Extracto
Antecedentes
casticina es uno de los principales componentes activos obtenidos a partir de
Fructus Viticis
y se ha informado de ejercer actividad anti-cancerígena en una variedad de cáncer células, pero el mecanismo exacto que subyace a esta actividad sigue siendo poco clara.
Materiales y Métodos
actividades apoptóticas de casticina (1,0 mmol /l) y TRAIL (25, 50 ng /ml) solo o en combinación en las líneas celulares de cáncer gástrico BGC-823, SGC-7901 y MGC-803 fueron detectados por el uso de un kit de detección de ELISA apoptosis celular, citometría de flujo (FCM) con yoduro de propidio (PI) tinción y las actividades de la caspasa-3, - 8 y -9 por ELISA y la escisión de la proteína de la polimerasa polyADP-ribosa (PARP), utilizando análisis Western blot. receptores de muerte (DR) los niveles de expresión se evaluaron mediante análisis FCM y el Western Blot. 2 ', se utilizó diacetato de 7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA) como una sonda para medir el aumento de las especies de oxígeno reactivas (ROS) niveles en las células. intervenciones múltiples, tales como siRNA transfección y los inhibidores farmacológicos se utilizaron para explorar los mecanismos de estas acciones.
Resultados
subtoxic concentraciones de casticina potenció significativamente la citotoxicidad y la apoptosis inducida por TRAIL en BGC-823, SGC-7901 y las células MGC-803. Casticina upregulated dramáticamente la expresión del receptor DR5 pero no tuvo efectos sobre DR4 o receptores señuelo. Supresión de DR5 por siRNA redujo significativamente la apoptosis inducida por el co-aplicación de TRAIL y casticina. El silenciamiento génico de la proteína de la proteína de unión a CCAAT /potenciador homóloga (CHOP) y el tratamiento previo con salubrinal, un retículo endoplasmático (ER) inhibidor de estrés, atenúa la expresión casticina inducida por receptor DR5, y la apoptosis y la producción de ROS. Casticina downregulated los niveles de expresión de las proteínas de supervivencia celular cFLIP, Bcl-2, XIAP, y survivin. Además, casticina también indujo la expresión de la proteína DR5 en otras células de cáncer gástrico (SGC-7901 y el MGC-803).
Conclusión /Importancia
casticina potencia la apoptosis inducida por TRAIL a través de la regulación a la baja de las proteínas de supervivencia celular y la regulación al alza de los receptores DR5 a través de acciones en la vía de la tensión-CHOP ROS-ER
Visto:. Zhou y, L Tian, Long L, M Quan, Liu M, Cao J (2013) casticina potencia la apoptosis inducida por TRAIL de células de cáncer gástrico a través del retículo endoplasmático estrés. PLoS ONE 8 (3): e58855. doi: 10.1371 /journal.pone.0058855
Editor: Kaustubh Datta, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Junio, 2012; Aceptó 8 de febrero de 2013; Publicado: 11 de marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de la SNCF (número 30760248), el Proyecto de Investigación Científica de la provincia de Hunan, la Oficina de Administración de Medicina tradicional china (número 2010081), el Proyecto de Investigaciones Científicas de la provincia de Hunan, Departamento de Educación (número 10C0975), Major proyecto de artículos de Investigaciones Científicas de la provincia de Hunan Departamento de Educación (número 09A054) y el proyecto de Investigación Científica de la ciudad de Changsha Oficina de Ciencia y Tecnología (número K1104060-31). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Fructus Viticis
(
Manjingzi
es el nombre chino) a saber, fruto de
Vitex trifolia L. gratis (familia
Verbenaceae
) que es una medicina china tradicional utilizado como un agente anti-inflamatorio. Casticina es uno de los componentes activos derivados de
Fructus Viticis
[1]. Muchos estudios han demostrado que casticina ejerce actividad anti-cancerígeno en mama [2], cervical [3], de próstata [4], de pulmón y cáncer de colon [5], [6], así como en el cáncer gástrico [7]
in vitro
. También se ha informado de que casticina inhibe el crecimiento de células de leucemia mielógena humanos [8] e induce la muerte de células de leucemia por la inducción de apoptosis, ya sea o una catástrofe mitótica [9].
Recientemente, el trabajo previo de nuestro laboratorio indicó que el efecto de casticina sobre la apoptosis de células de carcinoma hepatocelular humano está implicada en la vía de DR5 independiente del estado de p53 [10]. Se ha documentado que la proteína homóloga proteína de unión a CCAAT /potenciador (CHOP), también conocido como la detención del crecimiento y el gen de daño en el ADN 153 (GADD153), regula directamente la expresión de DR5 a través de un sitio de unión de CHOP en la región 5-flanqueante del gen DR5 [11], [12]. Nosotros, y otros, han informado de que algunos fármacos, tales como 5, 7-dimetil-dimetoxiflavona y celecoxib, inducen la expresión de DR5 través de la transactivación CHOP dependiente del gen DR5 [13] - [15]. Además, varios estudios han demostrado una estrecha relación entre el estrés retículo endoplásmico (ER) y la expresión de DR5. ER estrés se induce cuando las proteínas no plegadas se acumulan en el lumen del RE [16]. Parece que esta respuesta puede activar las vías de apoptosis específicos para eliminar las células dañadas gravemente, en el que el plegamiento de proteínas defectos no pueden ser resueltos [17], [18]. Varios inductores de estrés ER, como MG132 [12], tunicamicina [19] y thapsigargina [20], han consistentemente ha demostrado que inducen la expresión de DR5 en la superficie celular. Aunque los mecanismos moleculares para DR5 expresión de la proteína mediante inductores de estrés ER pueden variar en función de los estímulos y tipos de células, la sala de emergencias factor de transcripción inducible por estrés, CHOP, ha proporcionado un vínculo entre el estrés ER y DR5. Sin embargo, si casticina induce la expresión de DR5 en células de cáncer gástrico y de ser así, se desconoce la naturaleza del mecanismo molecular implicado.
Un estudio reciente ha demostrado que tumor eficaz necrosis relacionada con el factor-α-ligando inductor de apoptosis ( TRAIL) terapia de combinación con base se puede lograr mediante la regulación positiva de DR4 y DR5 expresión, y la orientación directa mitocondrias de células tumorales para estimular sus propiedades inductoras de apoptosis [21]. La capacidad de las mitocondrias para mediar la apoptosis está estrechamente regulada por miembros de la Bcl-2 superfamilia [22]. La supresión de la expresión de proteínas anti-apoptóticas, con ARN antisentido o ARNsi, se ha demostrado que sensibilizar a las células cancerosas para TRAIL [23]. Como resultado, los agentes que regulan negativamente tales proteínas anti-apoptóticas como survivin, celular FADD-como interleucina-1β la enzima conversora de proteína inhibidora (cFLIP), Bcl-2, y el inhibidor unido a X de la proteína de apoptosis (XIAP) potencialmente puede sensibilizar cáncer células a la apoptosis efectos de TRAIL [23], [24].
en el presente estudio, por lo tanto, nos hemos centrado en la investigación de si casticina potencia la apoptosis de las células cancerosas inducida por TRAIL, y si es así, ¿cómo casticina potencializa esta efecto. Se encontró que casticina potenció la apoptosis inducida por TRAIL DR5 upregulating través de la vía de estrés-CHOP ROS-ER y por la regulación negativa de la expresión de las proteínas de supervivencia celular Bcl-2, XIAP, cFLIP, y survivina en células de cáncer gástrico.
resultados
subtoxic concentraciones de casticina aumenta selectivamente la citotoxicidad inducida por TRAIL en células de cáncer gástrico
La citotoxicidad de casticina y TRAIL, solo o en combinación, se examinó en líneas de cáncer gástrico humano BGC- 823, SGC-7901 y MGC-803, tal como se determina mediante el ensayo de MTT. Casticina y solo RUTA causados citotoxicidad de células de cáncer gástrico, de una manera dependiente de la concentración (figuras 1A y B). se observó a una concentración inferior de casticina (1,0 mol /l, la Figura 1A); citotoxicidad leve (20% & lt). El tratamiento de células de cáncer gástrico con 25-50 TRAIL ng /ml durante 24 h inducidas citotoxicidad limitada (& lt; 20%). Sin embargo, co-tratamiento de células de cáncer gástrico con casticina (1,0 mol /l) y TRAIL (25 ng /ml o 50 ng /ml) aumentó notablemente los efectos citotóxicos en comparación con el tratamiento con casticina o TRAIL solo (Figura 1C).
Efectos de casticina (a) y TRAIL (B) por sí sola, o un tratamiento de combinación de casticina y TRAIL (C) sobre la citotoxicidad de BGC-823, SGC-7901, y las células MGC-803 (media ± dE,
n
= 3).
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P & lt; 0,05 vs
tratamiento con DMSO;
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P & lt; 0,05 vs. tratamiento
con 1 mol /l casticina o 25 ng /ml de TRAIL o el tratamiento con TRAIL en la misma concentración solo. Efectos de casticina y TRAIL solo, o un tratamiento de combinación de casticina y TRAIL sobre la citotoxicidad de las células GES-1 (D).
Debido a que se encontró que el tratamiento combinado con casticina y TRAIL citotoxicidad inducida fuertemente en células de cáncer gástrico, se examinó el efecto del tratamiento sobre la línea gástrica humana inmortalizada de células mucosa epitelial GES-1. Curiosamente, la combinación de casticina y TRAIL no induce citotoxicidad en células GES-1 (Figura 1D) .Estos resultados indican que las concentraciones de subtoxic casticina sensibilizados selectivamente las células de cáncer gástrico humano a RUTA inducida por citotoxicidad.
concentraciones subtoxic casticina de sensibilizar a las células de cáncer gástrico a la apoptosis inducida por TRAIL
para investigar si la apoptosis está implicada en la inhibición del crecimiento celular después de co-tratamiento con casticina y rastro, lo primero que examinó la apoptosis mediante análisis de citometría de flujo para detectar aumentos en células hypodiploid poblaciones. Los resultados revelaron que la tasa de apoptosis fue 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% y el 37,1 ± 4,9% (media ± SD,
n
= 3) para casticina (1 mol /l), TRAIL (50 ng /ml) y casticina más TRAIL, respectivamente (Figura 2A). La población sub-G1 de las células BGC-823, fue significativamente superior a las 12 h, y alcanzó un máximo de 24 h después del tratamiento previo con 1 mol /l casticina seguido de 50 ng /ml de TRAIL (Figura 2B). A continuación se determinó los niveles de fragmentos de histona /ADN de líneas celulares de cáncer gástrico BGC-823, SGC-7901 y MGC-803 utilizando el kit ELISA de detección de apoptosis de las células. La figura 2C ilustra que el tratamiento combinado de casticina y TRAIL induce sinérgicamente la fragmentación de la histona /ADN. Los niveles de fragmentos de histona /ADN de BGC-823 fueron elevados después de 12 h, y alcanzaron un máximo de 24 horas tras la co-tratamiento con casticina (1 mmol /l) y TRAIL (50 ng /ml, Figura 2D).
casticina mejorada inducida por TRAIL la muerte celular por apoptosis medido utilizando el análisis de citometría de flujo (a y B), la apoptosis celular kit de detección de ELISA (C y D) en BGC-823, SGC-7901, y las células MGC-803 (media ± SD, n = 3 ).
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P & lt; 0,05 vs
tratamiento con DMSO o 0 h;
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P & lt; 0,05 vs. tratamiento
con 1 mol /l casticina o TRAIL en la misma concentración solos durante 6 h. Las actividades enzimáticas de caspasa-3 (E), -8 (F), y -9 (G) se determinó por incubación de 20 mg de proteína total con 200 mM de sustrato cromogénico (Ac-DEVD-
p
AN o Ac-IETD-
p
NA o Ac-LEHD-
p
NA) en 100 l de tampón de ensayo durante 2 horas a 37 ° C. La liberación del cromóforo
p
nitroanilida (
p
NA) se controló mediante un espectrofotómetro (405 nm). Los datos mostrados son la media ± S.D. (n = 3). *
p
& lt; 0,01 vs. 0,1% de DMSO;#
p Hotel & lt; 0,05 vs. tratamiento con casticina y TRAIL solo. La división de PARP se examinó mediante análisis de Western Blot en BGC-823 y las células SGC-7901 (H).
A continuación examinó si las caspasas se activan en realidad durante la inducción de la muerte celular apoptótica por el tratamiento combinado con casticina y TRAIL en células de cáncer gástrico. El tratamiento de células de cáncer de gastic con 1 mol /L casticina solo durante 24 h no indujo ninguna actividad de la caspasa-3, -8 y -9. En respuesta a TRAIL (50 ng /ml), la actividad de la caspasa-3, -8 y -9 no cambiaron. Sin embargo, el tratamiento combinado de casticina y TRAIL induce la activación de la caspasa-3 y -8 y ligeramente activa la caspasa-9 (Figura 2 E, F y G).
También se examinó la que se activó la caspasa específicamente en respuesta a casticina y tratamiento TRAIL usando inhibidores de caspasas, incluyendo el inhibidor pan-caspasa zVAD- fMK, el inhibidor de la caspasa-3 zDEVD-fMK, el inhibidor de la caspasa-8 zIETD-fMK y el inhibidor de la caspasa-9 zLEHD-fMK. Como se muestra en la Figura 2E, zVAD-fmk, zDEVD-fmk y zIETD-fmk disminuyó significativamente el nivel de actividad de la caspasa-3 inducida por el tratamiento combinado de casticina y TRAIL, pero zLEHD-fmk tuvo un ligero efecto. zVAD-fmk y zIETD-fmk al mismo tiempo puede bloquear completamente la activación de caspasa-8, y zDEVD-fmk bloquearon parcialmente la activación de la caspasa-8; sin embargo, zLEHD-fmk había afectar poco el estado de activación de la caspasa-8 (Figura 2F). Correspondientemente, se encontró que la caspasa-9 fue ligeramente activa en células tratadas con casticina y TRAIL pero no en las células tratadas con casticina y TRAIL en presencia de Z-IETD-FMK, zVAD-fmk y zLEHD-fmk (Figura 2G). En conjunto, estos resultados sugieren que casticina con la adición de TRAIL induce la activación de la caspasa-8 aguas arriba de la activación de la caspasa-9 [10].
Finalmente investigó si casticina podría mejorar la escisión de PARP inducida por TRAIL y encontramos que casticina mejorada TRAIL indujo un aumento de la PARP división en BGC-823 y las células SGC-7901 (Figura 2H). Estos resultados indican claramente que una concentración subtóxica de casticina potencia la apoptosis inducida por TRAIL de células de cáncer gástrico.
casticina induce la expresión de DR5 en células de cáncer gástrico
La apoptosis de las células de carcinoma hepatocelular inducida por casticina estuvo involucrado en la regulación positiva DR5 [10]. Por lo tanto, las células tratadas con BGC-823 casticina durante 24 horas y después se utilizó el análisis de Western blot para examinar las células para la expresión del receptor de TRAIL. Casticina aumento de la expresión de DR5 de una manera dependiente de la concentración, pero no tuvo ningún efecto sobre la expresión de DR4 ni DcR1 o DcR2 inducción (Figura 3A). La inducción de la expresión de DR5 por casticina ocurrió a las 6 h y alcanzó su punto máximo a las 24 h (Figura 3B). Estos hallazgos sugieren que la regulación al alza de DR5 es un mecanismo a través del cual candidato casticina aumenta los efectos apoptóticos de TRAIL en células BGC-823.
Efectos de casticina en el nivel de expresión del receptor de TRAIL determinó mediante Western blot (A y B) y la célula DRs superficiales por análisis de citometría de flujo (C y D) en las células BGC-823. Efectos de casticina en los niveles de los niveles de proteína DR5 en SGC-7901, MGC-803 y GES-1 en las células mediante Western blot (E).
Para determinar si el DR en la superficie celular era implicados en la inducción de la apoptosis por casticina, se observó la expresión de la superficie celular de DR5 y DR4 usando citometría de flujo. Después de la exposición de células a casticina (1,0 mol /l), el nivel de DR5 en la superficie celular se incrementó (Figura 3C). Sin embargo, casticina no influyó en el nivel de expresión de DR4 (Figura 3D). En conjunto, estos resultados indican que casticina regula al alza la expresión de DR5 en la superficie celular.
Ya sea que la regulación positiva de DR5 por casticina es específico para células BGC-823 o también se produce en otras líneas celulares de cáncer gástrico, también se investigó. Casticina inducida por la expresión de DR5 en el cáncer gástrico líneas de células MGC-803 SGC-7901 y, pero no tienen efectos evidentes sobre su expresión en la inmortalización de células de la mucosa gástrica línea de GES-1 (Figura 3E). En conjunto, estos hallazgos sugieren que la regulación al alza de DR5 por casticina no es específico de un tipo particular de célula de cáncer gástrico.
DR5 se requiere la inducción por casticina para la mejora de la apoptosis inducida por TRAIL en células BGC-823
para determinar el papel de los receptores DR5 en la mejora de la apoptosis inducida por TRAIL por casticina, hemos utilizado siRNA específico para DR5 para regular a la baja su expresión. La transfección de células con siRNA para DR5 pero no con el control de siRNA redujo la expresión de DR5 inducida casticina.
Para examinar si la regulación positiva implica DR5 casticina-aumento de la apoptosis de las células gástricas inducida por TRAIL, el análisis de citometría de flujo se utilizó para examinar si supresión de la expresión de DR5 de siRNA podría atenuar el efecto de casticina sobre la apoptosis inducida por TRAIL. La Figura 4B muestra que el efecto de casticina sobre la apoptosis inducida por TRAIL se redujo de manera efectiva en las células transfectadas con DR5 siRNA, mientras que las células transfectadas con ARNsi de control no se vieron afectados. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la inducción de DR5 es crítica para la sensibilización de las células tumorales a los efectos de casticina en la apoptosis inducida por TRAIL.
Acción de siRNA para DR5, sobre los efectos de los niveles de expresión DR5 casticina inducida (A) mediante Western blot y la apoptosis mediada por TRAIL (B).
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P & lt; 0,05 vs
tratamiento con DMSO;
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tratamiento con 1 mol /l casticina TRAIL más 50 ng /ml en las células control y transfectadas scARN
inducida por DR5 es casticina regulación al alza mediada a través de la inducción de CHOP en células BGC-823
upregulation CHOP mediada por DR5 se ha demostrado [11] - [15]; Por lo tanto, el próximo investigado cómo este factor de transcripción podría estar implicada en la regulación positiva casticina inducida por DR5. Figura 5A muestra que la expresión inducida casticina CHOP, que se produjo en paralelo con el aumento de la expresión de DR5.
Efectos de siRNA para CHOP en la acción de DR5 casticina inducida por la expresión y CHOP (A y B) mediante Western blot el análisis y la apoptosis mediada por TRAIL (C) en las células BGC-823 (media ± SD,
n
= 3).
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tratamiento con DMSO;
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P. & Lt; 0,05 vs
tratamiento con 1 mol /l casticina TRAIL más 50 ng /ml en las células control y transfectadas scARN
Para probar el papel de CHOP en la regulación positiva inducida casticina de la DR, se utilizó el silenciamiento de genes de CHOP de siRNA. La transfección con CHOP siRNA suprimió significativamente inducida casticina-upregulation DR5 (Figura 5B), mientras que casticina upregulated la expresión de DR5 en células no transfectadas y transfectadas de control (codificado RNA).
A continuación utiliza el análisis de citometría de flujo para examinar si la supresión de CHOP de siRNA atenúa los efectos sensibilizadores de casticina sobre la apoptosis inducida por TRAIL. La transfección con CHOP siRNA redujo significativamente los efectos (de 37,1 ± 5,3% a 13,5 ± 1,3%, media ± DE,
n
= 3) en casticina además de la apoptosis inducida por TRAIL (Figura 5C), mientras que el tratamiento con el control siRNA no tuvo ningún efecto (Figura 5C). Estos resultados indican que CHOP está implicada en la regulación positiva DR5 y contribuye al efecto sensibilizador de los casticina sobre la apoptosis inducida por TRAIL en nuestro modelo experimental.
casticina inducida retículo endoplásmico (ER) de estrés en células de cáncer gástrico
se sabe que ER induce proteínas marcadoras de estrés ER (como GRP78 y fosfo-eIF2α), que regula al alza la expresión de CHOP [12], [19], [20]. En el presente estudio, se examinó el efecto de casticina en la expresión de proteínas marcadoras de estrés ER. Nuestros resultados muestran que, efectivamente, casticina inducir todos estos marcadores de estrés ER en BGC-823 células (Figura 6A). Para determinar si el estrés ER está implicado en la potenciación de casticina sobre la apoptosis inducida por TRAIL, salubrinal, un inhibidor de estrés ER, se utilizó. Salubrinal (50 mmol /l) protegidas significativamente BGC-823 células de la apoptosis inducida por la co-aplicación de casticina y TRAIL (Figura 6B).
Efectos de casticina en los niveles de expresión de proteínas asociadas a estrés ER (A ) mediante Western blot y la apoptosis mediada por TRAIL (B) en las células BGC-823 (media ± SD,
n
= 3).
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tratamiento con DMSO;
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P & lt; 0,05
tratamiento vs. con. 1 mol /l casticina más 50 ng /ml de TRAIL en células pretratadas con 50 mmol /l salubrinal. Efectos de la tunicamicina sobre los niveles de expresión de proteínas asociadas a estrés ER (C) mediante Western blot y la apoptosis mediada por TRAIL (D) en las células BGC-823 (media ± DE,
n
= 3).
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tratamiento con DMSO;
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P. & Lt; 0,05 vs
tratamiento con
También probamos si el tratamiento de BGC-823 células con el retículo endoplasmático (ER) inductor de estrés, tunicamicina [25 ], podría elevar los niveles de proteína DR5 y mejorar la muerte celular por apoptosis inducida por TRAIL. Se encontró que tunicamicina (3,0 mmol /L) se incrementó en función del tiempo los niveles de proteína de DR5, p-eIF2α, GRP78 y CHOP, en BGC-823 células (Figura 6C). El cotratamiento con tunicamicina (3,0 mmol /L) y TRAIL (50 ng /ml) aumentó significativamente el porcentaje de células en fase sub-G1, en comparación con tunicamicina o TRAIL solo (Figura 6D). Estos resultados apoyan la hipótesis de que el estrés ER participa en el efecto potenciador de la casticina sobre la apoptosis inducida por TRAIL.
inducida por DR5 casticina regulación al alza y la potenciación de la apoptosis son ROS-dependiente en células BGC-823
recientemente hemos demostrado que 5, 7-dimetoxiflavona aumenta selectivamente la apoptosis inducida por TRAIL por ROS estimulado el estrés ER-CHOP activación mediada por la regulación positiva de DR5 en células de carcinoma hepatocelular [15]. por tanto, se investigó si casticina induce la producción de ROS. 2 '7'-diclorofluoresceína diacetato (DFCH-DA) se utilizó como una sonda para medir cualquier aumento en los niveles de ROS en las células. experimentos de tiempo revelaron que los niveles de ROS se aumentaron inicialmente a
1 h, alcanzaron un máximo a las 3 h, y persistieron durante hasta 24 horas después del tratamiento con 1,0 mol /l casticina (Figura 7A). Casticina indujo la producción de ROS en una forma dependiente de la concentración (Figura 7B).
Efectos de casticina en la generación de ROS (A y B) y los efectos de la NAC en DR5 y CHOP regulación positiva inducida casticina (C) usando el oeste El análisis de transferencia y la apoptosis mediada por TRAIL (D) en las células BGC-823 (media ± SD,
n
= 3).
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tratamiento con DMSO;
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tratamiento con 1 mol /l casticina TRAIL más 50 ng /ml en las células pretratadas con NAC
Para descifrar la relación entre la generación de ROS y la inducción DR5 CHOP dependiente, se examinó si ROS regula los receptores inducida por TRAIL casticina-CHOP y en presencia y ausencia de
N-acetilcisteína
(NAC), que es un eliminador de radicales libres de oxígeno. Se encontró que el pretratamiento de las células con NAC redujo la regulación positiva inducida casticina de DR5 y picar expresión (Figura 7C).
A continuación, se investigó si ROS desempeña un papel en la potenciación TRAIL casticina inducida. Como se muestra en la Figura 7D, casticina mejora de forma significativa la apoptosis inducida por TRAIL en células BGC-823, y el pretratamiento de las células con NAC marcadamente reducida casticina inducida mejora la muerte celular apoptótica de 52,4 ± 3,3% a 8,2 ± 0,8%, (media ± SD, n = 3) lo que sugiere que ROS juega un papel crítico en la mediación de los efectos de casticina en la apoptosis inducida por TRAIL.
casticina downregulates la expresión de varias proteínas de supervivencia celular en las células BGC-823
se ha informado de que numerosas proteínas anti-apoptóticas, tales como survivina, cFLIP, XIAP, Bcl-2 y Bcl-xL puede regular la apoptosis inducida por TRAIL [25], [26]. En el presente estudio, se investigó si ciertas proteínas de supervivencia celular identificados estuvieron involucrados en el efecto potenciador de la casticina sobre la apoptosis inducida por TRAIL. BGC-823 células fueron expuestas a diferentes concentraciones de casticina para 24 h y después se examinan para Bcl-xL, Bcl-2, survivin, XIAP, cFLIP, CIAP-1 (inhibidor celular de la proteína de la apoptosis 1) y TRAF1 (TNF receptor-asociados factor de 1) expresión. Casticina inhibida Bcl-xL, Bcl-2, survivin, expresión cFLIP y XIAP (Figura 8A). Los efectos de casticina sobre la expresión de Bcl-xL, Bcl-2, survivin, XIAP y cFLIP fueron dramáticos, mientras que la regulación a la baja de la CIAP-1 no fue muy pronunciado. Estos resultados sugieren que la regulación por disminución de las proteínas de supervivencia celular es uno de los mecanismos que impulsan el efecto potenciador de la casticina sobre la apoptosis inducida por TRAIL.
BGC-823 células fueron tratadas con casticina a las concentraciones indicadas durante 24 h. Se utilizó el análisis de Western blot para determinar los niveles de expresión de proteínas anti-apoptosis (cFLIP, Bcl-2, XIAP, CIAP-1 y survivina) y proteínas pro-apoptosis (Bax y BID). β-actina se utilizó como control de carga.
A continuación examinó si casticina podría modular la expresión de proteínas pro-apoptóticas. Se encontró que casticina dramáticamente upregulated la expresión de Bax de una manera dependiente de la concentración (Figura 8B). Casticina también aumentó la escisión de la oferta de una manera dependiente de la concentración, como se muestra por la disminución de la expresión de la proteína Bid (Figura 8B). Estos hallazgos sugieren que casticina puede activar de forma simultánea la vía de las mitocondrias mediada intrínseca y la ruta extrínseca inducida-DR como lo demuestra la proteína pro-apoptótica truncada de la subasta.
Discusión
En la presente investigación, se determinó la capacidad de casticina, un derivado de polymethoxyflavone
Fructus Viticis
, para modular la señalización de TRAIL en células de cáncer gástrico, y nuestros hallazgos sugieren que casticina potencia la apoptosis inducida por TRAIL en el cáncer gástrico BGC-823, SGC-7901 y MGC-803 células por (1) la inducción de la expresión de DR5 y (2) downregulatin de las proteínas de supervivencia celular asociados a la resistencia de células tumorales a TRAIL. Casticina regulación al alza de DR5 parece estar mediada por la activación de la vía de ROS-ER estrés-CHOP (Figura 9).
casticina promueve inicialmente la generación de ROS y provoca estrés ER, luego se provoca DR5 regulación positiva a través de la activación de los cuales CHOP a continuación, aumenta la activación inducida por TRAIL de DR5 y la inducida por vías de la apoptosis mediada por mitocondrias. Al mismo tiempo, facilita casticina muerte celular por apoptosis inducida por TRAIL mediante la inhibición de la proteína anti-apoptosis (cFLIP, Bcl-2, XIAP y survivin) expresión y activación de proteínas pro-apoptosis.
Hemos demostrado que casticina indujo la expresión de DR5 en células de cáncer gástrico. Estos resultados están de acuerdo con los de nuestro trabajo previo [10], se informó de que el efecto apoptótico de casticina en células de carcinoma hepatocelular humano está involucrado en DR5 regulación al alza pero no se refirió a las preguntas acerca de si casticina puede potenciar la apoptosis inducida por TRAIL o el mecanismo de sensibilización. Aquí, hemos demostrado que DR5 upregulation es crítica para la sensibilización de las células a TRAIL, como el silenciamiento de genes de la apoptosis atenuada inducida por TRAIL receptor (DR5). Por lo tanto, DR5 regulación puede sensibilizar las células a la apoptosis inducida por TRAIL [27]. Numerosos mecanismos se han descrito para la inducción de la DR, incluyendo la generación de ROS, la inducción de p53, y NF-kappa B, DDIT3 (daño en el DNA inducible transcripción 3), peroxisoma proliferador activado del receptor-γ y MAPK activación [27], [28] . En el presente estudio, se encontró que casticina inducida CHOP y que el silenciamiento génico de CHOP de siRNA bloquean el efecto de casticina sobre la inducción de la apoptosis DR y en inducida por TRAIL. Nuestros resultados son similares a los de otros estudios que indicó que CHOP se une al promotor DR5 y regula al alza la expresión del receptor [12], [29].
Es bien sabido que CHOP es un ER típica tensión regulada proteína implicada en ER estrés inducido por la apoptosis [11]. Nuestro hallazgo de inducción CHOP por casticina sugiere que casticina pueden desencadenar el estrés ER y aumentar los niveles de expresión de GRP78 y eIF2α, que son proteínas adicionales acumulados o el aumento durante el estrés ER [17]. Por lo tanto, parece probable que casticina induce estrés ER. Salubrinal es un inhibidor selectivo de ER estrés inducido por la apoptosis [30]. La presencia de salubrinal aparentemente protegida células de cáncer gástrico de casticina además de la apoptosis inducida por TRAIL. Por lo tanto, parece que casticina induce una potenciación de la apoptosis mediante la participación de mecanismos de estrés ER.
Hemos encontrado que tal vez la señal ascendente más importante relacionado con casticina modulación de los receptores TRAIL es ROS. Nuestros resultados demuestran inequívocamente que casticina inducida por la producción de ROS, y que la extinción de ROS por el antioxidante
N-acetilcisteína
atenuó el efecto de casticina sobre la inducción de CHOP y DR5. Encontramos que saciar ROS también atenúa casticina potenciación de la apoptosis inducida por TRAIL. Nuestros resultados están de acuerdo con los reportados en estudios previos utilizando el sulforafano, zerumbone y celastrol para la inducción DR5. Resultados de los estudios actuales y anteriores indican claramente que ROS juega un papel importante en la modulación de TRAIL receptor DR5 [31], [32]. Nuestros resultados están de acuerdo con los del trabajo anterior, se informó de que casticina provocó la acumulación de células sub-G1 y el aumento de la producción de ROS en células HeLa, CasKi y líneas celulares SiHa, pero no en PBMCs [33]. Pero hemos demostrado que casticina redujo el contenido de GSH (
P & lt; 0,05
), pero no afectó el nivel de ROS intracelular en las células G2 PLC /PRF /5 y Hep [10]. Una explicación plausible para el conflicto de datos es evidente que hay diferencias en la modalidad que regulan las acciones en diferentes tipos de células.
También identificamos que el otro mecanismo de sensibilización consiste en la regulación de las proteínas anti-apoptóticas. Casticina downregulated los elevels de expresión de Bcl-2, Bcl-xL, XIAP y survivin, todos los cuales han sido relacionados con la resistencia de células tumorales a TRAIL [34], [35]. De hecho, la regulación negativa de XIAP, Bcl-2 y la expresión de Bcl-xL se ha demostrado que sensibilizar a las células tumorales a TRAIL [36], [37]. Wang
et al.
(2005) [8] mostró que casticina redujo Bcl-2 y niveles de expresión downregulated la relación de Bcl-2 expresión /Bax en las células K562. Nuestros resultados también están de acuerdo con estudios previos que demostraron que un extracto de etanol de la fruta madura seca de
Vitex agnus-castus
disminuyó el nivel de Bcl-2, la proteína Bcl-XL y Bid, y el aumento en el nivel de proteína Bax [7]. El informe de Chen
et al.
(2011) recientemente demostró que Bax se reguló, mientras que los niveles de expresión de Bcl-XL y XIAP fueron regulados a la baja por casticina [33].
Kobayakawa et al. informó de que casticina notablemente inhibió el crecimiento de las células KB, pero no inhibió la proliferación de células A431, que es similar a las líneas celulares normales 3T3 Swiss Albino y TIG-103 [38]. En el presente estudio, mostramos que casticina induce específicamente la apoptosis en células de cáncer gástrico humano pero no en células GES-1, aunque no se ha determinado el mecanismo de la inducción selectiva de la apoptosis. Nuestros hallazgos sugieren que casticina puede ser un agente antitumoral específica con baja toxicidad.
En resumen, nuestros resultados demuestran que casticina contribuye a la sensibilidad de las células tumorales a la zaga mediante la utilización de múltiples mecanismos. Casticina promueve inicialmente la generación de ROS y desencadena el estrés ER luego induce la regulación positiva DR5 través de la activación de CHOP que en consecuencia aumenta la activación inducida por TRAIL de DR5 y la inducida por vías de la apoptosis mediada por mitocondrias. Al mismo tiempo, facilita casticina muerte celular por apoptosis inducida por TRAIL mediante la inhibición de expresión de la proteína anti-apoptosis y la activación de las proteínas pro-apoptosis. Las investigaciones futuras deberían dirigirse para realizar plenamente el potencial de una combinación de terapia y casticina TRAIL para tratar a pacientes con cáncer gástrico.