Extracto
se han identificado en el cáncer de próstata (CaP), utilizando principalmente ensayos basados en genes candidatos Muchos genes diferencialmente metilado. Recientemente, se han publicado varios perfiles globales de metilación del ADN en el CaP, sin embargo, cada una de ellas tiene puntos débiles en términos de capacidad de observar alteraciones globales de metilación del ADN en el CaP. Nuestra hipótesis es que hay restos no identificados metilación del ADN aberrante en ACC, que se pueden identificar usando métodos de ensayo de mayor resolución. Se utilizó el nuevo desarrollo de Illumina HumanMethylation450 BeadChip en el CaP (
n
= 19) y los tejidos normales adyacentes (
n
= 4) y los hemos combinado con los datos de expresión génica para identificar nuevos metilación del ADN que pueden tener consecuencias funcionales en el desarrollo y la progresión del CaP. También confirmó los resultados de metilación en un conjunto de datos independientes. Dos genes de metilación del ADN aberrantes fueron validados entre un adicional de 56 muestras de CaP y 55 tejidos normales adyacentes. Un total de 28,735 sitios CpG mostraron diferencias significativas en la metilación del ADN (FDR ajusta
P
& lt; 0,05), que se define como una diferencia de medias de metilación de al menos 20% entre PCa y muestras normales. Por otra parte, un total de 122 genes que tenía más de un sitio CpG metilado diferencialmente en su región promotora y un patrón de expresión génica que es inversa a la dirección de los cambios en la metilación del ADN (por ejemplo, disminución de la expresión con el aumento de la metilación, y viceversa). Aberrante de metilación del ADN de dos genes,
AOX1
y
SPON2, España se confirmaron mediante secuenciación bisulfato, con la mayor parte de los respectivos sitios CpG que muestran diferencias significativas entre las muestras de tumores y tejidos normales. El
AOX1
región promotora mostraron hipermetilación en el 92,6% de las 54 muestras analizadas CaP en contraste con sólo tres de 53 a prueba los tejidos normales. En este estudio se utilizó un nuevo BeadChip combinado con los datos de expresión génica en el CP para identificar nuevos sitios CpG metilados diferencialmente situados dentro de los genes. Los genes diferencialmente metiladas recientemente identificados se pueden utilizar como biomarcadores para el diagnóstico de CaP
Visto:. Kim JW, Kim S-T, Turner AR, T Young, Smith S, Liu W, et al. (2012) La identificación de los genes diferencialmente Nueva metilados que tienen consecuencias funcionales potenciales en el cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (10): e48455. doi: 10.1371 /journal.pone.0048455
Editor: Ludmila Prokunina-Olsson, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Julio, 2012; Aceptado: September 26, 2012; Publicado: 31 Octubre 2012
Derechos de Autor © 2012 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones CA106523, CA95052 y CA105055 (para JX); CA135008 (WL y WBI); CA133066 (WL y JWK) y el Departamento de Defensa PC051264 subvención (a JX). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
metilación del ADN es una adición covalente de un grupo metilo en la posición 5 de carbono de una base citosina y este cambio epigenético se encuentra casi exclusivamente en dinucleótidos citosina guanina (CpG) en las células humanas diferenciadas [1]. sitios CpG se encuentran principalmente en secuencias repetitivas o islas CpG (CGI), que son regiones ricas en CpG que se pueden encontrar en todo el genoma humano. En el tejido cerebral humano normal, se encontró menos de 3% de CGI situado en regiones promotoras a ser metilado, en contraste hasta 34% de CGI situado en regiones intragenic fueron metilado [2]. Sin embargo, la metilación CGI en regiones promotoras está bien documentado en muchos estudios debido a la asociación con el silenciamiento de genes [3] - [5]
metilación del ADN aberrante entre las muestras de cáncer y tejidos normales ha sido ampliamente observado en varios tipos de cáncer, incluyendo. CaP [6] - [9]. Más de 67 genes diferencialmente metiladas se identificaron en el CaP, basado principalmente en métodos de ensayo de genes específicos [10]. Los acontecimientos recientes en las técnicas del estado de la técnica, tales como la tecnología de microarrays y secuenciación de nueva generación han dado paso a una nueva era epigenómico en los estudios de metilación del ADN [11] - [14]. Múltiples estudios han reportado patrones aberrantes de la metilación del ADN en todo el genoma en muestras de tejido de CaP, utilizando microarrays de Agilent isla CpG, Illumina HumanMethylation27 (HM27) BeadChips o métodos de secuenciación de próxima generación [15] - [20]. Cuatro documentos han informado de perfiles de metilación del ADN utilizando el HM27 BeadChip [17] - [20]. Kobayashi et al. reportadas más de 8.000 sitios CpG metilados diferencialmente (DMCs) en muestras de CaP en comparación con los tejidos normales adyacentes usando un número relativamente grande de muestras [18]. Mahapatra et al. identificado y confirmado muchos genes aberrantemente metilados que se pueden utilizar como biomarcadores de diagnóstico o pronóstico [20]. Este método HM27 BeadChip proporciona datos de metilación del ADN en la resolución de un solo nucleótido en más de 27.000 sitios CpG. Sin embargo, esta plataforma HM27 cubre sólo el 0,1% de todos los sitios CpG en el genoma humano y todos los sitios CpG prueba están ubicadas en regiones promotoras.
secuenciación MethylPlex-de próxima generación (M-NGS) combina el enriquecimiento enzimática de metilado islas CpG con una técnica de secuenciación de próxima generación [16]. Este método fue utilizado por Kim et al. para identificar regiones diferencialmente 2.481 hypermethylated específicos de cáncer en las regiones promotoras mediante la comparación de muestras de CaP, los tejidos normales adyacentes y los tejidos de la próstata libres de la enfermedad. Sin embargo, cuando se utiliza este método, Kim et al. no informaron ningún resultado en regiones hypomethylated en CaP. Además, el tamaño de las regiones diferencialmente hypermethylated informado por Kim et al. era relativamente grande (3.000 pares de bases). Usando este método, puede difícil identificar regiones centrales metilado que son críticos para la regulación de la expresión génica; por lo tanto, se requiere un ensayo adicional para la evaluación precisa de la metilación del ADN en los sitios CpG individuales [21]. A pesar de las debilidades de cada técnica, estos estudios de metilación del ADN en todo el genoma han proporcionado pruebas de que hay una gran cantidad de sitios no identificados diferencialmente metilado CpG (o regiones, en función de las técnicas de ensayo), y éstos no identificada DMC pueden tener un valor importante como nueva droga objetivos y biomarcadores de diagnóstico o pronóstico.
Illumina HumanMethylation450 (HM450) es una plataforma BeadChip de nuevo desarrollo, que puede probar más de 480.000 sitios CpG en el genoma humano [22], [23]. Esta cobertura corresponde a alrededor del 1,7% de todos los sitios CpG en el genoma humano, y representa un enorme aumento de su predecesor HM27 BeadChip (0,1% de todos los sitios CpG). La alta correlación entre los datos HM450 y todo el genoma de datos de secuenciación de bisulfito indica que esta nueva BeadChip puede proporcionar datos fiables de metilación del ADN para estudios de perfiles epigenómicos [23].
Hemos llevado a cabo un estudio piloto utilizando esta nueva BeadChip HM450 para evaluar CaP muestras y tejidos normales adyacentes. Se identificó un conjunto de genes que están desreguladas por metilación aberrante del ADN en el CaP y luego se combina con los datos de expresión de genes independientes. a continuación, nos centramos en dos genes de metilación del ADN aberrantes (
AOX1
y
SPON2
), con la confirmación mediante análisis de tejidos normales de la próstata adicionales CaP y adyacentes.
Materiales y Métodos
los sujetos de estudio
Todos los tejidos especímenes en este estudio fueron obtenidos de pacientes con cáncer de próstata sometidos a prostatectomía radical para el tratamiento de la enfermedad clínicamente localizada en el Instituto Karolinska, Suecia (
n
= 23) y el hospital Johns Hopkins (JHH;
n
= 111). Todas las muestras de próstata utilizados para este estudio fueron recogidos después de la obtención y escritos se proporcionó la documentación del consentimiento informado de los sujetos humanos aprobaciones correspondientes. Todos los protocolos de estudio fueron aprobados por el Instituto Karolinska o el Johns Hopkins Hospital o el despertador Escuela de Medicina Junta de Revisión Institucional de la Universidad del bosque. muestras de sujetos fueron seleccionados en base a la capacidad de obtener ADN genómico de una cantidad suficiente y pureza (& gt; células de cáncer de 70% para los especímenes de cáncer, células cancerosas detectables para muestras normales) por macrodissection de emparejado adyacente no maligno (en adelante como normales ) y el cáncer que contiene zonas de tejido de la próstata según lo determinado por la evaluación histológica de hematoxilina y eosina manchadas secciones congeladas de piezas de prostatectomía radical. ADN genómico se aisló de los tejidos congelados recortados como se describe anteriormente [24].
metilación del ADN Ensayo
de todo el genoma perfiles de metilación del ADN se realizó utilizando el BeadChip HM450 (Illumina, San Diego, CA) . Los ADN genómicos se modificaron usando el kit EZ-metilación de ADN (Zymo Research, Orange, CA) siguiendo las recomendaciones de Illumina. El ensayo Illumina Infinium también se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
muestras de ADN fueron modificados en la preparación para la secuenciación como se describe anteriormente [25]. cebadores de secuenciación de bisulfito fueron diseñados por el software de metilo Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA) para amplificar el ADN modificado con bisulfito (Tabla S1). Hot Start reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Qiagen, Valencia, CA) se realizó utilizando el siguiente programa de ciclos: 95 ° C durante 15 minutos; 94 ° C durante 30 segundos, 56 ° C durante 30 segundos, y 72 ° C durante 30 segundos para 50 ciclos; y una etapa final a 72 ° C durante 10 minutos. Los productos de PCR amplificados se subclonaron usando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de la transformación de
Escherichia coli
, seleccionados al azar, aproximadamente 10 a 20 por persona
E. coli
colonias para cada muestra evaluada. El ADN del plásmido se amplificó directamente (kit de amplificación TempliPhi; GE Healthcare, Piscataway, NJ) y luego secuenciado utilizando BigDye Terminator v1.1 Cycle kits de secuenciación (Applied Biosystems) con el cebador directo M13
Cada grupo de cebadores de secuenciación de bisulfito. se evaluó utilizando conjuntos de ADN de control reconstituida que eran mezclas en cantidades que varían (0, 20, 50, 80 y 100% de metilación) de dos ADN de control;
M.SssI
ADN tratado con como ADN metilado (Millipore, Billerica, MA) y toda genoma de ADN amplificado como ADN no metilado [26], [27].
Se compararon los datos de la secuencia de bisulfito con la secuencia de referencia del genoma UCSC el fin de evaluar el estado de metilación de cada sitio CpG utilizando software BIQ analizador [28]. Los clones con un mínimo de la tasa de conversión de bisulfito de 95% se incluyeron en los análisis posteriores. Cada sitio CpG en nuestros datos de secuenciación se numera desde el extremo 5 'a 3'. sitios CpG 2 y 34 en el
AOX1
región promotora se excluyeron del análisis adicional debido a la frecuente falta de un solo nucleótido en el largo timina homopolymeric se extiende alrededor de cada uno de estos sitios CpG.
Publicado metilación y Expresión datos
datos de la metilación del ADN en bruto en CaP usando HM27 fueron descargados de la Expresión génica Omnibus, un repositorio de datos pública [18]. Estos datos de metilación se generaron utilizando 86 tejidos de la próstata normales adyacentes y 92 muestras de CaP primarios. los datos de expresión génica en el CP que se basan en el Affymetrix exón 1,0 ST matriz fueron descargados de la página web de portal de datos (http://cbio.mskcc.org/cancergenomics/prostate/data/) [29]. Estos datos de expresión se generaron utilizando 29 tejidos normales adyacentes, 131 muestras de CaP primarios y 19 muestras de CaP metastásico. registro normalizado
2 transformado a nivel de gen (toda la intensidad de señal de transcripción) de datos se utilizaron para el análisis estadístico.
Análisis estadístico
Se obtuvieron los datos sin procesar HM450 utilizando el software GenomeStudio (Illumina) después de la digitalización los BeadChips. ajuste de balance de color, simple normalización de escala, y el análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado se realizaron utilizando el Bioconductor
lumi
paquete [30]. El valor (metilación) β se calculó basándose en la ecuación sugerida por Du et al. [31]. El valor β es una variable continua entre 0 y 1, con valores beta se aproxima a 1 (o 0) que indica la metilación completa (o no metilación, respectivamente) en cada sitio CpG. sitios CpG que tenían la detección
P
valores superiores a 0,05, fueron excluidos.
asociación entre cada fenotipo o parámetro clínico-patológica y la metilación del ADN en cada sitio CpG se puso a prueba por separado dentro de los datos HM450. Estas pruebas estadísticas se realizaron con un modelo generalizado lineal utilizando PROC GENMOD en el software SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC) [32]. La beta-distribución de los valores beta se representó con un enlace logit binomial y una variable de escala estimada con los residuos de Pearson. Determinamos si cada sitio CpG individuo fue estadísticamente significativa basada en la tasa de falso descubrimiento (FDR) con el fin de corregir posibles falsos positivos de múltiples pruebas (alfa = 0,05). También se calculó posteriormente una metilación (valor β) media de un sitio CpG en cada grupo y se seleccionaron los sitios CpG que tenían mayor o igual a 0,2 metilación diferencia media entre dos grupos de comparación [27], [33]. Por lo tanto, un CpG metilado diferencialmente (DMC) se definió como un sitio de CpG que tenía un FDR ajusta
P
valor & lt; 0,05 en una prueba de modelo lineal generalizado y una diferencia media de metilación entre dos grupos de comparación mayor o igual a 0.2 (Figura 1). Los datos HM27 también fueron procesados mediante el mismo procedimiento.
Se utilizó la prueba exacta de Fisher para evaluar las asociaciones entre el DMC y lugares del genoma en todo el genoma. La prueba estadística para la expresión génica se realizó con la prueba de Wilcoxon de suma de rangos en el software SAS. Determinamos si cada gen fue estadísticamente significativa basada en el FDR ajustado
P
valor (α = 0,05).
Resultados
Identificación de los sitios CpG metilados diferencialmente en el CaP
Hemos llevado a cabo en todo el genoma de perfiles de metilación del ADN utilizando el Illumina HM450 BeadChip. Se evaluaron cuatro pares de muestras tumorales y tejidos normales adyacentes, más 15 muestras de tumores no apareados adicionales que se recogieron originalmente de los sujetos suecas (Tabla S2A). Después de la normalización, las 23 muestras de tejido mostraron distribuciones de intensidad de señal muy similares, sin supervisión agrupación jerárquica en todo el conjunto de datos de la metilación del ADN mostró los dos grupos principales fueron compuestas cada una por un fenotipo; tumor o normal (Figura S1). Esta clara separación entre el CP y muestras normales indica un patrón de metilación del ADN diferentes entre los dos fenotipos.
Para identificar los DMC aberrantes en el cáncer de próstata, se realizó el análisis estadístico y redujo la selección de los sitios CpG en base a las diferencias de metilación del ADN ( Figura 1). Un total de 28,735 sitios CpG mostró significación estadística con FDR ajustado
P Hotel & lt; 0,05 y al menos 0,2 significa la diferencia entre la metilación del CaP y muestras normales (Tabla S3). Estos incluyen los DMC 28,735 20,187 sitios CpG hypermethylated (hiper-DMC) y 8.548 hypomethylated sitios CpG (hipo-DMCs) en los tumores en comparación con los tejidos normales. Curiosamente, el 69,5% de la hiper-DMC (14.038 sitios CpG) se encuentra en CGI, orillas CGI CGI o estantes, pero sólo el 37,0% de hipo-DMC se encontraron en estas regiones (exacta de Fisher de dos colas
p
& lt; 10
-44, Tabla 1A). Por otra parte, la distribución de hiper identificado y hipo-DMC en los tumores fue estadísticamente diferente entre los genes categorías región proporcionadas por el fabricante (exacta de Fisher de dos colas
p
= 2.0 × 10
-44; Tabla 1B ) [23]. Hyper-DMC se identificó con mayor frecuencia en las regiones promotoras proximales (incluyendo el sitio de inicio de transcripción [SST] 1500, TSS200, región 5 'no traducida [UTR] and1st exón) que hipo-DMC, sin embargo hipo-DMC se encuentra con más frecuencia en la no-promotor regiones (incluyendo el cuerpo de genes y 3'UTR).
Un total de 19.570 DMC situadas en las regiones génicas, correspondían a 7.031 genes únicos. Un total de 32 de los 67 genes se informó anteriormente en el CaP tener la hipermetilación del promotor fueron identificados en nuestra lista (Tabla S4) [10]. Este número es superior al número de genes comunes del método de M-NGS (20 genes comunes), que es algo sorprendente porque M-NGS proporciona una cobertura mejor práctica de CpG genómico (29,6%) sitios en comparación con el HM450 BeadChip (1,7%) [ ,,,0],16].
Se han comparado nuestros resultados con los conjuntos de datos publicados. Entre 28,735 DMC, un total de 1.175 sitios CpG estaban presentes en los BeadChips HM27 que se utilizaron en un estudio previo de CaP [18]. El análisis estadístico indicó que 1.157 (98,5%) de 1.175 sitios CpG mostraron significativamente diferente de metilación del ADN entre muestras tumorales y normales (FDR ajusta
P
& lt; 0,05) y todos estos 1,157 sitios CpG mostraron la misma dirección de cambio de metilación en los dos conjuntos de datos (928 hiper-DMC y 229 hipo-DMC, el cuadro S3).
Asociaciones DMC con Liberalizado de la Expresión génica en el CaP
Para encontrar la metilación aberrante del ADN que pueden causar gen cambio de expresión en el CP, que analiza los datos de expresión de genes entre nuestra lista de genes de DMC. Para aumentar la probabilidad de identificar los verdaderos positivos, sólo probamos los genes que cumplían los tres criterios. En primer lugar, más de un DMC fueron identificados en regiones promotoras proximales (TSS1500, TSS200, 5'UTR y exón primero) de un gen; segundo, al menos tres cuartas partes de estos múltiples DMCs en una región promotora del gen tenían la misma dirección de los cambios de metilación (hiper o hipometilación en CaP); tercero, al menos un DMC en una región promotora del gen tenía al menos 0,4 significa diferencia de metilación entre el cáncer y fenotipos normales. Sobre la base de estos criterios, se seleccionaron un total de 276 genes de 9.643 DMC que se encontraban en el promotor del gen regiones proximales y se pusieron a prueba disponibles 269 emparejaron los datos de expresión de genes [29]. Un total de 122 genes mostraron diferencias significativas en la expresión de genes entre muestras tumorales y normales (FDR ajustado
P Hotel & lt; 0,05 y la correlación inversa entre la metilación del ADN y el cambio de expresión; Tabla 2 y la Tabla S5). Este conjunto incluye siete genes de metilación conocidos en CaP, por ejemplo,
GSTP1, CAV1 y RARB
. Un total de 65 de los 122 genes que se haya confirmado la presencia de metilación diferencial en los datos HM27 [18]. Estos 65 genes confirmados en los datos HM27 mostraron la misma dirección de los cambios de metilación con nuestros datos HM450. Por otra parte, 55 de los 122 genes ha sido identificado como cDMRs en los datos de secuenciación de próxima generación de metilación (M-NGS) [16].
Confirmación de la hipermetilación del promotor AOX1 en muestras adicionales CaP
Entre el conjunto de 122 genes aberrantemente metilados,
AOX1
, que codifica la aldehído oxidasa 1 y está localizado en el cromosoma 2q33.1, fue el más significativamente reducido regulado genes en muestras de CaP, en base a los datos HM450 . Los cambios en la metilación del ADN y la expresión génica de
AOX1
entre CaP y los tejidos normales eran muy similares a
GSTP1
(Tabla 2). Un total de 13 de los 19 sitios CpG probado en el
AOX1
genes fueron identificados como hiper-DMC (FDR ajustado rango de
P
: 7.4 × 10
y -8~0.01 gama de diferencia media de metilación: 0.20~0.52) y 11 de estos 13 DMCs se encuentra en regiones promotoras proximales (Tabla 2 y Figura S2A) guía
Dos sitios CpG en el
AOX1
región promotora. también fueron confirmados como hiper-DMC en el conjunto de datos independiente HM27 (Tabla S3 y la Figura S2A) [18]. Mahapatra et al. también identificado este gen como un gen diferencialmente metilado usando la misma plataforma HM27 [20]. Kim et al. identificado una región diferencialmente metilado en
AOX1 Windows que se solapa con nuestros 13 sitios hiper-DMC, utilizando el método M-NGS en muestras de CaP [16]. Kim et al. También realizó la secuenciación de bisulfito de la
AOX1
promotor en dos líneas celulares de próstata, en el que se confirmaron las pruebas de metilación diferencial en
AOX1
. Sin embargo estado de metilación en muestras de tejido de CaP con una resolución de un solo nucleótido no se ha realizado todavía.
Por lo tanto, se utilizó la secuenciación de bisulfito para confirmar nuestro hallazgo en el
AOX1
de genes entre CaP adicional y normal de la próstata muestras de tejido (Tabla S2B). Que amplifica la
AOX1
región promotora, que incluía 5 hiper-DMC y se superponen con una isla CpG, entonces secuenciado después de la transformación bacteriana (Figura S2A). Los datos de una serie de ADN de control mostraron resultados fiables a partir de este conjunto de cebadores de secuenciación de bisulfito (Figura S2 B). Entre un total de 107 muestras de tejido de JHH incluyendo 54 muestras de CaP y 53 tejidos normales (51 pares emparejados), se observó la
AOX1
promotor del gen a ser en gran medida hypermethylated en muestras de CaP en comparación con los tejidos normales en toda la 34 sitios CpG probados (media de metilación en los 34 sitios CpG: CP
vs
normales = 0,73
vs
0,07, Figura 2A y la Tabla S6..); estas diferencias fueron estadísticamente significativas (FDR ajustado
P Hotel & lt; 8,8 x 10
-11). Hemos trazado la metilación media de los 34 sitios CpG en cada muestra tumoral y las muestras normales emparejados (
n = 51
, Figura S2C). Esta parcela se indica la casi totalidad de las muestras tumorales tenían mayor que el valor medio de 0,3 metilación en el
AOX1
promotor, mientras que el tejido normal adyacente emparejado tenía metilación relativamente baja (menos del valor de la metilación del 0,3 significa). Después de revisar estos datos, nos fijamos arbitrariamente un valor de corte de 0,3 para la asignación de
AOX1
la metilación del promotor para diferenciar entre un tumor del tejido normal (Figura 2B). La sensibilidad de la metilación del ADN en el
AOX1
promotor para la detección de CaP fue del 92,6% (50 de 54 muestras analizadas PCA) y el 94,3% del valor de predicción positivo. No fuimos capaces de calcular la especificidad en esta población de replicación, debido a que las muestras incluyeron los tejidos normales adyacentes de pacientes con CaP. Sin embargo, 50 de 53 (94,3%) de estas muestras normales mostraron resultados negativos de
AOX1
la metilación del promotor.
A. metilación promedio de 34 sitios CpG examinados en cada fenotipo. Las barras de error indican intervalos de confianza del 95% para cada sitio CpG. B. Distribución de
AOX1
promotor de la metilación en cada fenotipo. Cada círculo o cuadrado representa la metilación promedio de 34 a prueba sitios CpG en cada muestra de tejido a prueba.
Confirmación de la SPON2 Promotor Hipometilación en muestras adicionales CaP
SPON2
, que codifica espondina 2 y está situado en el cromosoma 4p16.3, fue el segundo gen más regulada de manera ascendente, entre el conjunto de 122 genes desregulados significativamente en el CaP, en base a los datos HM450. Un total de cinco sitios CpG en el
SPON2
promotor fueron identificados como hipo-DMC (FDR ajustado rango de
P
: 2,1 x 10
-14~8.0 × 10
-8 y gama media de diferencia de metilación: -0.20~-0.50) y estos cinco DMC también se encuentra en la región promotora LOC100130872 (Tabla 2)
metilación también confirmada del
SPON2
región promotora, que incluye cinco hipo-DMC y se encuentra en una orilla isla CpG, utilizando el mismo método de secuenciación de bisulfito se ha descrito anteriormente (Figura S3A). Los datos de una serie de ADN de control mostraron resultados fiables a partir de este conjunto de cebadores de secuenciación de bisulfito (Figura S3 B). Un total de 109 muestras de tejido jhh incluyendo 54 muestras de CaP y 55 tejidos normales (54 pares emparejados) en cuanto a
SPON2
la metilación del promotor. El resultado de la secuenciación de bisulfito mostró hipometilación del
SPON2
promotor del gen en muestras de CaP en comparación con los tejidos normales, y estas diferencias fueron estadísticamente significativas en 25 de los 27 sitios CpG prueba (metilación diferencia entre las muestras de CaP y tejidos normales significaría : -0.1 ~ -0.27, la Figura 3 y la Tabla S7). Sin embargo, los valores de metilación en este conjunto de 25 sitios CpG mostraron más variación que lo que hemos observado para el
AOX1
promotor (Figura 2A). Un total de 55 tejidos normales mostró metilación media ADN entre 0,46 y 0,81 en los 25 sitios CpG, pero las muestras PCA (
n
= 54) mostró metilación promedio de ADN entre 0,30 y 0,63. La metilación del ADN de la
SPON2
promotor no mostró ninguna asociación con los parámetros clínico-patológicos, como la edad en el momento de la cirugía, la puntuación de Gleason y el estadio TNM en muestras de CaP y tejidos normales (datos no mostrados).
cada círculo o cuadrado representa la metilación promedio de 27 sitios CpG examinados en cada fenotipo. Las barras de error indican intervalos de confianza del 95% para cada sitio CpG.
DMC asociados a propiedades Clinicopathological
Para identificar los sitios CpG asociados a propiedades clinicopatológicas, se compararon los datos de metilación de las muestras con CaP calificación o el estado de la recurrencia bioquímica (BCR) Gleason. En primer lugar, las muestras de CaP se dividieron por puntuación de Gleason (Gleason menor de 6 y 3 + 4 vs superior Gleason 4 + 3, 9, 10). Un total de 245 sitios CpG se identificaron como Gleason DMC asociados (FDR ajustado
P Hotel & lt; 0,05), pero sólo 40 sitios CpG mostraron mayor que 0,2 la diferencia entre la metilación más alta y más baja de Gleason CaP significan (Tabla S8) . los datos de expresión génica de 22 genes que habían Gleason DMC asociados en las regiones génicas fueron probados para la asociación con puntuación de Gleason en muestras de CaP. Entre estos 22 genes analizados, sólo el
PPARGC1A
mostraron diferencias significativas de la expresión génica entre los tumores con Gleason baja en comparación con Gleason mayor CaP (FDR ajustado
P = 0,022
). Además, la metilación de
PPARGC1A
(cg12691631) se correlacionó inversamente con la expresión de genes (Figura S4)
Las comparaciones entre BCR (recurrencia bioquímica;. Definida como la detección de PSA total mayor que 0,2 ng /ml después de la cirugía) y grupos no identificados BCR sólo dos sitios CpG como DMC (cg11385353 en
AGXT Opiniones y cg14218447 en una región intergénica) utilizando FDR ajustado
P Hotel & lt; 0,05 y mayor que 0,2 media metilación diferencia entre dos grupos. Estos dos sitios CpG mostraron diferencia significativa después del ajuste para la información del tratamiento. Sin embargo, la expresión de genes de
AGXT
no mostró diferencias entre BCR y no BCR primaria del CP (datos no mostrados).
Discusión
Hemos probado la metilación del ADN en más de 480.000 sitios CpG utilizando el HumanMethylation450 BeadChip en muestras de CaP y tejidos normales. Se identificaron con éxito 28,735 sitios CpG metilados diferencialmente en el CP. Muchos de los DMC identificados eran réplicas independientes de los resultados anteriores de la metilación del ADN diferencial en el CaP [16], [18]. En la primera, el 98,5% (1.157 de 1.175) de los sitios CpG comunes que estaban presentes en nuestra lista de DMC y el HM27 BeadChip mostró diferencias significativas en la metilación del conjunto de datos anterior [18]. En la segunda, un total de 1.014 fuera de 2.481 (40,9%) regiones metilados específicos del cáncer que fueron identificados usando el método M-NGS en el CaP, se superpuso con nuestros DMC [16]. Al considerar las enormes diferencias en la cobertura práctica CpG de estos dos métodos (M-NGS
vs
. HM450:29.6%
vs
. 1,7%), la tasa de concordancia del 40,9% puede ser considerada muy alta.
la distribución de DMC en el HM450 mostró un patrón similar a la distribución de DMC en una línea celular de cáncer de colon [22]. Sandoval et al. encontraron que los sitios CpG más hypermethylated se localizaron en CGI, orilla CGI y CGI regiones de la plataforma, mientras que más de la mitad de los sitios CpG hypermethylated identificadas fueron en las regiones promotoras proximales. Nuestros datos eran consistentes con la observación de que, lo que demuestra que el 69,5% de la hiper-DMC se encuentra en CGI, orilla CGI y CGI regiones de la plataforma, mientras que el 52,4% de la hiper-DMC se indentified en regiones promotoras proximales.
han dado cuenta de que un total de 6.907 sitios CpG ensayadas por el BeadChip HM450 pasar a ser ubicado dentro de polimorfismo de nucleótido único loci (SNP). Un total de 336 sitios CpG entre los 28,735 DMC que hemos identificado también se encuentra en loci SNP como se indica en la Tabla S3. Por lo tanto se requiere una atención especial para interpretar todas las asociaciones observadas con estos 336 DMC.
optó por limitar nuestro análisis a la región promotora proximal ya que esta región está bien caracterizado por sus efectos de la metilación del ADN en el silenciamiento de genes. Este enfoque también nos permitió evaluar las asociaciones con cambios de expresión génica en base a un conjunto de datos CaP independiente, basándose en la suposición de que las correlaciones inversas entre la metilación del promotor y la expresión génica pueden indicar plausiblemente un resultado funcional de los genes diferencialmente metiladas identificados en CaP. Este enfoque identificado un total de 122 genes conocidos incluyendo siete genes de metilación del ADN en el CP. Como confirmación positiva de nuestro enfoque,
se encontró GSTP1
, que es el gen hypermethylated estudiado más a fondo en el CaP ser hypermethylated en este análisis (Tabla 2). Un total de 7 de cada 15 sitios CpG en el HM450 BeadChip fueron identificados como hiper-DMC (rango de diferencia de medias metilación: 0,27 ~ 0,48) en el
GSTP1
gen (Tabla S3). El ARN mensajero de la
GSTP1
gen ha sido previamente demostrado ser significativamente reducido regulado en el CaP primario y los tumores metastásicos mostrar más baja regulación [29].
El aldehído oxidasa 1 (
gen AOX1) está involucrada en varias rutas metabólicas, incluyendo el metabolismo de fármacos y la generación de especies reactivas del oxígeno [34] - [36]. expresión de la proteína AOX1 reducido en la pancreatitis crónica y una ausencia de expresión de la proteína AOX1 en el cáncer de páncreas se ha informado [34]. Además, se detectó disminución de la expresión de proteínas AOX1 en el carcinoma hepatocelular y esta desregulación de la expresión de AOX1 se asoció con el estadio del tumor y el estado metastásico [37]. Aberrante hipermetilación del ADN de la
AOX1
región promotora se informó recientemente en el cáncer de colon y el CP [16], [18], [20], [38], [39]. En el contexto de estos datos publicados anteriores, nuestros datos apoyan aún más el papel de la metilación aberrante del ADN en el
AOX1
promotor de tumores CaP, mientras que también proporciona la cobertura más completa de los DMC en este gen hasta la fecha.
las diferencias observadas de la metilación del ADN en el promotor de la
AOX1
entre las muestras de CaP y tejidos normales fueron notables. Esta región promotora mostró un patrón de metilación muy consistente en 34 sitios CpG que abarca 400 pares de bases de cada fenotipo. Esta localización genómica puede ser objeto de evaluación por medio de otros ensayos, como la pirosecuenciación o metilación específica de PCR
La mayoría de los tumores PCA (92,6%; la sensibilidad). Se observa que tienen la metilación del ADN positivo, con un recorte medio de metilación a la altura de 0,3 y el 94,3% de los tejidos normales que muestran la metilación del ADN negativa con el mismo corte. Esta sensibilidad de
AOX1
metilación fue similar a otros genes metilados bien conocidos que incluyen
GSTP1
y
RARB
que se ensayaron usando métodos Pyrosequencing [40]. Esta alta sensibilidad de
AOX1
metilación del promotor y las enormes diferencias de metilación del ADN entre muestras de CaP y tejidos normales sugiere la utilidad potencial de este gen como un biomarcador para el diagnóstico de CaP.