Extracto
Antecedentes
Se utilizó la proteómica modernos intensivos enfoques predictivos para identificar las proteínas en el cáncer de ovario. Identificamos las proteínas reguladas en el suero y en el líquido peritoneal. Para evaluar el desempeño general del enfoque rastreamos el comportamiento de los 20 marcadores validados a través de estos experimentos.
Metodología
espectrometría de masas basado proteómica cuantitativa siguientes extensa fraccionamiento de proteínas se utilizó para comparar el suero de mujeres con cáncer de ovario seroso de mujeres sanas y mujeres con tumores ováricos benignos. La cuantificación se consigue por aminoácidos de cisteína isotópicamente etiquetado. espectrometría de masa libre de la etiqueta se utiliza para comparar el líquido peritoneal tomado de mujeres con cáncer de ovario seroso y aquellos con tumores benignos. Todos los datos fueron integrados y anotados en función de si las proteínas han sido previamente validado utilizando ensayos basados en anticuerpos.
Los resultados
Hemos seleccionado 54 proteínas del suero cuantificados y 358 proteínas del líquido peritoneal cuyas diferencias de casos y controles excedido un umbral predefinido. Diecisiete proteínas se cuantificaron en ambos materiales y 14 son extracelulares. De 19 marcadores validados que se identificaron todos fueron encontrados en el líquido peritoneal del cáncer y un subconjunto de 7 se cuantificaron en suero, con una de estas proteínas, IGFBP1, recientemente validado aquí.
Conclusión
Proteoma perfilado se aplica a los casos de cáncer de ovario sintomáticos identifica un gran número de hasta reguladas proteínas séricas, muchos de los cuales son o han sido confirmados por los inmunoensayos. El número de marcadores validados conocidas en la actualidad es más alta en el líquido peritoneal, pero constituyen un porcentaje más alto de las proteínas observadas en el suero y en líquido peritoneal, lo que sugiere que los 10 marcadores adicionales en este grupo pueden ser candidatos de alta calidad.
Visto: Amon LM, Ley W, Fitzgibbon MP, JA bruto, O'Briant K, Peterson A, et al. (2010) integrativa Análisis proteómico de suero y peritoneales líquidos ayuda a identificar las proteínas que están reguladas en el suero de mujeres con cáncer de ovario. PLoS ONE 5 (6): e11137. doi: 10.1371 /journal.pone.0011137
Editor: Sudhansu Kumar Dey, Fundación para la Investigación de Niños de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Marzo, 2010; Aceptado: 26-may de 2010; Publicado: 15 Junio 2010
Derechos de Autor © 2010 Amon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto ha sido financiado en parte con fondos federales del Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud, bajo los números de subvención CA111273 U01, CA83636 P50, el contrato No. HHSN261200800001E, y la Fundación Canaria. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente los puntos de vista o las políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones no implica reconocimiento alguno por parte del Gobierno EE.UU.. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario (CO) es la principal causa de sufrimiento y muerte entre las mujeres en los Estados Unidos, y su diagnóstico en una etapa de pre-metastásico puede reducir drásticamente la mortalidad. Aunque las cuentas de CO para sólo el 4% de todos los diagnósticos de cáncer en las mujeres (Instituto Nacional del Cáncer. Http://www.cancer.gov) es el más letal de todos los cánceres ginecológicos. Al igual que con muchos tipos de cáncer, la supervivencia de una mujer [1] con el OC está fuertemente asociado con su etapa al momento del diagnóstico. cáncer de ovario seroso (SOC) es el tipo histológico más frecuente y mortal; más del 70% de todos los casos de delincuencia organizada son diagnosticados en una etapa metastásica.
estrategias de detección temprana para OC actualmente en evaluación por lo general han implicado la combinación de uno o más marcadores basados en la sangre (por lo general el marcador CA 125) como un medio para remitir a las mujeres a una modalidad de imagen de confirmación tal como la ecografía transvaginal. Cuando se utiliza un marcador tal como una pantalla de primera línea, el rendimiento de toda la estrategia de cribado estará limitado por el rendimiento de este marcador y un rasgo de rendimiento críticamente importante para un marcador de detección temprana es tiempo de entrega, es decir, qué tan temprano en el proceso de la enfermedad el marcador eleva. Aunque los resultados preliminares sugieren que el logro de un umbral de valor predictivo positivo del 10% [2] es factible utilizar el enfoque multimodal secuencial, métodos de modelización [3] - [6] y los estudios de validación pre-clínicos de perfiles de CA 125 y otros marcadores [7 ] sugieren que el tiempo de entrega obtenido de CA 125 puede ser insuficiente para reducir de manera significativa la mortalidad en una gran parte de las mujeres.
Muchos marcadores distintos de CA 125 han sido identificados y validados en estudios independientes usando muestras recogidas en el momento del diagnóstico clínico [8] - [18]. Nos referimos a estos marcadores predictivos como "proteínas validados ', los que nos referimos proteínas confirmados mediante inmunoensayos en varias muestras independientes y, por lo tanto, como grupo, es probable que sean predominantemente positivos verdaderos. Más recientemente, muchos de estos marcadores han sido evaluados en las muestras obtenidas antes del diagnóstico y sugerir que podemos esperar pocas proteínas validados en la enfermedad sintomática de elevar también antes de desarrollar síntomas [7]. Es evidente que, para mejorar la detección precoz SOC requerirá la identificación de nuevas clases de marcadores, posiblemente por plasma o suero enfoques proteómicos.
Uno de los objetivos de nuestro estudio incluye la identificación de marcadores adicionales utilizando la proteómica suero. Sin embargo, la posibilidad de descubrir las proteínas diferenciales en suero y plasma ha sido motivo de controversia y no ampliamente exitosa, y por lo tanto un objetivo secundario de este estudio es validar el flujo de trabajo experimental proteoma global suero utilizando varios marcadores como los estándares de oro. En este manuscrito se describe una serie de experimentos proteómicos que interrogan mezclas complejas de biomateriales OC humanos. Los experimentos tuvieron dos propósitos; la primera fue la identificación de las proteínas identificadas previamente que pueden ser candidatos adicionales como marcadores predictivos. El segundo fue validar el enfoque de la proteómica en suero mediante el seguimiento del comportamiento de las proteínas de predicción validados conocidos con el fin de establecer que la plataforma es capaz de descubrir marcadores. Los primeros esfuerzos de descubrimiento de plasma y suero proteoma, lo más a menudo depender de SELDI o métodos MALDI [19] - [26], han fracasado en gran medida en este sentido. Enfoques más recientes utilizando tándem MS combinan con fraccionamiento intensivo [27] - [29] podría ser más apropiado para el descubrimiento de suero y plasma biomarcador como se ha demostrado para identificar proteínas de cáncer de páncreas [30] que se han validado posteriormente. Sin embargo, debido a que el éxito de cualquier enfoque de descubrimiento sin duda dependerá de las características de la enfermedad, tanto como la tecnología, antes de invertir recursos en el desarrollo de anticuerpos para los nuevos marcadores, lo primero que desea confirmar que el enfoque es capaz de producir resultados reproducibles.
Hemos interrogado tanto un fluido, el suero en circulación, y una proximal fluido al tumor, líquido ascítico o fluido peritoneal de pacientes de control con tumores serosos benignos (BST). Se realizaron dos experimentos diferentes en suero: el primer experimento en comparación mezclas de suero de pacientes metastásicos SOC a las piscinas de voluntarios asintomáticos sanos emparejados; El segundo experimento en comparación mezclas de suero de un conjunto diferente de los pacientes metastásicos SOC a mezclas de suero de mujeres con BST. Para los experimentos de fluido próximo, se compararon los charcos de líquido ascítico de pacientes metastásicos SOC a charcos de líquido peritoneal de pacientes con BST. En todos los experimentos, las muestras fueron agrupados según la edad, el tiempo de almacenamiento, el uso de terapia de reemplazo hormonal y hora de recogida antes de la cirugía (para la comparación del caso /control). Mediante la combinación de estos conjuntos de datos y la identificación de proteínas que parecen ser hasta reguladas en el SOC tanto en el suero y fluido proximal al tumor, esperamos enriquecer nuestra lista de candidatos potenciales con los marcadores específicos del cáncer.
Anotación de proteínas a base de recursos de datos existentes
Una lista de 21 proteínas previamente demostrado ser hasta reguladas en el plasma o suero del SOC en comparación con los controles sanos mediante ensayos de ELISA se compiló mediante el examen de los biomarcadores OC literatura. Se identificaron estas proteínas, así como una proteína adicional, IGFBP1, descubierto y validado en este trabajo como controles positivos verdaderos. Cuatro de las verdaderas proteínas positivos no se identificaron en plasma o líquido peritoneal: MUC16 [31] - [33], TNFRSF6B [14], VTCN1 [14], [17] (alias CA 125, DcR3, B7-H4, respectivamente ) y VEGF [16]. La Tabla 1 enumera los 19 verdaderos positivos proteínas que se identificaron en plasma o líquido peritoneal [14], [16], [17], [31] - [33]. Todos ellos fueron observados y cuantificados en el líquido peritoneal, y 7 fueron observadas en el plasma; no hay controles positivos se identificaron exclusivamente en el plasma.
comparaciones suero
Los proteómica suero experimentos (descritos más abajo) en comparación con el cáncer metastásico de ovario seroso (SOC) a (HA) mujeres sanas asintomáticas o mujeres con tumores serosos benignos (BST). La Tabla 2 muestra el número total de proteínas cuantificadas en cada experimento suero. Más de 360 proteínas se cuantificaron en cada experimento y un total de 470 proteínas se cuantificaron en al menos uno o el otro experimento. El colapso de estas proteínas por resultados símbolo de genes en los totales ligeramente más bajos debido a las diferentes isoformas identificadas por el mismo gen. En la Figura 1, la asociación entre log2 ratios para todas las proteínas cuantificadas por símbolo de genes para los dos experimentos en suero se representa (eje horizontal y vertical reflejan SOC frente a HA y SOC frente BST, respectivamente). Tenga en cuenta que todas las proporciones están orientados de manera que un valor positivo implica una relación de proteína más alta en SOC. Las proteínas que no fueron observados en un experimento están representados por una relación de seudo '1' (log 2 = 0) para dicho experimento.
puntos verdes representan proteínas reguladas en ambos experimentos. puntos azules representan las proteínas reguladas hasta en un experimento y no se observaron en el otro. * Marcador Benchmark validado mediante un ensayo de ELISA; ** Nuevo marcador validado mediante un ensayo ELISA
Figura 1 pone de manifiesto un patrón prometedor que uno puede esperar ver en un experimento que compara dos mezclas complejas y en la que se observan algunas proteínas diferenciales.: mayoría de las proteínas caen cerca del origen y varían de una manera no correlacionado ya que se producen cambios sistemáticos, pero un número de ellos en la tendencia cuadrante superior derecho de distancia de la mayor. Para el propósito de la caracterización de nuestros resultados, que la etiqueta una proteína como hasta reguladas si su relación de consenso cumple o excede un cambio de 2 veces (es decir, log2 (SOC /HA) + log2 (SOC /BST) ≥1 como se indica por la línea en la Figura 1). Las 54 proteínas que cumplen este criterio se muestran en color verde si se observa en ambas comparaciones o azul si se observa en una sola. Estas proteínas también se enumeran en la Tabla S1 (en la información complementaria)
.
Aquellas proteínas que corresponden a nuestras proteínas de referencia '' de la Tabla 1 se indican con un asterisco. Se observaron un total de siete proteínas de referencia en suero incluyendo seis que fueron previamente validado, así como un marcador adicional, IGFBP1, que se denota con un doble asterisco, que se validó aquí basado en estos experimentos. Los siete de las proteínas de referencia observados fueron reguladas por nuestros criterios. El enriquecimiento observado (7 de 7) es muy significativa (p-valor = 1e-6), lo que demuestra que nuestro análisis proteómico de suero encuentra alta concordancia con los ensayos validados.
experimentos líquido peritoneal
La experimentos de líquido peritoneal se comparan utilizando un método libre de etiquetas que nos permite cuantificar todas las proteínas observadas, no sólo los que contienen un ácido amino cisteína marcado isotópicamente. Tras sufrir un colapso por símbolo de genes, proteínas 2950 se observan en ambos experimentos. La comparación de log2 (péptido recuentos espectrales) entre SOC a BST se representa gráficamente en la Figura 2. Por conveniencia, las proteínas con el recuento espectral = 0 en un fluido pero se observan en el otro fluido se establecen en 0,5. Definimos una proteína como hasta reguladas si tiene un péptido SOC contar al menos dos veces mayor que el correspondiente número de péptido BST. De las 2950 proteínas identificadas por símbolo de genes, 358 se seleccionan como potencialmente hasta reguladas en base a este criterio (véase el cuadro S1). Las proteínas que también se encontraron hasta reguladas en los experimentos de suero se muestran en rojo. También se van registrando aquellas proteínas reportados por Kuk
et al
[34] que evaluó el líquido ascítico SOC. En nuestros experimentos, 73 de los candidatos Kuk se observan, se muestra en azul en la Figura 2, y se distribuyen ampliamente entre SOC y BST cuenta con sólo el 37 hasta reguladas. Kuk
et al
no evaluaron el material de BST. Al igual que en los experimentos de suero, encontramos un enriquecimiento significativo de biomarcadores validados entre las proteínas hasta reguladas en el líquido ascítico. De las 19 proteínas de referencia observados, ya sea en líquido peritoneal (marcado en la Figura 2), todos menos dos, MIF y MSLN, fueron reguladas (p-valor = 2e-16). Tenga en cuenta que MIF regulación está posiblemente asociada con sesgo de la muestra determinación [9]. Los datos aquí son consistentes con las conclusiones del Kuk
et al.
Líquido ascítico que el cáncer puede ser un recurso valioso para la identificación de biomarcadores candidatos, aunque nuestros resultados de la BST sugieren que muchos de ellos no habrá cáncer específico.
Los puntos rojos están regulados en el suero SOC. puntos azules son proteínas observadas en el líquido ascítico de cáncer de ovario por Kuk et al [34]. proteínas de referencia se etiquetan. Los puntos por encima de línea discontinua de color verde se consideran hasta reguladas en el líquido peritoneal.
Comparación de suero frente líquido peritoneal
Para comparar los dos tipos diferentes de, los ratios log2 consenso de fluidos más de dos experimentos en suero se representaron frente a la relación de log2 de líquido ascítico SOC sobre BST fluido peritoneal, como se muestra en la Figura 3. Debido a que sólo las proteínas observadas en ambos materiales se pueden representar, esta comparación incluye sólo las 358 proteínas observadas tanto en el suero y el líquido peritoneal. Un total de 17 de estas proteínas fueron designados como hasta reguladas en ambos conjuntos. La concordancia general de todas las proteínas, tal como se mide por la correlación en las proporciones, no es fuerte, pero esto no es inesperado ya que la mayoría de las proteínas no están cambiando entre las dos fuentes y para aquellas fuentes experimentales de variación debe dominar. Sólo entre las proteínas que varían sistemáticamente entre la caja y el control que debe encontrar la concordancia. Las 17 proteínas que son reguladas en ambos experimentos (que se enumeran en la Tabla 3 y se muestra en azul en la Figura 3) están altamente enriquecido para los biomarcadores validados que figuran en la Tabla 1. Todos los siete proteínas de referencia observados medidos en ambos experimentos se encuentran regulados hasta (p-valor = 2e-16). Sin embargo, el mayor beneficio se observa mediante el uso de la superposición de los dos experimentos es un aumento sustancial del porcentaje de los marcadores validados entre todos los marcadores hasta reguladas. En el suero, el 15% de las proteínas hasta reguladas eran proteínas de referencia y en la lista de candidatos líquido ascítico, 5% eran proteínas de referencia. Si utilizamos la superposición de estos dos experimentos, el porcentaje de proteínas candidatas de la lista de referencia validados aumenta a 7 de cada 17 (41%).
Las proteínas reguladas en ambos fluidos son de color azul. * Marcador Benchmark validado mediante un ensayo de ELISA; ** Nuevo marcador validado mediante un ensayo ELISA.
Además de los datos experimentales, la Tabla 3 también incluye la anotación de dos categorías GO, región extracelular e inflamatoria o la respuesta a heridas cuando un "sí" indica la proteína está anotado para ese término, ya sea en la hoja o un nodo padre. El término "región extracelular" indica que la proteína se encuentra fuera de la membrana de plasma y podría ser secretada en la sangre. Entre las 17 proteínas, 14 (82%) de ellos están anotados como extracelular en comparación con el 17% de todas las proteínas observadas en los experimentos. Esta desproporción es compatible con la hipótesis de que mediante la combinación de datos de los fluidos circulantes y proximales podríamos tener más probabilidades de descubrir biomarcadores de proteínas secretadas o desprendido de la tumor en lugar de derivar en el huésped en otro lugar. También hemos incluido GO términos relacionados con la inflamación en esta tabla para descartar las proteínas que pueden no ser específica para el cáncer. Sólo se conocen dos de las 17 proteínas de solapamiento de estar involucrados en la inflamación.
validación de ELISA IGFBP1
El estado de validación de todas las proteínas 17 candidatos se indica en la Tabla 3. Los ensayos de ELISA comercial están disponibles para 8 de las 17 proteínas. De ellos, seis fueron validados en estudios anteriores (ver Tabla 1). Las dos proteínas restantes derivadas de este estudio, MMP9 y IGFBP1, se sometieron a ensayo en este estudio.
La validación se realizó en tres etapas. En la primera etapa, los marcadores fueron probados en una serie de mezclas de diferentes proporciones de mezcla de sueros de pacientes de OC y se agruparon los sueros de los controles de HA a partir del conjunto de filtrado de muestras (50 OC, 9 controles HA) se describe en Métodos. Ambas proteínas tenían altas concentraciones en el alto de la piscina pero sólo OC IGFBP1 mostraron una dependencia de la concentración con la relación de los sueros de cáncer de ovario de controlar. Ambas proteínas fueron probados contra muestras individuales desde el conjunto de filtración (12 OC, 12) HA controles descritos en los métodos. IGFBP1 niveles fueron significativamente mayores en el suero de cáncer (p-valor = 0,0097), mientras que los niveles no eran MMP9 (valor de p = 0,20). Se utilizó un tercer conjunto de muestras que se limita a los casos de cáncer de ovario seroso (SOC 44, 78 controles HA) para confirmar la elevación de IGFBP1. En este conjunto de datos, la importancia de caso para controlar diferencia aumentó a 5.0E-4 y la curva ROC tenía una AUC de 0,860. La curva ROC para estas muestras se muestran en la Figura 4 demuestra la capacidad de IGFBP1 para clasificar OC frente a los controles HA y BST, que muestra resultados consistentes con el comportamiento en los experimentos de proteómica.
SOC vs HA se muestra en negro y SOC vs BST en azul
Discusión
perfiles proteómicos de suero o plasma para descubrir biomarcadores de cáncer aún no ha tenido un éxito ampliamente demostrado [19] - [26]. donde las proteínas se validado en muestras independientes o el uso de plataformas independientes. Una notable excepción es un estudio de cáncer de páncreas utilizando un modelo de ratón y fraccionamiento en profundidad de las proteínas intactas [30]. En este manuscrito se ha utilizado un enfoque similar para tándem MS perfiles proteómicos de suero en combinación con perfiles de fluido peritoneal como fluido de tumor proximal. Hemos elaborado una lista corta de 17 biomarcadores encontrados hasta regulado tanto en el suero y el líquido proximal - 7 que incluyen proteínas que han sido validados mediante ensayos ELISA existentes, incluyendo un nuevo biomarcador SOC (IGFBP1). Los 10 marcadores restantes de este grupo pueden representar candidatos de alta calidad.
Nuestro éxito en la identificación de muchos marcadores validados puede ser el resultado de una serie de características en el diseño experimental. sesgo de la muestra fue eliminado por la recogida de muestras y el cuidado de los casos firmemente a juego con los controles. Además de hacer coincidir basada en la edad, raza y antecedentes familiares de OC, controles también fueron emparejados en el uso de TRH y el número de días antes de la cirugía en la extracción de sangre. HRT se ha demostrado que afectan drásticamente los niveles de muchas proteínas de suero [35], [36]. Thorpe
et al
[37] demostraron que la extracción de sangre el día de la cirugía está asociada con la elevación de varias proteínas del suero. Este sesgo se evitó aquí por la coincidencia de la muestra cuidado basado en la condición recogida caso /control. Otro aspecto importante de este análisis fue el uso de fraccionamiento extensa muestra antes de la MS. Este diseño, que se ha demostrado para obtener sensibilidades de concentración 10 ng /ml [35], [36], permitió una mayor profundidad de la cobertura proteoma por MS en tándem para identificar los cambios potencialmente significativos.
Un aspecto importante del diseño de los experimentos de suero fue el uso de tres diferentes tipos de sujetos: los pacientes con cáncer de ovario, voluntarios sanos asintomáticos y pacientes con tumores benignos. Las proteínas de hasta regulados en el SOC con respecto a HA, pero no en relación con la STB no es probable que sea específica para el cáncer y fueron eliminados de la consideración. Lo mismo puede decirse de las proteínas hasta reguladas en relación con la STB, pero no a HA. Usando sólo el SOC vs comparación BST, habríamos encontrado 5 de 7 marcadores validados cuantificados en oposición a 7 de 7 (TIMP1 y SLPI sería eliminado).
La combinación de los datos de suero con datos de perfiles proteómicos de líquido de ascitis peritoneal nos permitió identificar un grupo de proteínas tienen una gran fracción de proteínas nuestros verdaderos positivos; la eliminación de las proteínas que no se encuentran también en el líquido peritoneal reduce nuestros potenciales candidatos de 54 a la 17, al tiempo que conserva todas las siete proteínas de referencia cuantificados en el suero. Este resultado apoya la hipótesis de que las proteínas identificadas en una proximal fluido al tumor y también en un fluido en circulación se identificar biomarcadores eficaces. Kuk
et al
[34] mostró que el líquido ascítico de pacientes con cáncer de ovario contenía un gran número de marcadores de alta calidad, y nuestros resultados son concordantes con los hallazgos. Sin embargo, debido a que el número de proteínas de referencia se encuentra en el líquido peritoneal es mayor que el encontrado en el suero, no se puede hacer la afirmación de que más marcadores se pueden identificar por que requiere observaciones en el suero y fluido proximal. De hecho nuestros datos y que a partir de Kuk
et al. Linguee Sugerir que el líquido ascítico proteómica datos pueden contener el mayor número de marcadores de alta calidad. Nuestros hallazgos sugieren que las proteínas que requieren solamente que deben observarse en ambas muestras podría conducir a una mayor proporción de marcadores de alta calidad. Esta hipótesis no se puede confirmar, sin embargo, también sin una evaluación sistemática de marcadores cierto negativos, así como verdaderos positivos. Por otra parte, no todos los marcadores de identificación conocidos no indica que el marcador no es de alta calidad, ni que el proceso es necesariamente la culpa. Por ejemplo, nuestra plataforma no fue capaz de identificar CA 125 ni otros tres marcadores que hemos seleccionado inicialmente como proteínas de referencia, posiblemente debido a las limitaciones de sensibilidad en la espectrometría de masas. Sin embargo, dado que una plataforma es capaz de cuantificar marcadores validados existentes, uno podría encontrar concordancia entre las dos plataformas tranquilizadoras, que nos pareció aquí.
En los datos combinados de cuatro métodos diferentes de fraccionamiento Kruk
et al .
identificado 445 proteínas totales, un número considerablemente más bajos que los miles de grupos de proteínas que hemos observado en nuestros experimentos. Esta diferencia se debe en parte a su enfoque en la subproteoma de las proteínas menos de 100 kDa como nuestro conjunto incluye 490 proteínas mayor que 100 kDa. Pero el uso de fraccionamiento intensivos puede dar cuenta de la disparidad restante. A pesar de estas diferencias, las conclusiones de su estudio son altamente consistentes con nuestros resultados; después de aplicar algunas técnicas de minería de datos, que redujeron su lista de candidatos para 77 proteínas (incluyendo 25 marcadores conocidos OC), 73 de los cuales fueron observados en nuestro estudio. Como es evidente en la figura 2, la abundancia relativa de las proteínas Kuk incluyen algunos que son hasta así como hacia abajo; sólo la mitad de estos son por de dos veces en relación con el fluido peritoneal benigno. De las 19 proteínas de referencia observados en cualquier charco de líquido peritoneal, 17 tienen recuentos espectrales dos veces mayor en el SOC de BST. Esto sugiere que aunque Kuk
et al
eran correctos en su afirmación de que el líquido ascítico es una rica fuente de marcadores potenciales, nuestro trabajo sugiere que la inclusión de un material de control puede ser útil para reducir los falsos positivos. Uno de los puntos fuertes de este estudio es el uso de las abundancias relativas de SOC con la STB para encontrar proteínas específicas de la enfermedad maligna.
La cuestión de las proteínas inflamatorias de confusión (recientemente abordada por Checlinska
et al
[38]) se reduce al mínimo en múltiples formas en nuestro estudio. En primer lugar, nuestros métodos de fraccionamiento agotamiento y nos permiten el acceso a las proteínas más allá de sólo los muy abundantes que a menudo incluyen muchas proteínas relacionadas con la inflamación. Además, las comparaciones entre el cáncer y enfermedad benigna filtran muchas proteínas que elevan debido a la presencia de un tumor benigno; proteínas inflamatorias compartidos por ambas condiciones se eliminan. También, ya que estamos apuntando a las proteínas secretadas mediante la búsqueda de solapamiento entre las proteínas en el fluido proximal y los niveles elevados en suero, vamos a reducir la posibilidad de observar las proteínas séricas sintetizados en el hígado como una respuesta inflamatoria. Aún así, la Tabla 3 incluye dos proteínas (ORM1, SERPINA3) fuera de los candidatos 17 biomarcadores que tienen funciones en la inflamación. Si bien hemos mejorado considerablemente la proporción de biomarcadores relacionados con la inflamación durante los experimentos de perfiles anteriores [39], [40], no podemos eliminar por completo todos los factores de confusión y debemos confiar en la anotación cuando estén disponibles para la promoción de filtrado.
este trabajo también hemos descubierto y validado un nuevo biomarcador para el cáncer de ovario seroso sintomática, proteína de unión a factor de crecimiento de tipo insulina 1. al igual que IGFBP2, IGFBP1 es un miembro de la familia de proteínas de unión a factor de crecimiento similar a la insulina y se une tanto a los factores de crecimiento similares a la insulina, IGF1 y IGF2. Como las otras IGFBPs, IGFBP1 se expresa en los tejidos locales, incluyendo ovario, y está presente en el plasma normal. Los niveles séricos de IGFBP1 se redujeron significativamente en las mujeres posmenopáusicas que toman terapia de reemplazo hormonal [35]. Aunque los niveles séricos elevados de IGFBP2 se han demostrado en un número de cánceres, incluyendo de ovario [10], esta es la primera evidencia de que los niveles de IGFBP1 aumentan en el suero o plasma de los pacientes con cáncer de ovario. Otro estudio mostró niveles elevados de IGFBP1 (y IGFBP2) en el plasma de los pacientes con cáncer de cabeza y cuello [41].
Por último, también observamos que entre los 17 marcadores que han demostrado ser hasta reguladas en el suero y el líquido ascítico del SOC, todos menos tres proteínas son secretadas. Aunque se dice habitualmente que las proteínas secretadas son preferibles como candidatos debido a su potencial para secretar a la sangre, esta afirmación no es a menudo apoyado empíricamente. Nuestros datos proporcionan un fuerte apoyo a esta hipótesis generalmente aceptada.
Tal como se describe en la introducción de este manuscrito, aunque varios biomarcadores séricos para el cáncer de ovario se han descubierto y validado, todos los marcadores han demostrado un rendimiento deficiente en la pre muestras -reactivos para diagnóstico. En este estudio, nos propusimos establecer la capacidad de los perfiles proteómicos de suero para descubrir biomarcadores de cáncer de ovario cuando se utiliza en combinación con otros perfiles de fluido próximo. Habiendo demostrado el éxito de este enfoque, podemos ahora con confianza aplicar estos métodos a más desafiantes muestras pre-sintomáticos.
Materiales y Métodos
El reclutamiento y la recolección de la sangre humana y líquido peritoneal para el descubrimiento
Toda la investigación para este estudio se realizó específicamente en el Centro de investigación del cáncer Junta de Revisión Institucional Fred Hutchinson aprobaron protocolos, IR#6045 y#IR 6094. Todas las muestras humanas se derivaron de los sujetos que dieron su consentimiento por escrito. Los datos se analizaron de forma anónima.
El suero de mujeres con cáncer seroso de ovario (SOC), tumores serosos benignos (BST), y de los controles asintomáticos sanos (HA) se utilizó en los experimentos de descubrimiento y validación proteómica. protocolos de recogida de muestras se han descrito anteriormente en detalle en otra parte [32], [37]. En resumen, el suero y el líquido peritoneal de las mujeres con el SOC y el BST se recogieron antes de la cirugía y la quimioterapia como parte de un programa de cáncer de ovario Especializada de Investigación de Excelencia (SPORE), financiado por el Instituto Nacional del Cáncer. El diagnóstico de la SOC y la BST se confirmaron mediante revisión patológica central. La edad y la terapia de reemplazo hormonal (TRH) controles pareados HA fueron reclutados a través de un programa de cribado de cáncer de ovario, donde todos los pacientes representan controles asintomáticos. Todas las muestras de suero, independientemente de la fuente de recogida, se procesaron con el mismo protocolo; se recogió sangre en 10cc Vacutainer separadores de suero tubos (SST) y se deja reposar durante 30 minutos a 4 horas a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugaron a 1200- × g durante 10 minutos, luego se dividen en múltiples alícuotas de 1 ml de suero y se almacenaron a -80 grados Celsius. Antes de su uso, cada uno de 1-ml vial de suero se descongeló en hielo, dividido en múltiples subaliquots 110 microlitros, y se almacena de nuevo a -80 grados Celsius.
se recogió el fluido peritoneal en un recipiente sellado al vacío estéril en el quirófano por el personal quirúrgico. Usando una jeringa de 1cc estéril, 20.000 unidades de heparina (viales contienen 10.000 unidades por cc) se añadió a cada litro de líquido para evitar la formación de coágulos de sangre. En el laboratorio, el líquido se transfirió a tubos de centrífuga cónicos (50 cc o 250 cc dependiendo del volumen de fluido) y se centrifugó en una centrífuga equilibrada a 2000 rpm durante 5 minutos para sedimentar el componente celular. sobrenadante libre de células se transfirió a un tubo cónico de 50 cc y cinco tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para el almacenamiento a -80 grados centígrados congelador.
La selección de muestras para los experimentos de descubrimiento
Sólo las mujeres posmenopáusicas que tienen se incluyó un riesgo promedio de cáncer de ovario o de mama (riesgo promedio implica sin antecedentes familiares importantes de cáncer de mama o de ovario y cáncer sin diagnóstico previo) en los experimentos de descubrimiento. Las mujeres primer experimento descubrimiento de suero en comparación con la etapa tardía SOC a los controles de HA y el segundo en comparación con las mujeres con BST. Se seleccionaron piscinas SOC de tamaño 4 (con los controles sanos) y el tamaño 5 (con la STB) estar estrechamente emparejado con los controles basados en la edad (+/- 2 años), el tiempo de almacenamiento de las muestras (+/- 1 año) y la TRH [35 ]. Por otra parte, debido a entornos de captura tiene un efecto conocido sobre proteoma de suero [37], los casos y los controles fueron también igualó en función de si la extracción de sangre se produjo el día de la cirugía (para SOC frente a los controles BST) o si fueron recogidos tres o más días antes a la cirugía (por SOC frente a los controles de HA). Para los experimentos de líquido peritoneal, una piscina de tamaño 10 muestras SOC se comparó con un grupo de tamaño de 4 muestras BST. El tamaño del grupo para BST es menor, ya que, mientras que una gran fracción de los pacientes desarrollan ascitis SOC, pocos pacientes BST producen líquido ascítico comparables.
Selección de muestras de suero para la validación de los experimentos
Los experimentos para validar el las proteínas se realizaron durante dos marcadores en tres descritos anteriormente [32], [33] conjuntos de muestras de suero. Estos conjuntos incluyen dos conjuntos de filtrado. El primer conjunto se compone de muestras mezcladas de 50 pacientes (OC caso piscina) diluidas en serie con el suero de 9 HA controles (control de la piscina). El segundo grupo estaba compuesto de muestras individuales de 12 pacientes y 12 controles OC HA. Se utilizó un tercer conjunto más amplio de muestras individuales para confirmar proteínas que mostraron una elevación significativa en el segundo set. La digestión se llevó a cabo durante la noche a 37 ° C.