Extracto
Antecedentes
Un gran número de humanos antígenos asociados a tumores que son reconocidos por las células CD8
+ T en una clase de antígeno leucocitario humano I (HLA-I) de la manera restringido por han sido identificados. Rica en AT proteína de unión a secuencia especial 1 (SATB1) es altamente expresado en muchos tipos de cánceres humanos como parte de su fenotipo neoplásico, y sobre regulación de la expresión SATB1 es esencial para la supervivencia del tumor y la metástasis, por lo tanto esta proteína puede servir como un racional diana para vacunas contra el cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
péptidos derivados de SATB1 Doce fueron predichas por un inmuno-informática enfoque basado en el motivo de unión a HLA-a * 02. Estos péptidos se examinaron para su capacidad de inducir respuestas de células T específicas de péptido en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas de HLA-A * 02
+ de donantes sanos y /o HLA-A * 02
+ pacientes con cáncer . El reconocimiento de HLA-A * 02
+ SATB1-expresión de las células cancerosas también fue probado. Entre los doce péptidos derivados de SATB1, SATB1
565-574 inducidos con frecuencia las respuestas de células T específicas de péptido en PBMCs de dos donantes sanos y pacientes con cáncer. Es importante destacar que las células T
565-574-específicos SATB1 reconocidos y mataron a HLA-A * 02
+ SATB1
+ células cancerosas de una manera restringida de HLA-I.
Conclusiones /Importancia
Hemos identificado un nuevo HLA-a * 02-epítopo restringido el péptido derivado de SATB1 reconocidos por CD8
+ células T, que, a su vez, reconoce y mata a HLA-a * 02
+ SATB1 células
+ tumorales. El epítopo derivado de SATB1 identificado puede ser utilizado como un marcador de diagnóstico, así como una diana inmunitaria para el desarrollo de vacunas contra el cáncer
Visto:. Wang M, Yin B, Matsueda S, Deng L, Li Y, Zhao W , et al. (2013) Identificación de especial rica en AT Secuencia Binding Protein 1 como un antígeno tumoral Novel Reconocido por CD8
+ células T: Implicación para la inmunoterapia del cáncer. PLoS ONE 8 (2): e56730. doi: 10.1371 /journal.pone.0056730
Editor: Silke Appel, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: 26 Octubre, 2012; Aceptado 14 de enero de 2013; Publicado: 21 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud y el Instituto de Investigación del cáncer, y el Instituto de Investigación del hospital Metodista. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Uno de los enfoques más prometedores en el tratamiento del cáncer se basa en el aprovechamiento del sistema inmune para erradicar las células malignas [1], cuyo éxito depende en gran medida de la identificación de antígenos asociados a tumores adecuados (TAA) para la generación de efectivo vacunas contra el cáncer. Ha sido bien establecido que las células tumorales expresan TAA que pueden ser reconocidos por células CD8
+ T en el contexto de I (HLA-I) moléculas de clase antígeno leucocitario humano. Se han identificado un gran número de TAA y epítopos derivados de TAA [2], [3], con algunas de estas proteínas y derivados de péptidos ya en los ensayos de vacunas clínicas. aprobaciones recientes de la vacuna /drogas sipuleucel-T (Provenge) y ipilimumab (YERVOY) por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) representan hitos basados en la inmunoterapia en el campo de la inmunoterapia del cáncer [4], [5]. Y un ensayo clínico de fase III del péptido gp100 de melanoma también arrojaron resultados muy alentadores [6]. Además, el trabajo de dos grupos independientes subrayó la importancia de los antígenos específicos de tumores en la provocación de la respuesta inmune contra un tumor en desarrollo [7], [8], sin duda, intensificar aún más los esfuerzos de búsqueda de antígenos tumorales novedosos para la inmunoterapia del cáncer.
a pesar de estos resultados prometedores, el éxito en ensayos de vacunas contra el cáncer, en general, ha sido esporádica [9] - [11]. Durante el último par de años, se han identificado varios TAA que se expresan en diferentes tipos de neoplasia [2], [3]. Sin embargo, la mayoría de los antígenos descritos hasta ahora son prescindibles para la supervivencia y el crecimiento de las células tumorales, con la excepción de unos pocos TAA como telomerasa [12], survivina [13] y anti-apoptóticos miembros de la Bcl-2 familia (Bcl-2, Bcl-X (L) y MCL-2) [14]. Por lo tanto, las células tumorales pueden haber escapado a la vigilancia por el sistema inmune a través de la pérdida y /o baja regulación de los antígenos tumorales [15]. En consecuencia, la orientación TAA que son esenciales para la supervivencia y el crecimiento de las células tumorales puede impedir mejor inmunoselección de variantes de pérdida de antígeno como resultado de la vacunación y mejorar la eficacia de la inmunoterapia del cáncer [15], [16]. Tales antígenos tumorales inmunogénicas que provocan escape inmune mínimo por lo tanto representan los candidatos de vacuna más óptimas para la inmunoterapia del cáncer.
especial rica en AT de unión a secuencia de la proteína 1 (SATB1) es un factor nuclear que funciona como un organizador de la cromatina global. Se regula la expresión génica mediante el plegado de la cromatina en dominios de bucle, y la inmovilización de dominios de ADN para la estructura de red SATB1 [17]. SATB1 parecía estar sobreexpresado en líneas celulares de cáncer de mama agresivos pero las células epiteliales mamarias humanas ausentes o indetectables en condiciones normales y inmortalizadas, lo que sugiere un papel de SATB1 en la organización de la reprogramación de la cromatina y perfiles en última instancia, la transcripción de los tumores de mama para promover el crecimiento y la metástasis [18] . Además, los niveles más altos de expresión SATB1 se asociaron con muchos otros tipos de cáncer, incluyendo el carcinoma de laringe de células escamosas [19], cáncer endometrial endometrioide [20], carcinoma hepatocelular [21], cáncer rectal [22], el melanoma maligno cutáneo [23 ], cáncer gástrico [24], [25], cáncer de ovario [26], cáncer de próstata [27], cáncer de pulmón [28] y glioma [29]. Sobre regulación de SATB1 en estos tipos de cáncer pueden promover el crecimiento del tumor y la metástasis. Desde SATB1 es esencial para el crecimiento tumoral /supervivencia y metástasis, escape inmune por la pérdida o la regulación por disminución de la expresión de SATB1 puede perjudicar el crecimiento y /o metástasis de células tumorales sostenida, con lo que SATB1 un objetivo atractivo para las vacunas contra el cáncer contra varios tipos de cánceres que expresan SATB1
. En este informe, se describe la identificación de epítopos de células T derivados de SATB1 para el reconocimiento de células T utilizando un enfoque inmuno-bioinformática. Se seleccionaron doce péptidos que se predijeron para unirse al HLA-A * 02 molécula. Ellos fueron sintetizados y evaluados
in vitro
por su capacidad para estimular a las células T en PBMC de sujetos sanos y /o pacientes de cáncer basados en la liberación de interferón-γ (IFN-γ). Uno de estos péptidos, SATB1
565-574, se encontró que induce la liberación de IFN-γ en células T periféricas de ambos sujetos sanos y pacientes con cáncer. Es importante destacar que, las células T específicos de SATB1
565-574 fueron capaces de reconocer y matar a HLA-A * 02
+, SATB1 células tumorales que expresan de manera HLA-I-dependiente. Estos resultados demuestran la validez del enfoque inmuno-bioinformática y sugieren SATB1
565-574 puede representar un nuevo epítopo específico de tumor para la inmunoterapia del cáncer.
Materiales y Métodos
donantes sanos y Los pacientes con cáncer
HLA-a * 02
+ próstata o cáncer de ovario pacientes y diez HLA-a * 02
+ sujetos sanos se inscribieron en este estudio después se obtuvo el consentimiento informado por escrito. Todos los protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en el Colegio Baylor de Medicina antes de comenzar los estudios. 20 ml de sangre periférica se obtuvo de cada persona, y las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Noruega). recién aisladas PBMCs fueron criopreservados para su uso posterior en 1 ml de medio de congelación que contiene 90% de sulfóxido de FCS y 10% de dimetilo (DMSO) a -140 ° C. HLA-A * 02 expresión en PBMCs obtenidas de pacientes con cáncer y los sujetos sanos se verificó mediante citometría de flujo con marcado con FITC HLA-A * 02 mAb BB7.2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.).
líneas celulares
Todas las líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7, CAMA-1, MDA-MB-134VI, MDA-MB-175VII, MDA-MB-361, DU4475, MDA-MB-231, MDA -MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-468), células T2 (HLA-A * 02
+ deficiente en TAP línea celular), las líneas celulares de cáncer de próstata (PC3, LNCaP y DU145), línea celular de cáncer de ovario OVCAR-3 y la línea celular de linfoma Jeko-1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). Una línea celular de cáncer de ovario Skov-1 [30], [31] fue una donación del Dr. Kunle Odunsi (Roswell Park Cancer Institute, Nueva York, EE.UU.); una línea celular de linfoma L1236 [32], [33] fue un regalo del Dr. Catherine M. Baliza (Baylor College of Medicine, Houston, EE.UU.). Todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI-1640 (Mediatech; Manassas, VA, EE.UU.), suplementado con 10% FBS, 1% de L-glutamina, y 1% de penicilina y estreptomicina
péptidos
péptidos derivados de SATB1 Doce (Tabla 1) se prevé utilizar BIMAS (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/), y Rankpep (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) basado en el motivo de unión a HLA-a * 02. se seleccionaron epítopos que se prevé por lo menos dos de estos algoritmos para la prueba adicional. Los péptidos fueron sintetizados por un método en fase sólida usando un sintetizador de péptidos (AApptec, Inc .; Louisville, KY, EE.UU.), se purificó por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa y validada por espectrometría de masas. Los péptidos sintetizados se disolvieron en DMSO a una concentración de 10 mg /mL y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso posterior. Un péptido (SATB1
544-552) fue excluido del estudio debido a la dificultad de la síntesis de péptidos.
in vitro
células T estimulación del péptido-específicas en PBMCs
PBMCs (1 × 10
5 células /pocillo) a partir de sujetos sanos o pacientes de cáncer se incubaron con concentraciones de péptido estándar de 20 mg /ml por péptido [34] - [37] en 96 pocillos T microplacas de fondo (BD; Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) en 200 l de medio de linfocitos T (TCM), que consiste en RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA, EE.UU.), suero AB humano al 10% (Valle Biomédica, Winchester , EE.UU.), 50 mM de 2-mercaptoetanol, 100 UI /ml de interleucina-2 (IL-2), y la solución de aminoácido no esencial MEM 0,1 mM (Invitrogen, grand Island, NY, EE.UU.). La mitad de la TCM fue removido y reemplazado con la medicina tradicional china que contiene péptidos frescas (20 g /ml) cada 5 días. Después de 14 días de cultivo, se recogieron y se ensayaron para determinar su capacidad de producir IFN-γ en respuesta a células T2 las células (1 × 10
4 células /pocillo), que se pre-cargado con el péptido SATB1 (5 g /ml) o un péptido control (un EBV irrelevante HLA-a * 02 de unión a péptidos: GLCTLVAML) como un control negativo. Después de 18 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes, y IFN-γ liberación se determinó mediante ensayo ELISA.
Protocolo Rapid Expansion (REP) para las células T péptido-específicas SATB1
SATB1 péptido-específicos Las células T se expandieron por un protocolo de rápida expansión (REP) como se describe anteriormente [38] con una ligera modificación. Brevemente, en el día 0, 0,1-0,5 × 10
6 células T específicas de péptido SATB1 se cultivaron en un matraz T25 con 20 ml de RPMI-1640 suplementado con suero AB humano al 10%, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 30 ng /ml de anticuerpo OKT3 (Ortho Biotech; Bridgewater, NJ, EE.UU.) y 30 ng /ml de anticuerpo anti-CD28 (amp I +; D Systems; Minneapolis, MN, EE.UU.), junto con 20 × 10
6 irradiados PBMCs alogénicos y 5 x 10
6 irradiadas Virus de Epstein Barr (VEB) células B transformadas como células alimentadoras. Los matraces se incubaron en posición vertical a 37 ° C en 5% de CO
2. Se añadió IL-2 (300 UI /ml) en el día 1, y en el día 5, la mitad del sobrenadante del cultivo celular se retiró y se repone con medio fresco que contenía 300 UI /ml de IL-2. 14 días después del inicio de la REP, se recogieron las células y criopreservados para futuros experimentos.
El agotamiento de CD4
+ o CD8
+ Células T a partir de PBMCs
CD4
+ células T o CD8
+ células T se agotaron positivamente a partir de PBMCs de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando monoclonal anti-recubiertas con CD4 Dynabeads anti-revestidas-CD8 o monoclonales (Dynal Biotech ASA; Oslo, Noruega). PBMC agotado de células CD4
+ T o CD8
+ T se verificaron mediante citometría de flujo.
Ensayo ELISA
La liberación de citoquinas se midió mediante el recubrimiento de placas de 96 pocillos de ELISA (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, EE.UU.) con 1 mg /ml de IFN-γ anti-humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C. La placa se lavó seis veces con PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (solución de lavado) para eliminar el anticuerpo no unido de revestimiento, y se bloqueó con 1% de BSA /PBS a temperatura ambiente durante 2 horas. Después, se añadieron 50 l sobrenadante a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hr, a continuación, 50 l de 0,5 mg /ml biotinilado IFN-γ anti-humana (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.) se añadió y se incubaron las placas durante 1 h adicional a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavaron y se incubaron durante 30 min con poli-HRP-estreptavidina (Thermo Fisher Scientific; Rochester, NY, EE.UU.) diluido 1:5000 en PBS /1% BSA. Las placas se lavaron y se añadieron 100 l de solución de sustrato TMB (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, EE.UU.) por pocillo. La reacción colorimétrica se paró usando 2N H
2SO4 y placas se leyeron a 450 nm usando un lector de placas de ELISA.
Extracción de ARN y RT-PCR
extracción de RNA y RT-PCR se llevado a cabo como se informó anteriormente [39]. En pocas palabras, el ARN total fue extraído de células de cáncer con 1 ml de reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Tres microgramos de ARN se transcrito de forma inversa en ADNc en 30 volumen l y se utilizó 1 l de cada cDNA en la posterior reacción de PCR con un par de cebadores específicos SATB1: Primer 1:5'-TGCAAAGGTTGCAGCAACCAAAAGC-3 '; 5'-AACATGGATAATGTGGGGCGGCCT-3 '. GAPDH se utilizó como control de carga: cebador 1:5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3 '; Imprimación 2:5'-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3 '. La reacción de PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 95 ° C durante 1 min, 95 ° C durante 40 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 40 s, el total de 40 ciclos, 72 ° C durante 5 min, y GAPDH se realizó durante 25 ciclos. Cantidades iguales de productos de PCR se cargaron y se detectaron por electroforesis en gel.
Western Blot
Extractos de células enteras se prepararon y se resolvieron en geles de SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU.) y se incubaron adicionalmente con el anticuerpo SATB1 (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Sistema de sustrato quimioluminiscente LumiGLO de KPL (Gaithersburg, MD, EE.UU.) se utilizó para la detección de proteínas.
Análisis FACS
Las células (0,5 × 10
6) se tiñeron con FITC anti -CD8, PE-Cy5-anti-CD4 (ambos de eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.) o FITC-anti-HLA-a * 02 (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) en PBS que contenía FBS al 2% en hielo durante 30 min, y después se lavó dos veces en PBS. Posteriormente, las células se resuspendieron en 500 l de PBS y se analizaron usando una máquina FACScalibur. Para DimerX HLA-A * 02: tinción de Ig, SATB1 reactiva CD8
+ células T se incubaron con purificada HLA-A * 02: dímero Ig (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) cargado con un péptido dado, y después se tiñeron con FITC anti-ratón IgG1 (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). La citometría de flujo se realizó en una máquina FACScalibur.
Ensayo de citotoxicidad
SATB1 derivados se ensayaron las células T específicas de péptido para la citotoxicidad contra las células T2 cargadas con péptido, dos HLA-A * 02
+ SATB1
+ líneas celulares de cáncer (Skov-1 y Jeko-1) y un HLA-a * 02 negativo SATB1
+ PC3 línea celular como control negativo por un lactato deshidrogenasa (LDH) (Promega; Madison, WI, EE.UU.). El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. la liberación de LDH se calculó en base a la siguiente fórmula:.
La citotoxicidad (%) = (experimental - efector espontáneo - Objetivo LDH liberación espontánea) /(meta máxima - liberación espontánea de destino LDH) × 100
la liberación espontánea se determinó usando el sobrenadante de las células diana solas o células efectoras solo, y la liberación máxima se determinó usando el sobrenadante de las células diana incubadas con una solución de lisis incluido en el kit LDH.
Estadísticas
se utilizó la prueba t
de Student para analizar las diferencias cuantitativas entre los pozos experimentales y controles en ensayos de ELISA. P & lt; 0,05 se consideró significativo un
Resultados
SATB1 ARNm se expresa en una variedad de cánceres
Para examinar si SATB1 se expresa en las células cancerosas, la expresión de ARNm de SATB1 en. varios tipos de células tumorales se realizó por RT-PCR. Como se muestra en la Figura 1, SATB1 mRNA fue altamente expresado en una variedad de tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, así como linfoma. Mientras que la línea de células epiteliales normales de la próstata, PNT1A no expresó SATB1 ARNm.
La expresión del ARNm de SATB1 en diferentes líneas celulares se determinó por RT-PCR. Las líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7, CAMA-1, MDA-MB-134VI, MDA-MB-175VII, MDA-MB-361, DU4475, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB- 453 y MDA-MB-468), cáncer de próstata (PC) líneas celulares (PC3, LNCaP y DU145), cáncer de ovario (OC) líneas celulares (OVCAR-3 y Skov-1), las líneas celulares de linfoma (Jeko-1 y L1236 ) y una línea celular epitelial de próstata normal PNT1A se incluyeron como un control. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
La inducción de CTL específicos de péptido derivados de SATB1 en PBMC de donantes sanos
En primer lugar, hemos obtenido a partir de 10 HLA-A * 02
+ donantes sanos para determinar si los precursores de células T SATB1 reactivos estaban presentes en estos sujetos sanos. las células se estimularon
in vitro
durante dos semanas con cada uno de los péptidos derivados de SATB1 contienen HLA-A * 02-vinculante motivo (Tabla 1). Al final de la estimulación de péptidos, los sobrenadantes de los cultivos se analizaron por ELISA para detectar la liberación de IFN-γ en respuesta a células T2 pulsadas con o sin péptidos correspondientes. Como se muestra en la Tabla 2, casi la totalidad de los 11 péptidos derivados de SATB1 (10/11) fueron capaces de inducir respuestas de células T específicas de péptido en al menos uno de los sujetos sanos. En particular, el péptido SATB1
565-574 inducida por un mayor nivel de liberación de IFN-γ (& gt; 900 pg /ml) en 4 de cada 10 sujetos sanos, lo que indica su alto potencial de inmunogenicidad y en la expansión de células T específicas de antígeno en sujetos sanos.
Presencia de derivados de SATB1 CTL específicos de péptido en pacientes con cáncer de
Nuestro análisis indican que las células T específicas de péptido contra SATB1 fueron encontrados
565-574 en ~ 60% de pacientes sanos, por lo tanto, razonó que los precursores de CTL capaces de reconocer este péptido también pueden ser abundantes en PBMCs de pacientes con cáncer. Para probar nuestra hipótesis, hemos examinado si el péptido SATB1
565-574 podría inducir CTL específicos del péptido a partir de PBMCs de HLA-A * 02
+ pacientes con cáncer de ovario. PBMCs de tres HLA-A * 02
+ pacientes con cáncer de ovario se recogieron y se estimularon
in vitro con el péptido
SATB1
565-574. Como se muestra en la Tabla 3, el péptido SATB1
565-574 fue capaz de inducir CTL específicos de péptido a partir de PBMCs de pacientes con cáncer de ovario, lo que indica que el péptido es altamente inmunogénica no sólo en sujetos sanos sino también en pacientes con cáncer. También se determinó si este candidato péptido podría inducir CTL específicos del péptido a partir de PBMCs de HLA-A * 02 pacientes
+ cáncer de próstata. Como fue el caso con los pacientes con cáncer de ovario, el péptido SATB1
565-574 inducidos de manera similar CTLs específicos de péptido a partir de PBMCs de pacientes con cáncer de próstata, así 5 (Tabla 3), indicando precursores de CTL que reconocen este péptido son abundantes en PBMCs de cáncer pacientes.
derivados de SATB1 péptido inducida CD8
+ T cell respuestas dependientes de
a fin de analizar SATB1 células T
565-574-péptido específico, el próximo las células T expandidas SATB1
565-574 específicas de péptido identificados en las Tablas 2 y 3 con el fin de obtener un número suficiente de estas células. Con este fin, hemos realizado experimentos de titulación de péptidos para determinar la concentración de péptido óptimo para la carga de las células T2 para el reconocimiento de células T. Como se muestra en la Figura 2A, las células T2 podrían ser sensibilizados por el péptido SATB1
565-574 pero no un péptido EBV de control para el reconocimiento de células T a una concentración de 0,08 g /ml, y los sitios de unión de HLA-A * 02 moléculas en T2 células se saturaron en 5 mg /ml. aumentando aún más las concentraciones de SATB1
565-574 fallidos para mejorar la producción de IFN-γ. Por lo tanto, se utilizó sistemáticamente la concentración de péptido de 5 mg /ml para las células T2 pre-carga en nuestros ensayos de ELISA. Las células T expandidas mantienen especificidad de antígeno y cantidades significativas secretados de IFN-γ después de la estimulación con células T2 pulsadas con los péptidos correspondientes, pero no con un péptido de control EBV (Figuras 2A y B). Para obtener evidencia directa sobre los subconjuntos de las células T respondedoras representados en la Figura 2B, los SATB1 PBMCs péptido-reactivos expandido se agotaron, ya sea para
células CD4 + T (Figura 2C) o CD8
+ T (Figura 2D ) antes de la incubación con péptidos para ensayos ELISA. Como se muestra en la Figura 2E, CD8
+ células T, no
+ células T CD4 (Figura 2F), obtenidos a partir de PBMCs expandido respondieron a SATB1 células T2
565-574 de impulsos, lo que indica que la respuesta de células T inducida por SATB1
565-574 dependía de CD8 + células T
. Además, dimerX HLA-A * 02: Ig tinción (Figura 2G y H) y tinción intracelular de IFN-γ (Figura S1) también demostraron que SATB1
565-574 péptido inducida específica, HLA-A * 02 restringido CD8
+ respuestas dependientes de células T.
inducida CD8
+ T respuestas dependientes de células. El reconocimiento de las células T2 pre-cargado con concentraciones valoradas de péptidos (0-20 mg /ml) por SATB1 ampliado las células T
565-574-específicos de donante sano#1 se ensayó por ensayo ELISA (A). Las PBMC SATB1-reactivas expandido (B) fueron co-incubadas con células T2 (1 × 10
4 células /pocillo) por sí sola en medio completo (CM), o con células T2 pre-cargado con cualquiera SATB1
565 -574 (5 mg /ml) o un péptido de control EBV como control negativo. Las células se incubaron durante 18-24 horas, la secreción de IFN-γ en el sobrenadante se determinó mediante ensayo ELISA. PBMCs SATB1 reactivos agotados de células CD4
+ T (C) y PBMCs SATB1 reactivos agotados de CD8
+ células T (D) se verificaron mediante citometría de flujo. Los reconocimientos de células T2 pulsadas con SATB1
565-574 por PBMCs SATB1 reactivos agotados de cualquiera de CD4
+ células T (E) o CD8
+ células T (F) se determinaron por ELISA. SATB1 reactiva CD8
+ células T se incubaron con purificada HLA-A2: dímero Ig cargado con un péptido de control EBV (G) o con el péptido SATB1
565-574 (H), y luego se tiñeron con FITC anti-ratón de IgG1. Las células se analizaron usando una máquina FACScalibur. Los datos (de la A, B, E y F) se representan como media ± desviación estándar. Los resultados representan al menos tres experimentos independientes. *
P
& lt; 0,05, **
P
& lt; 0,01, ***
P
& lt; 0,001 frente a los controles (células T2 solos o células T2 pulsadas con una Control péptido EBV).
el reconocimiento y la destrucción de las células cancerosas por el derivado de SATB1-péptido específico CD8
+ T células en un HLA-I restringido Manner
sobre la base de nuestros resultados hasta el momento, se utilizaron
565-574 específica CD8
+ T células SATB1 en experimentos posteriores. Para determinar si las células T específicas de péptido derivados de SATB1 fueron capaces de reconocer y matar HLA-A * 02
+, SATB1 expresando células cancerosas, se utilizó un HLA-A * 02
- SATB1 ARNm cáncer de próstata positiva PC3 línea celular (como control negativo) y * 02
+ SATB1 ARNm líneas celulares de cáncer positivo de cinco HLA-a. La expresión de mRNA SATB1 en estos 6 líneas de células se examinó anteriormente por RT-PCR (Figura 1) y HLA-A * 02 expresión se verificó mediante citometría de flujo (Figura 3A). Además, también comprobamos la expresión de la proteína SATB1 entre estas líneas celulares (Figura 3B), y encontramos que todas las líneas celulares de cáncer expresan la proteína SATB1 excepto PC3 y OVCAR-3. Por lo tanto, OVCAR-3 también se ha considerado como un control negativo. Como se muestra en la Figura 4A, SATB1
565-574 células T específicos de podían reconocer * 02 células que expresan HLA-A
+ SATB1 Skov-1 y Jeko-1, pero no PC3 o células OVCAR-3. Los otros dos HLA-A * 02
+ SATB1 expresando líneas celulares de cáncer (CAMA-1, MDA-MB-231) sólo pudo ser reconocido cuando fueron pre-tratados con IFN-γ (Figura 4B), lo que sugiere que, o bien mejorada HLA-a * 02 expresión en la superficie celular (Figura S2) o la inducción de inmunoproteasomas de IFN-γ, puede facilitar la presentación del epítopo correcta a las superficies celulares para el escrutinio de células T. En contraste, las células normales, incluyendo PNT1A y PBMCs autólogas, no podrían ser reconocidos por las células T SATB1
565-574 específicos de (Figura 4A). Además, las células SATB1
565-574-T específicas no reconoció en diferenciadas in vitro Th subconjuntos, incluyendo Th1, Th2 y Th17 células (Figura S3).
Las células (A) se tiñeron con FITC -anti-HLA-a * 02 en PBS que contenía 2% de FBS. Luego, las células se lavaron y se re-suspendieron en PBS y se analizaron usando una máquina FACScalibur. (B) La expresión de la proteína SATB1 en diversas células tumorales se determinó mediante Western blot. Actina se utilizó como control de carga.
(A) SATB1
células 565-574-específicos T de donante sano#1 se cultivaron solos en medio o co-incubaron con diversos tipos de tumor células, así como las células normales (PNT1A y PBMC); (B) Las células tumorales se trataron previamente con o sin IFN-γ (10 ng /ml) durante 48 horas antes de la incubación con las células T SATB1 565-574-específicos
. SATB1
565-574 células T específicas se cultivaron en medio solo como control negativo (columna roja); Para bloquear las respuestas de HLA-dependiente, ya sea anti-HLA-I mAb se añadió (W6 /32) o HLA-II mAb en cultivos de células durante la incubación de SATB1
células T 565-574-específicos con Skov-1 (C) o Jeko-1 en las células (D). Las células se incubaron durante 18 -24 horas, la secreción de IFN-γ en el sobrenadante se determinó mediante ensayo ELISA. Se ensayaron SATB1
565-574 específica CD8
+ T células para la citotoxicidad contra las células T2 pulsadas con o sin péptidos (E), Skov-1 (F) y Jeko-1 (G) por el ensayo de LDH. * 02 células PC3 negativos HLA-A se utilizaron como un control negativo en el ensayo de LDH. Los datos de A-G se representan como medias ± SD. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001 frente a los controles
para determinar si las células del reconocimiento de las células cancerosas por SATB1
565-574-específica CD8
+ T era HLA-I restringido, co-cultivadas
565-574 células T específicos de SATB1, ya sea con Skov- 1 o Jeko-1 en las células en presencia de cualquiera de anti-HLA-I mAb (W6 /32) o anti-HLA-II mAb. Como se muestra en la Figura 4C y D, las respuestas de células T se inhibió completamente por la adición de anti-HLA-I mAb, pero no anti-HLA-II (HLA-DP mAb), lo que sugiere que el reconocimiento de células tumorales por SATB1
+ células T sub> 565-574-específica CD8
a fin de examinar si SATB1
565-574-específica CD8
+ células T fueron capaces de matar HLA-A * 02
+, SATB1-expresión de las células cancerosas, se realizaron ensayos de citotoxicidad. Como se muestra en la Figura 4E, SATB1 células T
565-574-específicos mataron a las células T2 pulsadas con SATB1
565-574, pero no las células T2 solos o aquellos pulsadas con un péptido de control EBV. Es importante destacar que, SATB1
células T 565-574-específicos fueron capaces de matar HLA-A * 02
+, las células que expresan SATB1 Skov-1 y Jeko-1, pero no HLA-A * 02
- PC3 células (Figura 4 F y G). Estos resultados sugieren que las células T 565-574 SATB1
específicos de reconocer un epítopo de células T que se endógenamente procesado y presentado por las células tumorales.
Discusión
Está bien establecido que CD8 células
+ T juegan un papel crítico en el control del desarrollo y progresión del tumor. epítopos de péptidos derivados de TAA pueden ser reconocidos como antígenos por las células T en el contexto de moléculas MHC-I [40], [41]. Identificación de los AAT ideales y sus péptidos que son reconocidos por las células T son esenciales para el desarrollo de vacunas contra el cáncer eficaces. TAA Ideal tales como las proteínas anti-apoptóticas [14], la telomerasa [12] y survivina [13], siendo obligatoria para el crecimiento tumoral /supervivencia, pueden representar dianas óptimas para la vacuna mediada por la inmunoterapia del cáncer. SATB1 es altamente expresado en muchos tipos de cánceres humanos y sobre regulación de la expresión SATB1 es esencial para la supervivencia del tumor y la metástasis, por lo tanto SATB1 representa uno de los AAT tales ideales.
El objetivo del presente estudio fue identificar HLA -A * 02 de unión a epítopos derivados-SATB1 reconocidos por CD8 células
+ T en PBMC de sujetos sanos y pacientes con cáncer. Doce péptidos derivados de SATB1 se prevé utilizar BIMAS, SYFPEITHI, y Rankpep basado en el motivo de unión a HLA-A * 02. Se seleccionaron péptidos que se predijeron por al menos 2 de 3 programas para la prueba adicional para determinar su capacidad para estimular PBMC de sujetos sanos y /o pacientes con cáncer. Otros estudios demostraron que 10 de 11 péptidos derivados de SATB1 sintetizados fueron capaces de inducir respuestas de células T específicas de péptido en al menos una de cada 10 sujetos sanos. Específicamente, SATB1
565-574 se encontró para inducir un mayor nivel de liberación de IFN-γ (& gt; 900 pg /ml) en 4 de cada 10 sujetos sanos, lo que indica que este péptido puede ser inmunogénica y potencialmente capaz de expandirse antígeno células T específicas en sujetos sanos. Además, SATB1
565-574 indujo respuestas de las células T con frecuencia específicas en PBMCs de pacientes con cáncer de ovario, así como en PBMCs de pacientes con cáncer de próstata. Es importante destacar que,
565-574 células T específicas de péptido SATB1 reconocidos y mataron a HLA-A * 02
+ SATB1 expresan Jeko-1, las células Skov-1, así como líneas celulares de cáncer de mama IFN- tratados ( CAMA-1 y MDA-MB-231), lo que sugiere que este péptido es, naturalmente, procesado por las células cancerosas.
SATB1 es un factor organizador de la cromatina y la transcripción mundial y ha surgido como un factor clave la integración de la arquitectura de la cromatina de orden superior con la regulación de genes [42]. SATB1 promueve el crecimiento tumoral y la metástasis mediante la reprogramación de organización de la cromatina y la transcripción perfiles, y es altamente expresado en una variedad de cánceres incluyendo el cáncer de mama [18], carcinoma de células escamosas de laringe [19], cáncer endometrial endometrioide [20], carcinoma hepatocelular [21] , cáncer rectal [22], el melanoma maligno cutáneo [23], cáncer gástrico [24], [25], cáncer de ovario [26], cáncer de próstata [27], cáncer de pulmón [28] y glioma [29]. En las células tumorales con altos niveles de SATB1, genes que promueven la progresión tumoral y la metástasis fueron hasta reguladas, mientras que los genes que inhiben la metástasis tumoral fueron reprimidos [17]; mientras que el silenciamiento de SATB1 reducido en gran medida la capacidad invasiva y metastásica de las células del cáncer [43].