Extracto
Antecedentes
Gut derivados de lípidos factores han sido implicados en la lesión sistémica y la inflamación, pero las vías precisos implicados son desconocidos. Además, la ingesta de grasas en la dieta y la obesidad son factores de riesgo independientes para el desarrollo de cáncer colorrectal. Aquí hemos estudiado la gravedad de la colitis experimental y el desarrollo de cáncer asociado a colitis (CAC) en ratones con un bloque inducible en la secreción de quilomicrones y mala absorción de grasas, tras su eliminación-delgado específica de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales (
MTTP-IKO
).
Metodología /Principales conclusiones
MTTP-IKO
ratones mostraron una lesión más grave con una mortalidad ~ 90% después de dextrano sulfato de sodio (DSS) la colitis inducida, en comparación con & lt; 20% en los controles. La permeabilidad intestinal se incrementó en
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ratones en comparación con los controles, tanto al inicio del estudio y después de la administración de DSS, en asociación con el aumento de los niveles circulantes de TNF. tratamiento DSS aumentó la expresión de ARNm de colon de IL-1β y IL-17A así como la expresión inflamasoma en ambos genotipos, pero la abundancia de TNFa se aumentó selectivamente en DSS tratada
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ratones. Hubo un aumento de 2 veces en la carga tumoral del colon en
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ratones después del tratamiento /DSS azoximetano, que se asoció con un aumento de la inflamación del colon, así como alteraciones en la expresión de citoquinas. Para examinar las vías por las que las alteraciones en la abundancia de ácidos grasos podría interactuar con la señalización de citoquinas para regular el crecimiento epitelial del colon, se utilizó miofibroblastos primaria murino para demostrar que palmitato inducida expresión de anfirregulina y epirregulina y aumentada el aumento tanto de estos mediadores de crecimiento cuando se añade a IL-1βor de TNFa.
Conclusiones
Estos estudios demuestran que
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ratones, a pesar de absorber prácticamente nada de grasa en la dieta, exposición aumentada de ácidos grasos dependiente de señalización que a su vez exacerba las lesiones del colon y aumenta la formación de tumores
Visto:. Xie y, Matsumoto H, I Nalbantoglu, Kerr TA, Luo J, Rubin DC, et al. (2013) Intestino-específico MTTP Supresión aumenta la gravedad de la colitis experimental y conduce a una mayor carga tumoral en un modelo de colitis cáncer asociado. PLoS ONE 8 (6): e67819. doi: 10.1371 /journal.pone.0067819
Editor: Josep Bassaganya-Riera, Virginia Tech, Estados Unidos de América
Recibido: 14 de marzo de 2013; Aceptado: 22 de mayo de 2013; Publicado: 21 de junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Xie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos nacionales de Salud (HL 38180, DK-56260 y Enfermedades Digestivas de la Universidad de Washington Investigación Core Center DK-52574, en particular la murina y núcleos de morfología) a cabecear. DR fue apoyado por becas DK-46122 y DK-61216. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La continua epidemia de obesidad y sus comorbilidades asociadas ha impulsado el interés en la comprensión de las vías y los mediadores implicados, en particular en relación con la inflamación y el cáncer. La obesidad y sus complicaciones metabólicas relacionadas han demostrado desempeñar un papel en un número de cánceres, incluyendo el cáncer colorrectal (CRC) y el control de la modificación y por consiguiente de peso de la dieta son vistos como principales factores de riesgo modificables [1]. Sin embargo, los mecanismos precisos y vías por las que la obesidad contribuye al riesgo de CRC están todavía no se entienden completamente y es probable que incluyen alteraciones en la inflamación sistémica y la señalización de citoquinas, resistencia a la insulina, así como efectos locales y sistémicos de la absorción de nutrientes alterado incluyendo ácidos grasos, colesterol y ácidos biliares [2]. Debido a su importancia como fuente de energía, la ingesta de grasas en la dieta ha sido un objetivo para la intervención como una estrategia para mitigar los efectos de la obesidad y la inflamación en el riesgo de CCR [3].
Además de la función para la obesidad y el consumo de grasas en la modulación de la inflamación y el riesgo de CCR, hay cada vez más datos que sugieran que el intestino delgado desempeña un papel importante como mediador en la respuesta inflamatoria sistémica a la sepsis [4], [5]. En este escenario, se ha sugerido que el intestino delgado segrega productos lipídicos derivados de la digestión luminal, que luego son transportados en los linfáticos mesentéricos, donde inducen la insuficiencia de órganos en sitios distantes [6], [7]. Otro trabajo ha reforzado esta hipótesis gut-linfático mediante la demostración de que la ligadura del conducto mesentérica (eliminando con ello la entrega de los quilomicrones del intestino a la circulación sistémica) anula los efectos sistémicos de choque, unas conclusiones que apuntan a la importancia de los mediadores lipídicos derivados de la intestino en la patogénesis de la inflamación sistémica [8], [9]. Otro trabajo ha implicado a las lipoproteínas como vehículos para el transporte de factores y morfógenos de crecimiento, incluyendo mamíferos Wnt3, lo que sugiere un papel más fundamental para el transporte de lípidos en la regulación del crecimiento y la proliferación [10] epitelial.
En este estudio, tenemos examinado el papel de la secreción de quilomicrones intestinal con el fin de comprender la función de transporte de lípidos intestinal en la patogénesis de la inflamación del colon y colitis cáncer asociado (CAC). Recientemente hemos demostrado que los ratones con deleción-delgado específica condicional de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales (
MTTP-IKO
) desarrollar el bloque prácticamente completa de la absorción intestinal [11] y muestran una ventaja en la supervivencia cuando se enfrentan a
Pseudomonas aeruginosa
, la causa más común de neumonía gram negativa [12]. Esos hallazgos plantean la posibilidad de que el bloqueo de la secreción intestinal de quilomicrones también puede atenuar los efectos de la química inducida por la colitis experimental y, a su vez derogar el desarrollo del cáncer colorrectal después de sulfato de sodio azoximetano /dextrano desafío (/DSS OMA) [13]. Nuestros resultados, sin embargo, reveló que
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ratones desarrollaron peores lesiones del colon y el aumento de la carga tumoral. Además, hemos encontrado que la señalización de ácidos grasos alterado puede desempeñar un papel clave en la promoción de estos fenotipos.
Materiales y Métodos
Animales
MTTP
flox /flox villin- Cre-ER
T2 (
MTTP-IKO) ratones (junto con los controles de la misma camada) se utilizaron para estos estudios, en un fondo de ~ 75% C57BL /6 y ~ 25% 129 /SvJ. expresión de la recombinasa Cre en las células epiteliales de las vellosidades se indujo mediante cinco inyecciones intraperitoneales diarias de 1 mg de tamoxifeno (Sigma), como se describe anteriormente [11]. Los experimentos se realizaron en ratones que consumen un habitual baja en grasas para roedores. la colitis experimental fue inducida por la administración de sulfato de dextrano sódico al 2,5% (DSS) (PM 40.000-50.000, Cat#9011-18-1, Affymetrix, Inc., Cleveland, Ohio.), durante los tiempos indicados en las leyendas de las figuras y pesaron diariamente . CAC fue inducida por la inyección de edad, los ratones 8 semanas con 10 mg /kg azoximetano peso corporal (AOM, Sigma), seguido de tres ciclos (5 días) de DSS a partir de 5
TH (2%), 26
TH (2,5%) y 46
º (2,5%) días después de la inyección de AOM, modificaciones menores del protocolo utilizado por otros [14]. Los ratones fueron sacrificados a las 9 semanas después de la inyección y los tejidos AOM recogieron para su análisis. Todos los estudios con animales fueron aprobados por los Comités de estudios en animales de la Facultad de Medicina (# 20100146) Universidad de Washington y se llevaron a cabo en estricta conformidad con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso de animales de laboratorio.
analiza histomorfológico
Las muestras de intestino delgado y colon fueron fijados e incluidos para seccionar y hematoxilina y eosina (H & amp; e) tinción. Donde se indique, las secciones intestinales se tiñeron para las gotas de lípidos utilizando tetróxido de osmio como se ha descrito se llevó a cabo [12] histológico de puntuación de la lesión DSS y se cuantificó utilizando los parámetros descritos [15]. proliferación intestinal se examinó en ratones inyectados con 5-Bromo-2'deoxyuridine (BrdU) (200 l de volumen, 5 mg /ml diluido en solución salina normal; Sigma), 2 horas antes del sacrificio. Las muestras se procesaron para la tinción de BrdU como se describe [12]. El análisis de la carga tumoral de colon se llevó a cabo utilizando muestras fijadas en formalina al 10% (Sigma) y se cubrió para la puntuación por un investigador ciego para el genotipo. Cada muestra fue fotografiado usando un microscopio de disección Nikon SMZ800 y una cámara Fotometría CooLSNAPcf (Servicios de Procesamiento de Imágenes). Se determinó el área de cada sección y el tamaño de los tumores cuantificó usando software MetaVue (Molecular Devices). H & amp;. E secciones también fueron revisados por un patólogo (EN), sin conocer el genotipo
La permeabilidad intestinal y ensayos de citoquinas
Se determinó la permeabilidad intestinal después de la inyección de dextrano marcado con FITC (FD-4, MW 4000, Sigma). Control y
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ratones fueron gavaged con FD-4 (400 mg /Kg de peso corporal), antes y después de 7 días 2,5% tratamiento DSS y los sueros se recogieron 4 horas más tarde. Serum FITC se midió en un fluorímetro (Synergy HT, BioTek®) a 485/20 de excitación, emisión 528/20. Para discos de determinaciones, los sueros se diluyeron 1:10 y se calentó a 70 ° C durante 15 minutos a inhibidores inactivos. luego LPS se midió usando el kit de cuantificación de endotoxina LAL cromogénico de acuerdo las instrucciones del fabricante (ThermoScientific, Rockford, IL). Suero TNFa e IL-1β se cuantificaron mediante ELISA utilizando kits comprados a BD Biosciences (San Jose, CA) o el amplificador de investigación y desarrollo;. D Systems (Minneapolis, MN) siguiendo las instrucciones del fabricante
en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
ARN total fue aislado de los tejidos intestinales utilizando Trizol ya sea bajo protocolos estándar o para muestras tratadas con DSS, usando la modificación descrito por Kerr et al [16]. Los ARN se cuantificaron utilizando pares de cebadores (secuencias disponibles bajo petición) diseñado por el software Primer Express (Applied Biosystems). abundancia relativa del mRNA se expresa en relación con los ratones control sin tratamiento DSS, normalizado a GAPDH.
contenido de lípidos del colon, el contenido de lípidos fecales y expresión de la proteína
Los lípidos totales se extrajeron de las heces, así como de proximal colon, tal como se describe anteriormente [11]. Triglicéridos (TG), colesterol total (CT) y de ácidos grasos libres (FFA) se midieron enzimáticamente usando kits de Wako (Wako Chemicals, Richmond, VA). Western Blot se llevó a cabo en anticuerpos de manera usando estándar cuya fuente se indica en la leyenda de la figura correspondiente. Para colon muestras de contenido TNFa y IL1β de colon descendente se homogeneizaron en tampón que contenía Tris 20 mM (pH 7,4), 1 ortovanadato mM de sodio, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton, fluoruro mM de sodio 50, 50 β-glicerofosfato mm y 1 × completo Mini cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Mannhein, Alemania). los niveles de TNF y IL1β se midieron en sobrenadantes clarificados utilizando los kits ELISA descrito anteriormente y se normalizó a la concentración de proteínas.
Primaria murino miofibroblastos intestinales
Los miofibroblastos se aislaron a partir /6 ratones de tipo salvaje C57BL como se describe [ ,,,0],17] y 1 × 10
5 células por pocillo fueron sembradas en placas de 6 pocillos y cultivadas durante la noche. El fenotipo de estas células se verificó mediante tinción positiva para la actina de músculo liso y vimentina y tinción negativa para desmina y citoqueratina [13], [17]. Estas células miofibroblastos se cultivaron a continuación durante 12 horas en DMEM que contiene 0,25% FBA y 0,6% Fatty albúmina de suero libre de bovino ácido (BSA, A8806, Sigma), suplementado con cualquiera de tampón solo (BSA, Control), 200 M Palmitato-BSA (PAL ), TNFa a 100 ng /ml (TNF) (aMP R y, d), IL1β a 10 ng /ml (IL1β) (R & amp; D) o combinaciones de 200 M palmitato-BSA más TNFa 100 ng /ml (TNFa + PAL) o 200 mM palmitato de BSA y IL1β 10 ng /ml (IL1β + PAL), como se indica en la leyenda. Todos estos estudios se realizaron en miofibroblastos en el paso 6-8. palmitato de sodio se conjuga con el ácido graso libre de ASB en relación de 02:01 (palmitato: BSA), para hacer un palmitato-BSA solución de reserva de 3 mm. ARN total fue extraído de muestras individuales y los ARNm se cuantificaron como se ha descrito anteriormente.
Análisis estadístico
Múltiples comparaciones de grupos de conjuntos de datos continuos se realizaron mediante análisis unidireccional de varianza seguido de post-hoc t -test utilizando Prism 4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) y Microsoft Excel. Los datos se presentan como medias ± SEM. Se analizaron los estudios de supervivencia mediante la prueba de log-rank. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
El aumento de la gravedad de la colitis DSS en ratones MTTP-IKO
Hemos administrado DSS al 2,5% en agua potable. durante 12 días con el fin de evaluar el impacto sobre la supervivencia global por el genotipo. Nuestros resultados revelaron que
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ratones muestran la muerte y la supervivencia acelerado notablemente reducida (1/10) en comparación con los ratones control (9/11) Figura 1A. El fenotipo aumentada lesiones en
MTTP-IKO
ratones se asoció con una mayor pérdida de peso en corto (7 días) experimentos (Figura 1C) y una demora en el retorno al peso basal (Figura 1B), junto con una reducción de la longitud del colon ( Figura 1D, E). No hubo lesión histológica también más severa como se evidencia por el aumento de la inflamación de la lámina propia y la cripta de abandono en el colon descendente en
MTTP-IKO
ratones tanto a los 5 días (Figura 2 A, B, E) y a los 7 días (Figura 2C, D, e) y la reducción de la proliferación celular como se evidencia por una disminución de la incorporación de BrdU (Figura 2 F).
A. Disminución de la supervivencia de
MTTP-IKO gratis (n = 10) frente a los controles de la misma camada (n = 12). 8-10 semanas ratones fueron alimentados con 2,5% de DSS en el agua potable durante 12 días seguidos y hasta 25 días. ** P & lt; 0,01. B. Peso curva de recuperación después de un ciclo de DSS. Los ratones (n = 4 ratones por grupo) fueron alimentados con 2,5% DSS durante 7 días y se pesa cada 1-3 días hasta 25 días después de la 1
er día del tratamiento DSS. * P & lt; 0,05. la pérdida de peso después del tratamiento C. 7 días DSS, n = 10 a 12 ratones por genotipo. Los datos se presentan como media ± SEM% del peso inicial. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 D. imágenes representativas de aspecto macroscópico del colon desde el control y
MTTP IKO
ratones después de 7 días de tratamiento DSS. E. longitud del colon a 0, 5 y 7 días de 2,5% DSS. Los datos son la media ± SE de 4-9 ratones por grupo * p & lt;.. 0,05
A. y B. Representante imágenes histológicas de las regiones comparables de colon distal de control (A.) y
MTTP-IKO
ratones (B.) después de 5 días de tratamiento DSS. Los paneles A y B muestran aumentaron lesión de la mucosa en
MTTP-IKO
ratones se caracterizan por aumento de la inflamación de la lámina propia que se extiende hasta la submucosa con pérdida de criptas. C. y D. Representante imágenes histológicas de las regiones comparables de colon descendente desde el control (C) y
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ratones (D.) después de 7 días de tratamiento DSS. Los paneles C y D muestran un aumento de la inflamación de la lámina propia, criptitis focal caracterizada por la infiltración neutrofílica y la cripta focal de abandono en
MTTP-IKO
ratones. Las barras indican 100 micras. E. estimación cuantitativa del daño histológico (n = 5-7 ratones por grupo). F. BrdU positivas células de las criptas de la mucosa rectal. Los datos fueron la media ± SEM de n = 5-6 ratones por grupo. * P & lt;. 0,05
administración de DSS no induce pequeña lesión intestinal en ratones macroscópica MTTP-IKO y no está asociada con la acumulación de lípidos colon
Nuestros estudios previos demostraron que el bloqueo de la secreción de quilomicrones del intestino de
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ratones resulta en la congestión de lípidos masivo con vellosidades distorsión [11], aumentando la posibilidad de que la alta mortalidad encontrado después de la administración de DSS podría reflejar el daño bruto en el intestino delgado de estos ratones. Sin embargo, este no fue el caso. Como se ve en la figura 3 dC, se observó la acumulación de lípidos esperada en pequeñas vellosidades intestinales en
MTTP-IKO
ratones, pero no había bruta o evidencia histológica de ulceración en cualquier región del intestino delgado después de 7 días de DSS tratamiento. Además, dado que MTTP se expresa en el colon de ratones (aunque a niveles bajos [18], [19]) se exploró la posibilidad de que la acumulación de lípidos colónica podría contribuir al fenotipo observado en
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ratones . Sin embargo, esto de nuevo no fue el caso. Como se ve en la Figura 3E-H, mientras que se detectó abundante acumulación de gotas de lípidos en el intestino delgado de los
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ratones (como se ha señalado anteriormente [11]) sólo había raras, osmio dispersa gotitas de lípidos tinción visto en el colon de los ratones
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y no hubo acumulación de triglicéridos, colesterol o ácido graso libre dentro de la mucosa del colon como detectable por ensayo enzimático (Figura 3I).
AD. Representante H & amp; E tinción de intestino delgado de Control y
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ratones bien sin tratamiento (DSS A. Control-0 y B. MTTP-IKO-0) o después de 7 días de tratamiento DSS (C. Control -7 y D. MTTP-IKO-7). Intestino delgado de
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ratones (B y D) muestra la acumulación de vellosidades lípidos (estructura vacuolar en H & amp; E tinción), pero ninguna lesión significativa o inflamación después de 7 días de tratamiento DSS (D vs B). E-H. Representante tinción tetróxido de osmio de gotitas de lípidos en el intestino delgado (E y F) y de colon (G y H) sin tratamiento DSS. las gotas de lípidos aparecen como imágenes de color marrón (flechas). Tenga en cuenta las gotas de lípidos abundantes en
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pequeñas enterocitos intestinales (F), en contraste con las gotas de lípidos sólo escasas en
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células epiteliales del colon (H). I. lípidos del colon fueron extraídos de control y
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ratones sin tratamiento DSS y lípidos especies (TG, TC y FFA) medidos. Los datos se presentan como la media ± SEM de 4-5 ratones por grupo.
El aumento de la permeabilidad intestinal en ratones MTTP-IKO y el papel de una respuesta de estrés adaptativo
Mientras que la hallazgos anteriores implican que no hay grandes alteraciones en la integridad de las vellosidades en
MTTP-IKO
ratones, se exploró la posibilidad de que las alteraciones más sutiles podrían estar asociados con la disfunción de la barrera. Para hacer frente a esta posibilidad, se administró FITC dextrano marcado por sonda a ratones de ambos genotipos, ya sea antes o después de 7 días de la administración de DSS. Nuestros resultados revelaron que los niveles séricos de FITC fueron significativamente mayores en
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ratones bajo ambas condiciones (Figura 4A). Estos hallazgos sugieren que se altera la función de barrera al inicio del estudio en
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ratones que se deteriora aún más en el contexto de la lesión DSS. A continuación consideramos la posibilidad de que el aumento de la permeabilidad intestinal fenotipo en
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ratones podría reflejar en parte las alteraciones en la expresión de las proteínas integrales de membrana que participan en el mantenimiento de la unión estrecha y cuya expresión alterada se ha relacionado con defectos en humanos enfermedad inflamatoria intestinal [20], [21]. Hemos encontrado que la expresión de HNF4α, ZO-1 y LAMB1 se redujo al inicio del estudio en el intestino delgado de los
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los ratones y se redujo después del tratamiento con DSS, sobre todo en los ratones control (Figura 4B). Hubo una disminución correspondiente en la ZO-1 de expresión en el colon tras el tratamiento con DSS respuestas similares en el control y
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ratones (Figura 4C).
A.
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y el control de los ratones, ya sea antes o DSS 7 días después del tratamiento DSS se administraron oralmente los niveles de FITC-dextrano y suero medidos 4 horas más tarde. Los datos son la media ± SEM de 7-8 ratones por grupo * P & lt;. 0.05. B. y C. mRNA expresión de genes relacionados con el estrés ER y functioin barrera epitelial en el intestino delgado y el colon. la expresión de ARNm se midió por QPCR y se expresa como factor de cambio en comparación con la no-DSS ratones tratados de control después de normalizaron con el control interno GAPDH. Los datos se presentan como la media ± SEM de 4-5 ratones por grupo. D. El efecto de TUDCA en la proporción de supervivencia de Control y
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ratones con DSS. ratones de 8-10 semanas fueron tratados con solución salina por vía intraperitoneal TUDCA o durante la administración simultánea de DSS (2,5%) en el agua potable durante 12 días. n = 5-9 cada grupo. * P & lt;.
0,05
También examinaron los parámetros de la respuesta desplegada proteína (UPR) y las vías de respuesta al estrés integrados en el intestino delgado y el colon de los dos genotipos y el impacto de la exposición a DSS. Esos resultados demostraron una mayor expresión basal de GRP78 y Chop en el intestino delgado de los
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ratones (Figura 4B), como se ha señalado anteriormente [22]. Sin embargo, el tratamiento DSS no produjo un aumento adicional en cualquiera de estos marcadores de estrés, sino más bien tiende a reducir la expresión de GRP78 y Chop en el intestino delgado de
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ratones (Figura 4B). Por el contrario, no hubo cambios en la línea de base UPR ARNm en el colon de
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ratones, pero el tratamiento DSS produjo un aumento de la abundancia de XBP-1 en ambos genotipos (Figura 4C). Estos hallazgos sugieren que no hay respuesta UPR línea de base en el colon de
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ratones. Para examinar la posibilidad de que una respuesta de estrés ER adaptativo podría influir en el fenotipo observado en la lesión
MTTP-IKO
ratones, se trataron ratones con el ácido tauroursodesoxicólico chaperona química (TUDCA) ya que los estudios anteriores han demostrado que esta estrategia atenúa la UPR en condiciones de estrés metabólico en ratones [22], [23]. Estos resultados ponen de manifiesto que el tratamiento TUDCA no para rescatar el fenotipo grave de DSS tratada
MTTP-IKO
ratones y en todo caso llevó a la muerte acelerada en estos animales (Figura 4D). Estos hallazgos juntos nos llevan a la conclusión de que las características de estrés ER y el EPU observaron en el intestino delgado de los
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ratones son adaptativa en la naturaleza y que la derogación de esta respuesta conduce a empeorar la lesión.
Enhanced la inflamación del colon en ratones MTTP-IKO en respuesta a una lesión DSS
Hemos observado el aumento esperado en la expresión de varios mRNAs de citocinas en el colon de ratones DSS, incluyendo IL-1β, IL-17A y tratada NLRP3, con la inducción comparable en ambos genotipos (figura 5A). Sin embargo se observó un mayor aumento en la expresión de TNF en el colon de DSS tratada
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ratones en comparación con los controles (Figura 5A). También se examinaron los niveles séricos de LPS, IL-1β y TNF, que se han asociado previamente con la lesión intestinal en ratones tratados con DSS [14], [24]. Esos resultados revelaron que los niveles de TNF en suero fueron consistentemente elevados en
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ratones, tanto al inicio del estudio y después del tratamiento con DSS mientras que los niveles séricos de LPS e IL-1β fueron más variables (Figura 5B-D).
A. la expresión de mRNA de los genes relacionados con la inflamación en el colon descendente de control y
MTTP-IKO
los ratones antes y después de 7 días de tratamiento DSS. mRNA se midió por QPCR y se expresó como cambios veces en comparación con los ratones de control no tratados con DSS después normalizó a GAPDH. Los datos se presentan como la media ± SEM de 5-9 ratones por grupo. * P & lt; 0,05. B.-D. citocinas en suero en el control y
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ratones. Se recogió sangre de control y
MTTP-IKO
ratones antes o 7 días después del tratamiento DSS. Se midieron LPS séricos (B), IL1β (C) y los niveles de TNFa (D) como se describe en Métodos. Los datos son la media ± SEM de 8-10 ratones por grupo. * P & lt;. 0,05
lesiones del colon y la inflamación se asocia con una mayor susceptibilidad a la CAC en ratones MTTP-IKO
Un cuerpo sustancial de los datos sugiere que la inflamación es un importante motor de la tumorigénesis y el trabajo sugiere una relación causal mediado a través de las vías de participación de citoquinas inflamatorias de señalización [25], [26]. Dada la propensión de los
MTTP-IKO
ratones para manifestar un fenotipo más grave en respuesta a DSS lesión mediada, nos preguntamos si este aumento de la inflamación del colon se asocia con una alteración de la carga tumoral del colon después de la administración de azoximetano seguido de tres ciclos de DSS (Figura 6A). Los resultados revelan un mayor número de tumores (Figura 6B) y la carga tumoral global (Figura 6 C, D) (verificado por un examen patológico por un patólogo sin conocer el genotipo) en
ratones MTTP-IKO
en asociación con el aumento de la proliferación celular, evidenciado por la incorporación de BrdU (Figura 6 E, F).
A. Panel superior: Vista esquemática del protocolo OMA /DSS (detalle en Métodos). Los ratones fueron sacrificados 12 días después del último ciclo de DSS. n = 13 a 15 ratones de cada grupo. Panel inferior: Porcentaje de cambio de peso durante el tratamiento AOM-DSS. B. representativos fotos del colon. C. Número de tumores colorrectales por ratón inducida por el tratamiento AOM-DSS. D. La carga tumoral en AOM-DSS tratado de control y
ratones MTTP-IKO
. Los datos de los paneles D. se expresan como medias ± SEM de área del tumor normalizado al área total del colon, n = 9-10 ratones de cada grupo. E. F. y aumento de la proliferación de pólipos mediante tinción con BrdU. (E) es una foto representativa, el panel superior es un pólipo de control, panel inferior es de un
MTTP-IKO
pólipo. (F) es el gráfico de barras de media ± SEM (n = 5-6 ratones por grupo). * P & lt;. 0,05
señales inflamatorias, junto con la señalización de ácidos grasos alterada crecimiento secreción de mediadores unidad en ratones MTTP-IKO
Con el fin de entender con mayor profundidad los mecanismos que subyacen al fenotipo proliferativo observado en el colon de
MTTP-IKO
ratones en respuesta a OMA /DSS, que de nuevo el examen de los patrones de expresión de IL-1β y TNF. Se observó el aumento de la abundancia de ARNm de IL-1β en
MTTP-IKO
ratones (Figura 7A) y una tendencia al aumento de la expresión de la proteína IL-1β (Figura 7B). La expresión de TNF mRNA fue comparable por el genotipo, pero se observó un aumento significativo en los niveles de proteína TNF en el tejido de colon de
MTTP-IKO
ratones (Figura 7B). Estos hallazgos apoyan la hipótesis más que una respuesta inflamatoria alterada probablemente contribuye al aumento de la carga tumoral observada en
MTTP-IKO
ratones.
A. la expresión de ARNm alterados de genes relacionados con la inflamación y el crecimiento. La expresión génica en OMA tratados con DSS /colon descendente se midió por QPCR y se expresa como factor de cambio en comparación con los ratones de control después de la normalización a GAPDH. Los datos son la media ± SEM (n = 4 por grupo). * P & lt; 0,05. B. El contenido de proteína de IL1β y TNFa en homogeneizados de colon descendente de la OMA /control tratados con DSS y
MTTP-IKO
ratones se midió por ELISA. Los datos son la media ± SEM (n = 4 por grupo). * P & lt; 0,05. C. Análisis de transferencia Western de anfirregulina (Areg), (1:1000 dilución del anticuerpo primario de Thermo Fisher Scientific, Cat#RB-258); Akt (1:1000 de anticuerpo primario de Señalización Celular, Cat#9272); p-Akt (1:1000 de anticuerpo primario de Señalización Celular, Cat#9271) en homogeneizado de las muestras preparadas (métodos) de los tejidos mencionados anteriormente en B. D. Western blot se cuantificó por la estación de imágenes Kodak 440 y el software Carestream MI SE. gráfico de barras que refleja la media ± SEM de expresión relativa en comparación con el control después de la normalización a GAPDH. E. fecal especies de lípidos en el control de chow-alimentados y
MTTP-IK
ratones S. Total de lípidos fecales fueron extraídos y colesterol (Chol), triglicéridos (TG), fosfolípidos (PL), y ácidos grasos libres (FFA) cuantificaron enzimáticamente. contenido de lípidos se presenta como g /g de heces y el contenido de FFA se presenta también como mol /g de heces (recuadro). Los datos son la media ± SEM (n = 4-5 por grupo) ** p & lt; 0,01. F. abundancia de ARNm de Areg y Ereg en miofibroblastos intestinales primaria después de la estimulación indicada. Los miofibroblastos se estimularon con factores indicados durante 12 horas. Génica (ARNm) de expresión se midió por QPCR y se expresa como factor de cambio en comparación con las células control después de la normalización a GAPDH. Los experimentos se realizaron dos veces con triplicados para cada experimento. Los datos se presentan como media ± SEM. La diferencia entre los valores de grupo es indicado por una letra diferente para indicar la significación estadística (p & lt; 0,05 o mayor). El análisis de transferencia Western G. de expresión de la proteína Areg en homogeneizado de mucosa intestinal de control y
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ratones con dieta occidental durante 2 semanas.
Para explorar los mecanismos en juego en este respuesta, se realizó un examen de posibles mediadores de este fenotipo pro-proliferativa. Transcripción de perfiles no reveló cambios significativos en la expresión de ARNm de varios mediadores candidatos (Figura 7A), pero hubo una tendencia a una mayor expresión de la proteína anfiregulina y un aumento en la abundancia de fosfo-Akt (Figura 7C, D). Estos resultados nos sugiere que la secreción de mediadores de miofibroblastos intestinales podría desempeñar un papel en la modulación del crecimiento a través de vías paracrinos. En apoyo de esta posibilidad hay trabajo que muestra un papel para la producción del estroma miofibroblastos de anfirregulina y epirregulina para promover el crecimiento del tumor de colon en el contexto de colon humano inflamado [27]. Nuestro enfoque se basó en los hallazgos anteriores que demuestran que las pequeñas células epiteliales intestinales de
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ratones sufren lesiones lipotóxico siguientes alimentación alta en grasa corto plazo [22]. Sobre la base de estas observaciones, por la sospecha de que la promoción de un crecimiento sostenido de efectos intestinal
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eliminación fueron potencialmente mediada por miofibroblastos.
Con el fin de explorar esta posibilidad en mayor detalle, que se volvió a murino primaria miofibroblastos intestinales con el fin de examinar anfirregulina y regulación epirregulina. Establecimos en primer lugar que el contenido de lípidos fecales se incrementó como resultado de la mala absorción de grasas en el
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ratones, tal como se documenta anteriormente [11]. En particular, hemos demostrado un aumento de la abundancia de ácidos grasos libres en heces (FFA), así como un mayor contenido de colesterol y fosfolípidos en
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ratones (Figura 7E). Se determinó que la concentración de FFA fecal en los ratones de control (~ 60 mmol /g) fue similar a la reportada recientemente [28]. Nos centramos nuestra atención en los ácidos grasos saturados abundantes, la selección de ácido palmítico como un objetivo inicial en el que examinar la regulación de ambas anfirregulina y epirregulina [29]. Nuestros hallazgos demuestran la regulación al alza notable de anfiregulina y el ARNm epirregulina en miofibroblastos intestinales primaria murino por 200 palmitato M (Figura 7E). Además, la inducción conocida de anfirregulina y epirregulina por TNFa e IL-1β [30] se mejoró aún más por la inclusión de palmitato (Figura 7E). Estos hallazgos sugieren que los ácidos grasos desempeñan un papel en la modificación de respuestas de crecimiento en combinación con otros mediadores conocidos. En línea con esta sugerencia que demostró una mayor expresión intestinal pequeña de expresión anfirregulina en
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ratones después de la exposición a una dieta occidental alta en grasa (Figura 7F, G). Tomados en conjunto, los resultados sugieren fuertemente que el aumento de la disponibilidad de ácidos grasos de colon, producida por el montaje del intestino delgado defectuosa quilomicrones y el consiguiente bloqueo en la absorción normal de los lípidos, exacerba las vías de adaptación inflamatorias y otras que aumentan la proliferación de colon.
Discusión