Extracto
factor de crecimiento transformante β (TGF) derivado de los induce microambiente tumoral fenotipos malignos tales como la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la motilidad celular aberrante en los cánceres de pulmón. translocación inducida por TGF de β-catenina de complejos de E-cadherina en el citoplasma está involucrado en la transcripción de genes diana de EMT. PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina eliminan del cromosoma 10) es conocido por ejercer actividad de la fosfatasa mediante la unión a los complejos de E-cadherina a través de β-catenina, y estudios recientes sugieren que la fosforilación de la cola PTEN C-terminal podría causar la pérdida de esta actividad fosfatasa PTEN . Sin embargo, si TGF puede modular tanto la translocación de β-catenina y la actividad de la fosfatasa PTEN través de la fosforilación de la PTEN C-terminal sigue siendo difícil de alcanzar. Además, el papel de la fosforilación de la PTEN C-terminal en fenotipos malignos inducidos por TGF no ha sido evaluado. Para investigar si la modulación de la fosforilación de la PTEN C-terminal puede regular fenotipos malignos, aquí establecimos las células de cáncer de pulmón que expresan la proteína PTEN con la mutación de los sitios de fosforilación en la PTEN C-terminal (PTEN4A). Hemos encontrado que la estimulación TGF produjo un aumento de dos veces en la relación fosforilada -PTEN /PTEN. La expresión de PTEN4A reprimida EMT inducida por TGF y la motilidad celular, incluso después de la expresión de caracol. Nuestros datos muestran que PTEN4A podría reprimir EMT a través del bloqueo completo de la translocación β-catenina en el citoplasma, además del efecto inhibidor de PTEN4A sobre la activación inducida por TGF de vías de señalización Smad-independiente. En un modelo de xenoinjerto, la relación de crecimiento del tumor fue reprimido en células que expresan PTEN4A. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que los sitios de fosforilación en la PTEN C-terminal pueden ser una diana terapéutica para fenotipos malignos inducidos por TGF en células de cáncer de pulmón
Visto:. Aoyama D, Hashimoto N, Sakamoto K, T Kohnoh , Kusunose M, Kimura M, et al. (2013) La participación de la fosforilación inducida por TGF de los PTEN C-terminal de TGF-inducida por la adquisición de fenotipos malignos en las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (11): e81133. doi: 10.1371 /journal.pone.0081133
Editor: Yulia Komarova, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Mayo, 2013; Aceptado: October 18, 2013; Publicado: 22 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Aoyama et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de la vida y Kowa subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) (21590987 y 24591162). Este estudio fue apoyado en parte por una subvención a las enfermedades pulmonares difusas grupo de investigación del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la evidencia creciente sugiere la importancia del microambiente del tumor en el que las células de cáncer de pulmón interactúan con fibroblastos de carcinoma asociado (CAF) y la matriz extracelular (ECM) y por lo tanto adquirir diferentes fenotipos malignos, incluyendo la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la motilidad celular aberrante [1,2]. Factor de crecimiento transformante β (TGF), uno de los factores de rigidez de tejidos más críticos derivados del microambiente del tumor, hace que la adquisición de fenotipos malignos, acompañado de la expresión alterada de genes relacionados con el EMT como caracol [3]. Un estudio reciente sugiere que la transcripción inducida por TGF de EMT genes diana tales como la fibronectina y vimentina es acelerado por la translocación de β-catenina de complejos de E-cadherina en la membrana celular en el citoplasma [4]. estimulación TGF también causa la motilidad celular aberrante aunque las vías de Smad-independientes, tales como las que implican la quinasa de adhesión focal (FAK) y fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) [5,6]. Aunque muchas de las vías Smad-independientes en el microambiente del tumor están regulados negativamente por las actividades concertadas de lípidos y proteína fosfatasa de PTEN (fosfatasa y tensina homólogo borrados del cromosoma 10) [7], los cánceres de pulmón, en la que se observa raramente mutación del gen PTEN [8,9], muestran a menudo la hiperactivación de estas vías [9-11]. Aunque PTEN ejerce su actividad de la fosfatasa mediante la unión a los complejos de E-cadherina a través de β-catenina [12], estudios recientes han sugerido que la fosforilación de la cola PTEN C-terminal puede estar estrechamente asociado con la pérdida de actividad PTEN [13]. Rahdar et al. sugerido que la sustitución con residuos de cuatro alanina (Ala), lo que resulta en la eliminación de los sitios de fosforilación de serina /treonina correspondientes (S380A, T382A, T383A y S385A), asociación de membrana mejorada de PTEN con una conformación abierta [14]. Algunas vías de señalización pueden modular la expresión de PTEN, lo que resulta en la disminución de la actividad de la fosfatasa PTEN [15,16]; sin embargo, si TGF puede modular tanto la translocación β-catenina y la actividad de la fosfatasa PTEN través de la fosforilación de la PTEN C-terminal sigue siendo difícil de alcanzar. Además, la función exacta de la fosforilación del PTEN C-terminal en EMT inducida por TGF y la motilidad celular aberrante no ha sido evaluado completamente. En el presente estudio, se investigó si TGF puede modular la fosforilación de la PTEN C-terminal en células de cáncer de pulmón y si cuatro Ala sustitución en el terminal PTEN C- (PTEN4A) podría inhibir EMT inducida por TGF y la motilidad celular aberrante relacionados. Además, se analizó el mecanismo, es decir, si PTEN4A puede modular los complejos de unión cadherina y vías de señalización subyacente. También se evaluó el efecto de la inducción de compensación de PTEN4A sobre el crecimiento tumoral
in vivo
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Materiales y Métodos
Declaraciones éticas
Todos los estudios con animales han sido revisados y aprobados por el Comité Universitario de Uso y Cuidado de los Animales en la Universidad de Nagoya Facultad de Medicina.
también fueron conducidos de acuerdo con las directrices institucionales, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Todos los animales fueron alojados individualmente en una instalación de barrera estéril con fade-in /fade-out de 12 horas de luz: 12 horas de oscuridad. Cuando los ratones se sacrificaron después de los experimentos, los ratones fueron sacrificados con una sobredosis de anestésico, seguido por dislocación cervical inmediata, para minimizar el sufrimiento.
Materiales
monoclonal de ratón anti-anticuerpos PTEN (clon 6H2.1) era de Cascade Bioscience (Winchester. Reino Unido). conejo purificado anti-PTEN-fosfo (/Thr382 /Thr383 Ser380) anticuerpo, conejo anti-pan anticuerpos Akt, anti-Akt-fosfato, anticuerpo anti-Akt-fosfato, anticuerpo anti-FAK anticuerpo de conejo (Thr308) de conejo (Ser473) de conejo , (Tyr397) anticuerpo de conejo-fosfo-FAK anti, anticuerpo anti-Smad2 ratón y de conejo anti-fosfo-Smad2 (Ser465 /467) de anticuerpos eran de Cell Signaling Technology (Boston, MA). anticuerpo anti-fibronectina purificada era de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). anticuerpo de ratón anti-E-cadherina purificada y el anticuerpo anti-β-catenina eran de BD Biosciences (San Diego, CA). Estreptavidina (SAV) -Alexa 594 (SAV-594) y conjugado anticuerpo anti ratón era de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). anticuerpo monoclonal de ratón anti-vimentina era de Millipore (Cambridge, Reino Unido). Affinity-aislado anticuerpo de conejo anti-actina y SB 431542, un potente inhibidor de tipo TGF I receptor quinasas, fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Puede recibir la señal era de Toyobo Co. (Tokio, Japón). La doxiciclina era de Clontech (Mountain View, CA). PhosSTOP y WST-1 eran de Roche Applied Science (Mannheim, Alemania). Hoechst33342 era de Dojindo (Kumamoto, Japón). 1,2,4,5-bencenotetramina tetrahidrocloruro (FAK inhibidor 14) era de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido).
Los plásmidos y transfección génica
PTEN Humano (NM_000314) cADN se subclonó en el vector pEGFP-C1 (Clontech, Mountain View, CA). GFP o una fusión con el gen de GFP-PTEN se colocó en el vector pTRE-Tight (Clontech; Mountain View, CA), respectivamente. El QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene; La Jolla, CA) fue utilizado para el establecimiento de cuatro Ala sustitución (S380A, T382A, T383A y S385A) en la cola PTEN C-terminal (PTEN4A). Por último, GFP en el vector pTRE-Tight (GFP), GFP-PTEN en el vector pTRE-Tight (GFPPTENWt), y GFP-PTEN4A en el vector pTRE-Tight (GFPPTEN4A) se establecieron en este estudio. Después del establecimiento de células H358, la línea celular de cáncer de pulmón humano, llevando pTet-On Avanzada (H358ON), GFP, GFP-PTENWt, o GFP-PTEN4A fue co-transfectadas con el higromicina marcador lineal (Clontech; Mountain View, CA) , mediante el uso de Nucleofector ™ II (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, MD). Después de la selección con higromicina, los clones individuales fueron aislados. PTEN humana también se colocó en pcDNA4 (Invitrogen Life Technologies; Carlsbad, CA). células H1299, la otra línea celular de cáncer de pulmón humano, se sometieron a electroporación con pcDNA4 solamente (4HC), pcDNA4 con PTENWt (PTENWt) o con pcDNA4 PTEN4A (PTEN4A) mediante el uso de Nucleofector ™ II. Después de la selección con zeocina, se aislaron clones individuales.
Las células
Las líneas de células de pulmón humano, H358 y H1299, se mantuvieron en RPMI suplementado con 2 mmol /L de L-glutamina, 100 U /ml de penicilina , 100μg /ml de estreptomicina, 0.25μg /ml de fungizona, y 10% de FCS [17]. Para evaluar el efecto de TGF en estas células, las células se trataron con TGF en 2 ng /ml y se analizaron para los niveles de ARNm y los niveles de proteína en los puntos de tiempo indicados y se describe a continuación. Para evaluar el efecto de la transducción de PTEN en la estimulación TGF, las células que expresan GFP H358ON Dox-dependiente, GFP-PTENWt, o GFP-PTEN4A se incubaron con Dox a 1 g /ml durante 24 horas antes del tratamiento TGF como se describe anteriormente. Para examinar los efectos directos de la estimulación TGF en la modulación de la relación de p-PTEN /PTEN, las células fueron incubadas con vehículo o SB 431542 durante 1 hora antes del tratamiento TGF. Para examinar el papel de la fosforilación de FAK en EMT inducida por TGF, las células fueron incubadas con vehículo o inhibidor de FAK 14 durante 24 horas antes del tratamiento TGF.
La migración de células de ensayo
Un tamaño de poro de cámara de Boyden-8 micras se utilizó para el ensayo in vitro la migración [18]. Después de ser tratado con Dox durante 24 horas, las células (3x10
4 células) en medio RPMI que contenía 0,5% de suero y TGF a 2 ng /ml se sembraron en la cámara superior y 15% de suero bovino fetal (FCS) en RPMI fue introducido en la cámara baja como un quimioatrayente.
análisis de PCR para la expresión de genes dirigidos
PCR en tiempo real se realizó utilizando un sistema TaqMan ABI 7300 de detección de secuencias (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). se detectaron, y glyceraldehydes-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) mRNAs, mediante el uso de una mezcla de cebadores de oligonucleótidos y sondas de Nippon EGT, Inc (Toyama, Japón): caracol (NM_005985), torsión (NM_000474 TWIST1). los niveles de mRNA se normalizaron a GAPDH mRNA señal [19].
Western blot análisis
Para los extractos de células enteras, se recogieron las células en tampón de lisis enfriado en hielo y aprobados por centrifugación [20,21]. Las muestras se sometieron luego a SDS-PAGE y se analizaron por inmunotransferencia. Para detectar los niveles de fosforilación de las proteínas específicas, Phosphostop se añadió al tampón de lisis y se puede obtener de la señal también se añadió a la solución de dilución para el anticuerpo primario y anticuerpo secundario. β-actina se evaluó como control de carga.
WST-1 ensayo
El reactivo de proliferación celular WST-1 se utilizó para la determinación cuantitativa de la proliferación celular [18]. La absorbancia de las muestras se midió a 450 nm usando un spectrofluorophotometer (Wallac 1420 ARVO SX-; PerkinElmer, Inc., Waltham, MA). A menos que se indique lo contrario, el medio solo se midió como un control de fondo.
inmunofluorescencia y microscopía confocal de barrido láser
Immunochtochemistry se llevó a cabo como se informó anteriormente [22]. Para evaluar el efecto de PTEN4A transducción en la translocación inducida por TGF de β-catenina, las células H358ON expresan Dox dependiente de GFP, GFP-PTENWt, o GFP-PTEN4A se incubaron con anticuerpo anti-β-catenina seguido de SAV-594 conjugado de ratón anti anticuerpo. tinción nuclear se realizó por Hoechst 33342. Para determinar los niveles de distribución β-catenina, la microscopía de barrido láser confocal (LSM 5 PASCAL; Carl Zeiss Co., Ltd, Jena, Alemania) se utilizó. Las intensidades de fluorescencia de β-catenina y el núcleo se evaluaron mediante el uso de imágenes de software (Software LSM ZEN 2008; Carl Zeiss Co., Ltd, Jena, Alemania). Para llevar a cabo la observación visual de la fluorescencia, intensidad de fluorescencia más de una sección transversal aleatoria de las células se representaron [23,24]. Para determinar los niveles de PTEN distribución subcelular, también se utilizó microscopía confocal de barrido láser. También se cuantificaron los niveles de intensidad de fluorescencia de GFP tanto en el citoplasma y el núcleo, utilizando el software de imágenes. Un mínimo de 5 campos de alta potencia seleccionados al azar fueron examinados por muestra para medir la intensidad de la fluorescencia en el núcleo y el citoplasma [25].
modelo de xenoinjerto de ratón
3x10
6 H358ON células que expresan Dox-dependientes vía subcutánea GFP, GFPPTENWt, o GFPPTEN4A, se inocularon (sc) en el flanco del desnudo femenino de 6 semanas de edad ratones y después se mantuvo en el agua con Dox a 2 mg concentración final /ml y ad libitum en autoclave. El crecimiento se siguió a lo largo del tiempo mediante la adopción de medidas de calibre en los tiempos indicados como se describe anteriormente [26,27]. Cada experimento utilizó 5 ratones desnudos para GFPPTENWT, 7 ratones desnudos para GFP y 7 ratones desnudos para GFPPTEN4A. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes.
El análisis estadístico
Los resultados se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney para la comparación entre los dos grupos, y por sus equivalentes no paramétrico de análisis de la varianza (ANOVA) para comparaciones múltiples. Un valor de p & lt;. 0.05was considerados para indicar la significación estadística
Resultados
TGF modula los niveles de fosforilación de PTEN C-terminal en la expresión de PTEN en células H358, seguido de la EMT y la motilidad celular aberrante
para evaluar EMT inducida por TGF en células de cáncer de pulmón [28,29], el análisis de Western blot para la fibronectina [4,30] y e-cadherina [4,29] se realizó. análisis de transferencia de Western demostró que el tratamiento TGF indujo un aumento de aproximadamente 12 veces en la expresión de fibronectina en las células ingenuas H358 en comparación con vehículo, mientras que la expresión de E-cadherina en células tratadas con TGFβdecreased en más de un 20% en comparación con los tratados con vehículo; Por lo tanto, la estimulación TGF produjo más de una relación de 15 veces mayor fibronectina /E-cadherina en células ingenuas H358 en comparación con vehículo (Figura 1A). Para evaluar la asociación entre la EMT inducida por TGF y la capacidad de migración, se realizó un ensayo de migración. ingenuo células H358 tratadas con TGFβat 2 ng /ml mostraron un aproximadamente 20 veces mayor capacidad de migrar hacia un quimioatrayente, en comparación con los tratados con vehículo (Figura 1B). Estudios recientes sugieren que la translocación de β-catenina en el citoplasma induce directamente
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expresión de genes mesenquimales en las células epiteliales [4,31]. Por lo tanto, la localización de β-catenina también se evaluó en células de cáncer de pulmón tratados con TGF por inmunofluorescencia. Inmunofluorescencia imágenes obtenidas por microscopía confocal sugirieron que β-catenina fue localizado en la membrana celular en las células ingenuas H358 tratados con no TGF (Figura 1C y 1D), mientras que se observó la translocación de β-catenina en el citoplasma en las células ingenuas H358 tratadas con TGF, acompañado por la co-localización de β-catenina con Hoechst33342 (Figura 1C y 1D). Para evaluar las vías de señalización TGF-inducida, se realizó el Western Blot. TGF indujo un aumento de la fosforilación de Smad2 que comienza en 5 minutos y alcanzando un máximo a 1 hora, después de lo cual fosforilados Smad2 expresión se mantuvo en un nivel constante durante un máximo de 6 horas (Figura 1E). Para evaluar el efecto de la estimulación en las vías TGF-Smad independiente, la activación de Akt y FAK también se analizó por transferencia Western. tratamiento TGF indujo el aumento de la fosforilación de Akt en Thr308 y Ser473 (Akt308 y Akt473) a partir de 20 minutos y alcanzando un nivel máximo a 1 a 3 horas (Figura 1f); por el contrario, no se observó aumento de la fosforilación de FAK en Tyr397 a las 6 horas y alcanzó un nivel máximo en un 12 a 24 horas (Figura 1G). Además, se evaluó el efecto de TGF en ambos niveles de expresión de PTEN y la fosforilación de PTEN (p-PTEN) en su extremo C-terminal en células de cáncer de pulmón. Los resultados mostraron que el tratamiento con TGF ligeramente pero sustancialmente aumentó la fosforilación de PTEN en su C-terminal y también disminuyó los niveles totales de PTEN en H358 ingenuo células, produciendo así un aumento de dos veces en la relación /PTEN p-PTEN 24 horas después del tratamiento TGF ( la Figura 1H). Para evaluar si TGF puede modular directamente la relación de p-PTEN /PTEN, H358 células se trataron con SB 431542, un potente inhibidor de tipo TGF I receptor quinasas [32]. El tratamiento con SB 431542 inhibe con éxito el aumento inducido por TGF en la relación de p-PTEN /PTEN (Figura 1I), una conclusión apoyada por los datos que muestran que el tratamiento con 10 mM SB 431542 activación Smad2 inhibida (datos no mostrados). Por lo tanto, un aumento inducido por TGF en la relación de p-PTEN /PTEN podría estar implicada en la adquisición inducida por TGF de fenotipos malignos en las células de cáncer de pulmón. se recogieron las células H358
(A) tratados con vehículo o TGF para el análisis de la fibronectina y E-cadherina. La expresión relativa de la fibronectina a E-cadherina (relación F /E) se muestra en comparación con la de las células tratadas con vehículo. Los datos mostrados representan la media ± EE. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 (B) Un ensayo de migración se llevó a cabo para la línea celular H358 tratadas con vehículo o TGF. Los datos mostrados representan las medias ± SD. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 Las intensidades de fluorescencia de β-catenina (roja) en las células tratadas se evaluaron mediante el uso de láser confocal de microscopía de barrido y software de imágenes. tinción nuclear se realizó por Hoechst33342 (azul). La imagen de la izquierda en (C) muestra células sin estimulación TGF. La imagen de la derecha de (C) muestra las células estimuladas con TGF. Las células incubadas con el control de isotipo IgG se muestra en el recuadro en (C). El panel superior en (D) representa la intensidad de fluorescencia de β-catenina (rojo) y el núcleo (azul) en una sección transversal de las células sin estimulación TGF. El panel inferior en (D) representa la intensidad de fluorescencia de β-catenina (rojo) y el núcleo (azul) sobre una sección transversal de las células estimuladas con TGF. Estas cifras son representativos de al menos tres experimentos independientes. (E, F y G) Los extractos celulares fueron cosechadas en los períodos indicados después del tratamiento con TGF para el análisis de los niveles de Smad2 total y fosforilada (E), Akt473 (F), Akt308 (F), y FAK (G). Los resultados se muestran para células de los animales H358 a 0 minutos (carril 1), 5 minutos (carril 2), 20 minutos (carril 3), 1 hora (carril 4), 3 horas (carril 5), 6 horas (carril 6), 24 horas (carril 7) y 48 horas (carril 8) después del tratamiento con TGF (izquierda en e, F, y G). La relación de proteína fosforilada de la proteína total se presenta como el nivel de intensidad en relación con la de las células naïve H358 a 0 minutos (carril 1) después del tratamiento con TGF (a la derecha en E, F, y G). Los datos mostrados representan la media ± EE. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 (H) células tratadas con vehículo o TGF durante 0 minutos o 24 horas se recogieron para el análisis de PTEN fosforilada (pPTEN) y PTEN total. La expresión relativa de pPTEN al total de PTEN (relación /PTEN pPTEN) se muestra en comparación con la de las células tratadas con vehículo para 0 minutos. Se muestra una blot representativo de tres experimentos independientes. Los datos mostrados representan la media ± EE. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 N.S. indica "no es significativo". células naïve (I) H358 se incubaron con vehículo o SB 431542 en 10 mM durante una hora antes del tratamiento TGF. relación pPTEN /PTEN se muestra en comparación con la de las células tratadas con vehículo. Se muestra una blot representativo de tres experimentos independientes. Los datos mostrados representan la media ± EE. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 N.S. indica "no es significativo".
La mutación de los sitios de fosforilación de PTEN en el C-terminal reprime la EMT y la aberración motilidad de las células TGF-inducida en células H358
Para confirmar los efectos biológicos de TGF fosforilación inducida de la PTEN C-terminal en células de cáncer de pulmón, se investigó si la mutación de los sitios de fosforilación en PTEN puede afectar tanto EMT inducida por TGF y la capacidad de migración de las células de cáncer de pulmón mediante el uso de un sistema de expresión de genes dependiente de Dox porque varios PTENWt modelos de reconstitución han sugerido que PTENWt transducción podría inducir una relación de crecimiento lento en las células de glioma [15]. En primer lugar para comprobar que cuatro Ala sustitución inhibe la fosforilación del PTEN C-terminal en
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proteína PTEN inducida por Dox, el Western Blot se realizó en células que expresan H358ON Dox dependiente de GFP, GFP-PTENWt, o GFP -PTEN4A en ausencia o en presencia de Dox. Aunque
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GFP-Dox dependiente de Dox-dependiente-GFP o GFP-PTENWt PTEN4A cuando se añadió Dox, fosforilada GFP-PTEN se detectó sólo en las células que expresan H358ON se observó expresión de GFP-PTEN en las células que expresan H358ON PTENWt (Figura 2A). Dado que los estudios recientes sugieren que el PTEN no fosforilada puede estar sujeto a la ubiquitinación, lo que resulta en la translocación en el núcleo [21], se evaluó la localización de la fluorescencia de GFP en las células que expresan H358ON Dox dependiente de GFP, GFP-PTENWt y GFP-PTEN4A. GFP solo se expresó de forma difusa en el citoplasma y el núcleo (a la izquierda en la Figura 2B y 2C), mientras que GFP-PTENWt y GFP-PTEN4A se encuentran principalmente en el citoplasma con expresión débil nuclear (centro y derecha en la Figura 2B, respectivamente, y 2C). No hubo diferencia en la relación núcleo /citoplasma de la fluorescencia de GFP entre GFP-PTENWt y GFP-PTEN4A (Figura 2C). Para evaluar si o no EMT inducida por TGF puede ser modulada por
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expresión de GFP-PTEN, se realizó un análisis Western Blot de la fibronectina y E-cadherina. No hubo una reducción en la proporción fibronectina /E-cadherina en células que expresan GFP solo y una reducción parcial (31,8%) en los que expresan GFP-PTENWt; sin embargo,
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proteína GFP-PTEN4A inducida por Dox causó una disminución significativa de alrededor de 75% en la proporción fibronectina /E-cadherina (Figura 2D). Para evaluar si GFP-PTEN4A puede afectar la motilidad celular inducida por TGF-, se realizó un ensayo de migración. En las células H358ON, el aumento inducido por TGF en la migración hacia un quimioatrayente no fue inhibida por cualquiera de GFP o la proteína GFP-PTENWt inducida por Dox, mientras que
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GFP-PTEN4A proteína reprimida la migración celular inducida por la estimulación TGF ( Figura 2E). Estos resultados indican que la inhibición de la fosforilación del PTEN C-terminal puede reprimir EMT inducida por TGF y el bloque de la motilidad celular aberrante en las células de cáncer de pulmón, más allá del efecto de PTEN transducción sí observados en las células que expresan PTENWt. células H358ON
(A) que expresan GFP Dox-dependiente, GFP-PTENWt, o GFP-PTEN4A fueron incubadas con vehículo o Dox durante 24 horas antes del tratamiento TGF. Las células se trataron entonces con vehículo o TGF durante otras 24 horas en ausencia o en presencia de Dox. Las células se recogieron para el análisis de pPTEN (panel superior), PTEN total (panel central) y β-actina (panel inferior) por transferencia de Western. Se muestra una blot representativo de tres experimentos independientes. (B) Mediante el uso de láser microscopía confocal de barrido, la localización de la fluorescencia de GFP en las células que expresan GFP tratada H358ON-Dox (panel izquierdo), se evaluó GFP-PTENWt (panel central) y GFP-PTEN4A (panel derecho). Los niveles de intensidad de fluorescencia de GFP tanto en el citoplasma y el núcleo (C) también se cuantifica, por software de imágenes. La intensidad de fluorescencia se expresa como la relación núcleo /citoplasma para cada muestra. Los datos mostrados representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. *: P & lt; 0,05 N.S. indica "no es significativo". células H358ON (D) que expresan GFP Dox-dependiente, GFP-PTENWt, o GFP-PTEN4A se trataron con vehículo o TGF para 48 horas en ausencia o en presencia de Dox, y después se recogieron para el análisis de la fibronectina, E-cadherina, y β -actina por el Western Blot. La relación F /E se muestra en comparación con la de las células tratadas con vehículo en ausencia de Dox. Se muestra una blot representativo de tres experimentos independientes. Los datos mostrados representan la media ± EE. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 N.S. indica "no es significativo". (E) Un ensayo de migración se llevó a cabo para H358ON células que expresan GFP Dox-dependiente, GFP-PTENWt, o GFP-PTEN4A en ausencia o en presencia de Dox y /o la estimulación TGF. Los datos mostrados representan las medias ± SD. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 N.S. indica "no significativo".
La mutación de los sitios de fosforilación en la PTEN C-terminal inhibe las vías Smad independiente de TGF-inducida, pero no la vía Smad-dependiente en células H358
para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes, se evaluó el efecto de la GFP-PTEN4A en vías de señalización inducidas por TGF. Ni
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GFP, GFP-PTENWt, ni la expresión de GFP-PTEN4A inducida por Dox reprime el aumento de la fosforilación de Smad2 en las células tratadas con TGF H358ON (Figura 3A). El aumento de la fosforilación de Akt en células H358ON tratados con TGF expresar Dox dependiente de GFP-PTENWt y GFP-PTEN4A volvió al nivel basal o inferior cuando se añadió Dox, mientras que en TGF tratos células H358ON que expresan GFP Dox-dependiente no hicieron cambio cuando se añadió Dox (Figura 3B). Cabe señalar que la GFP-PTEN4A reprimió de manera constante los niveles de Akt fosforilada, en comparación con GFP-PTENWt (GFP-PTEN4A, 88% de disminución en Akt473 y 79% de disminución en Akt308; GFP-PTENWt, 74% de disminución en Akt473 y 68% de disminución en Akt308) (Figura 3B). El nivel de fosforilados FAK en células H358ON que expresan GFP o GFP-PTENWt no se vio alterada cuando se añadió Dox, mientras que en las células H358ON tratados con TGF expresan GFP-PTEN4A regresó con éxito al nivel basal cuando se añadió Dox TGF-tratado (Figura 3C).
Los extractos celulares a partir de células que expresan H358ON Dox dependiente de GFP, GFP-PTENWt, o GFP-PTEN4A en ausencia o presencia de Dox se recogieron para el análisis de los niveles de total y fosforilada por Smad2 (A), Akt473 (B), Akt308 (B), y FAK (C) en los períodos indicados después del tratamiento con vehículo o TGF (1 hora de Smad2, 1 hora para Akt473, 1 hora para Akt308, y 24 horas de FAK, respectivamente). Una mancha representante de tres experimentos independientes se muestra (arriba en A, B y C). La relación de proteína fosforilada de la proteína total se presenta como el nivel de intensidad en relación con la de las células que expresan GFP H358ON Dox dependiente tratados con vehículo en ausencia de Dox (parte inferior en A, B y C). Los datos mostrados representan la media ± EE. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 N.S. indica "no es significativo".
Un inhibidor de FAK focalización Tyr397 bloques TGF-inducida por la motilidad celular aberrante, pero no EMT inducida por TGF en células H358
Debido a PTEN4A reprimió los niveles de fosforilados FAK en Tyr397 inducida por TGF, que determina si la inhibición de la activación de FAK inducida por TGF puede rescatar EMT y bloquear motilit celular aberrante. En primer lugar, las células se trataron con FAK inhibidor 14, dirigida al sitio Tyr397 de FAK [33], que inhibe la fosforilación de FAK con éxito inducida por TGF en Tyr397 de una manera dependiente de la dosis (Figura 4A). La inhibición de la actividad de FAK inducida por TGF por FAK inhibidor de 14 rindió reprimida la motilidad celular inducida por TGF (Figura 4C), pero no afectó a la adquisición de fenotipos EMT se mantuvo persistente (Figura 4B). Además, confirmamos que TGF-β induce la translocación-catenina en el citoplasma y el núcleo no fue bloqueado por el tratamiento con inhibidor de FAK 14 (Figura 4D-4G).
Para examinar el papel de la fosforilación de FAK en Tyr397 en EMT inducida por TGF, las células tratadas H358ON-Dox expresan GFP Dox dependientes fueron incubadas con vehículo o inhibidor de FAK 14 para 24 horas antes del tratamiento TGF. (A) Los extractos celulares se cosecharon 24 horas después del tratamiento con TGF para el análisis de los niveles de FAK total y fosforilada. células H358ON tratados con Dox que expresan GFP Dox-dependiente se trataron con vehículo (carril 1) o TGF (carril 2, 3, 4, y 5). Las células también se incubaron con vehículo (carril 1 y 2), o inhibidor de FAK 14 a 0,1 nM (carril 3), 1 nM (carril 4), y 5 nM (carril 5) (arriba en A). La relación de proteína fosforilada de la proteína total se presenta como el nivel de intensidad en relación con la de las células tratadas H358ON-Dox que expresan GFP Dox dependiente tratados con vehículo (parte inferior en A). Se muestra una blot representativo de tres experimentos independientes. Los datos mostrados representan la media ± EE. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 (B) Dox-células tratadas H358ON que expresan GFP Dox-dependiente se trataron con vehículo o TGF para 48 horas en ausencia o presencia de FAK inhibidor de 14 a 5 nM, y después se recogieron para el análisis de la fibronectina, E-cadherina y β-actina por el Western Blot. La relación F /E se muestra en comparación con la de las células tratadas con vehículo (parte inferior en B). Se muestra una blot representativo de tres experimentos independientes. Los datos mostrados representan la media ± EE. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 N.S. indica "no es significativo". (C) Un ensayo de migración se llevó a cabo para las células tratadas H358ON-Dox que expresan GFP Dox dependiente tratados con vehículo o TGF para 48 horas en ausencia o presencia de FAK inhibidor de 14 a 5 nM. Los datos mostrados representan las medias ± SD. El experimento fué repetido tres veces con resultados similares. *: P & lt; 0,05 para evaluar el efecto de FAK inhibidor 14 en la localización de β-catenina en células H358ON tratados con Dox que expresan GFP Dox dependiente tratados con vehículo o TGF, se evaluaron las intensidades de fluorescencia de β-catenina en las células. Las células se trataron con vehículo (D y E) o inhibidor de FAK en 5 nM (F y G). La imagen de la izquierda en (D y F) muestra células sin estimulación TGF. La imagen de la derecha de (D y F) muestra las células estimuladas con TGF. Las células incubadas con el control de isotipo IgG se muestra en el recuadro en (D).