IL-1α a la especie de 18 kDa de IL-1a [45]. Sin embargo, pro-IL-1α primero debe ser liberado de IL-1R2, un proceso que se cree que está mediada por la escisión de IL-1R2 [45] caspasa-1 mediada. La liberación de 18 kDa liberación de IL-1α puede sugerir la activación de los queratinocitos de la caspasa-1, y la caspasa 1 inducción y la activación se puede detectar en la piel después del tratamiento ingenol mebutate (Figura H en S1 File). Además, la permeabilización de la membrana plasmática puede ser suficiente para inflamasoma (y por tanto la caspasa 1) de activación [55], con mebutate ingenol capaz de inducir la permeabilización de la membrana plasmática [16,47]. Sin embargo, la activación de los queratinocitos de la caspasa-1 (y tal vez pyroptosis [56]) después del tratamiento tópico ingenol mebutate queda por demostrar formalmente, y se complica por la abundancia de neutrófilos, que también expresan caspasa 1.
El queratinocitos -derivado IL-1α puede estar implicado en la inducción (dependiente de MyD88) de IL-1β (Fig 5B), con la inducción de IL-1β por IL-1 se informó anteriormente [57,58] y la IL-1β derivado del tumor también se muestra a reclutar neutrófilos al tumor [35]. Como células B16 no hacen IL-1 [35], las células no malignas en /alrededor del tumor (por ejemplo, células del estroma, fibroblastos y /o macrófagos) pueden representar la fuente de IL-1β. Después del tratamiento ingenol mebutate
in vivo
(i) tejido tumoral B16 muestran una inducción ≈1.5 veces de IL-1β ARNm [21] y (ii) los sitios de tratamiento de tumores muestran un aumento ≈2.5 veces en la proteína IL-1β niveles (Fig 5B). neutrófilos estimulados también pueden hacer que la IL-1β [39,59]. el acoplamiento del receptor Toll-like también podrían estar involucrados en la inducción de IL-1β [43,44], con la inducción de la necrosis primaria y hemorragia en el tumor (evidente después del tratamiento mebutate ingenol en ratones [60], véase también la figura I en S1 Archivo) proporcionando potencialmente agonistas de los receptores Toll-like auto-derivados [61].
Los datos previos que muestran una mayor extensión de tumores en ratones SCID LK2 (que tienen poco o nada de inmunoglobulina) frente a
Foxn1
nu
ratones (que retienen la capacidad de hacer IgM), sugiere un papel para los anticuerpos anti-cáncer y ADCC de neutrófilos en la reducción de las tasas de recaída [21]. Sin embargo, los datos presentados en este documento usando B16 tumores que crecen en Rag1
- /- ratones, sugiere ni los anticuerpos (ni las células T) juegan un papel importante en la reducción de las tasas de recaída.