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PLOS ONE: KCN1, un agente anticancerígeno sintético sulfonamida Novel: En vitro e in vivo anti-cáncer pancreático Actividades y preclínicos Pharmacology


Extracto

El objetivo del presente estudio fue determinar la
in vitro
y propiedades
actividad in vivo
contra el cáncer y farmacológicas de 3,4-dimethoxy-
N
-[(2,2-dimethyl-
2H
-chromen-6-yl)methyl]-
N
-phenylbenzenesulfonamide, KCN1. En el presente estudio, se investigó el
in vitro
actividad de KCN1 sobre la proliferación celular y la distribución del ciclo celular de las células de cáncer de páncreas, el uso de los ensayos de MTT y BrdUrd, y citometría de flujo. El
in vivo
efectos anticancerígenos de KCN1 fueron evaluados en dos modelos distintos de xenoinjertos de cáncer de páncreas. También hemos desarrollado un método de HPLC para la cuantificación del compuesto, y examinamos su estabilidad en plasma de ratón, unión a proteínas plasmáticas, y la degradación por las enzimas microsomales ratón S9. Además, hemos examinado la farmacocinética de KCN1 después de la inyección intravenosa o intraperitoneal en ratones. Los resultados mostraron que, de una manera dependiente de la dosis, KCN1 inhibió el crecimiento celular y la detención del ciclo celular inducida en células de cáncer de páncreas humano
in vitro
, y mostraron
in vivo contra el cáncer
eficacia en ratones portadores de Panc xenoinjertos de tumores -1 o Mia Paca-2. El método HPLC proporcionado detección lineal de KCN1 en todas las matrices en el intervalo de 0,1 a 100 mM, y tenía un límite inferior de detección de 0,085 M en plasma de ratón. KCN1 era muy estable en plasma de ratón, ampliamente plasma unida, y metabolizados por las enzimas microsomales S9. Los estudios farmacocinéticos indicaron que KCN1 podría ser detectada en todos los tejidos examinados, la mayoría de por lo menos 24 h. En conclusión, nuestros datos preclínicos indican que KCN1 es un potencial agente terapéutico para el cáncer de páncreas, proporcionando una base para su desarrollo futuro

Visto:. Wang W, L Ao, Rayburn ER, Xu H, X Zhang, Zhang X, et al. (2012) KCN1, un sintético nuevo agente contra el cáncer sulfonamida:
in vitro
y
En Vivo
Anti-cáncer pancreático Actividades y Farmacología Preclínica. PLoS ONE 7 (9): e44883. doi: 10.1371 /journal.pone.0044883

Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América

Recibido: 16 de febrero de 2012; Aceptado: 15 de agosto de 2012; Publicado: 13 Septiembre 2012

Copyright: © Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de subvención R01 CA116804 (a EGVM). RZ también fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 CA112029 y R01 CA121211. EGVM también fue apoyada por EmTechBio, el Comité de Investigación de la Universidad de Emory University, la Fundación tumor cerebral a los niños, y la Fundación V para la Investigación del Cáncer. HW fue apoyada por los cien talentos del programa, de la Academia China de Ciencias, las donaciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (30870513, 31070680, 91029715 y 81025017) y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2007CB947100), Nacional de Ciencia y Proyecto de Tecnología Major Key Nuevos Creación de drogas y programa de fabricación 2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011). MW fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01 CA91980. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer sigue siendo un problema importante de salud pública en todo el mundo. Cada vez hay más descubrimientos preclínicos y clínicos que han superadas el pronóstico de los pacientes con diagnóstico de cáncer, especialmente cáncer de mama y de próstata. Por el contrario, ha habido mejoras sólo mínimos en la evolución de los pacientes con cáncer de páncreas. El cáncer de páncreas se caracteriza por su naturaleza invasiva, la capacidad para evadir la terapia agresiva, y frecuente etapa tardía diagnóstico [1]. La tasa de mortalidad por cáncer de páncreas sigue siendo alta, con una supervivencia media de sólo el & lt; 10 meses después del diagnóstico [1] - [4]. Hay una necesidad urgente para el desarrollo de agentes eficaces y seguros novedosos para el tratamiento del cáncer de páncreas.

Hemos estado interesados ​​en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para el cáncer de cánceres humanos con ningún tratamiento efectivo actual, tales como tumores cerebrales y cáncer de páncreas. Una característica única de cánceres sólidos es que su rápido crecimiento a menudo resulta en la reducción de la disponibilidad de oxígeno debido a la formación de la vasculatura inadecuada o aberrante [5]. La fracción hipóxica de los tumores sólidos es resistente a la radioterapia [6] y la quimioterapia convencional [7] - [10], y la hipoxia se correlaciona con un mal resultado terapéutico [7], [8], [11], [12]. A nivel molecular, el factor de transcripción inducible por hipoxia Factor-1 (HIF-1) ha sido identificado como el Orchestrator clave de la respuesta biológica a la hipoxia debido a su transactivación de genes que están involucrados en muchos aspectos del crecimiento tumoral maligno de la supervivencia celular y el metabolismo de la angiogénesis y la invasión [13] - [16]. La sobreexpresión de HIF-1 da como resultado la activación constitutiva de sus vías diana [13] - [18]. HIF-1 es un factor de transcripción heterodimérico que consiste en dos subunidades, HIF-1a, que es regulado por el oxígeno, y HIF-1β, que se expresa de forma constitutiva. Varios inhibidores dirigidos expresión de HIF-1α o sus actividades han sido diseñadas para el tratamiento de los cánceres; sin embargo, ninguno de estos compuestos sin embargo, ha tenido éxito debido a la toxicidad compuesto, actividad limitada, o pobres propiedades farmacológicas [18] - [25]. Hemos desarrollado recientemente un nuevo sulfonamida arilo sintético, denominado KCN1 (Fig. 1A) que se pensó inicialmente para apuntar vía de HIF-1α. Sin embargo, en estudios recientes, KCN1 se ha demostrado que ejercen sus actividades contra el cáncer, tanto en condiciones de normoxia e hipóxicas en líneas celulares de cáncer de glioma humano [26] - [31]. Nuestros estudios sobre los mecanismos posteriores han indicado que KCN1 tiene actividades significativas citostáticos HIF-1a-independiente. El presente estudio fue diseñado para determinar el
in vitro en
y
in vivo
actividad anticancerígena de KCN1 en el cáncer pancreático y sus propiedades farmacológicas.

(A) Estructura química de la KCN1. actividad inhibidora (B) Crecimiento de las células de KCN1 en células de cáncer de páncreas humano. Las células se expusieron a diversas concentraciones de KCN1 durante 72 h, seguido de un ensayo de MTT. actividad inhibitoria (C) Crecimiento de las células de KCN1 de una manera dependiente del tiempo. Las células se expusieron a KCN1 para diferentes puntos de tiempo, seguido de un ensayo de MTT. (D) Inhibición del crecimiento independiente de anclaje por KCN1 en células de cáncer pancreático. Las células se trataron con varias concentraciones de KCN1 en agar blando. Los cultivos se mantuvieron en la incubadora durante dos semanas, a continuación, se observaron las colonias de células y se calificó con un microscopio. efecto (E) Anti-proliferativa de KCN1 en células de cáncer de páncreas humano. Las células se expusieron a diversas concentraciones de KCN1 durante 24 h, seguido de la medición de la proliferación celular usando el ensayo de BrdUrd. El índice de proliferación se calculó frente a las células control sin tratar. efecto (F) apoptótica de KCN1 en las células de cáncer de páncreas humanos. Las células se expusieron a diversas concentraciones de KCN1 durante 48 h, seguido de la medición de la apoptosis mediante un ensayo de anexina V. El índice apoptótico se calculó frente a las células de control no tratadas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. (
#p & lt; 0,05, * p & lt; 0,01).

Debido a la distribución y disposición de un agente dentro del cuerpo es vital para determinar su eficacia y toxicidad, los primeros estudios farmacocinéticos son de gran importancia para el desarrollo de drogas [32], [33]. Tales estudios pueden proporcionar información sobre la ruta más eficaz y la frecuencia de administración, así como una indicación de la eficacia del agente será contra los tumores en diferentes sitios dentro del cuerpo. También pueden indicar posibles sitios de acumulación del fármaco y /o la toxicidad [32], [33]. En el presente estudio, hemos tratado de caracterizar las propiedades farmacológicas de KCN1 en la configuración preclínica, con respecto a su estabilidad en plasma, unión a proteínas plasmáticas, biodisponibilidad y distribución tras la administración sistémica a ratones. Estos resultados demuestran la eficacia anti-tumoral y las propiedades farmacológicas favorables de este nuevo agente, apoyando su desarrollo hacia ensayos clínicos.

Resultados

KCN1 tiene
in vitro
Anti- actividad células del cáncer contra cáncer pancreático

la inhibición del crecimiento de células cancerosas.

el
in vitro
actividad anticancerígena en los de KCN1 se evaluó mediante el ensayo MTT. Cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas humano (HPAC, Panc-1, BxPC3, y Mia Paca-2) fueron cultivadas con el compuesto a varias concentraciones que van desde 0 hasta 100 mM durante 72 h, y se determinó la viabilidad celular. Los efectos inhibidores del compuesto sobre el crecimiento celular se ilustran en la Fig. 1B. KCN1 inhibió el crecimiento de células de cáncer de una manera dependiente de la dosis, que representan el 83% (P & lt; 0,01), 53% (P & lt; 0,01), 81% (P & lt; 0,01) y 61% (P & lt; 0.01) inhibición a 100 micras en la HPAC, Panc-1, BxPC3, y las células Mia Paca-2, respectivamente. La línea celular Panc-1 es conocido para expresar la proteína asociada a resistencia a múltiples fármacos 1 (MRP1) y se sabe que muestran resistencia a varios fármacos terapéuticos contra el cáncer. Esta podría ser la razón por la que eran más resistentes al tratamiento KCN1 en comparación con otras células. Higo. 1C mostró el curso de tiempo de la inhibición del crecimiento con el tratamiento KCN1 en las cuatro líneas celulares, lo que sugiere la respectiva sensibilidad al compuesto como BxPC3 & gt; HPAC & gt; Mia Paca-2 & gt; Panc-1. Como se muestra en la Fig. 1D, HPAC y Panc-1cells se suspendieron en agar blando y las colonias se enumeraron después de 14 días de incubación de KCN1. KCN1 disminuyó el número de colonias formadas en HPAC y células Panc-1 por 4 y 3 veces, respectivamente.

La inhibición de la proliferación de células cancerosas.

El efecto dependiente de la dosis de KCN1 en la proliferación de células se examinó con un ensayo de incorporación de BrdU (Fig. 1E). Se observaron los efectos antiproliferativos en todas las cuatro líneas celulares. A una concentración de 50 mM, KCN1 inhibió la proliferación en aproximadamente un 80% (P & lt; 0,01), 56% (P & lt; 0,01), 88% (P & lt; 0,01) y 60% (P & lt; 0,01) en el HPAC, Panc- 1, BxPC3, y células Mia Paca-2, respectivamente. BxPC3 células eran más sensibles al tratamiento KCN1 a la concentración más alta que las otras tres líneas celulares.

Efectos sobre la apoptosis.

También examinedwhetherKCN1 tenido un efecto sobre la apoptosis celular en células de cáncer pancreático (fig . 1F). Después de un tratamiento de 48 h, KCN1 mostró efectos apoptóticos insignificantes o débiles tras la exposición a una concentración 50 mM del compuesto. KCN1 fue capaz de inducir apoptosis sólo en las células HPAC (índice apoptótico: 1,4 veces). El fármaco no mostró actividad apoptótica detectable en las otras tres líneas celulares. Estos resultados indican que la inducción de la apoptosis puede no ser los principales mecanismos anticancerígenos para KCN1.

detención del ciclo celular en la fase G1.

En las cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas diferentes, a las 24 h tratamiento, KCN1 la detención del ciclo celular inducida significativamente en la fase G1 de una manera dependiente de la dosis, con efectos iniciales a partir de las 5 micras de HPAC (P & lt; 0,01), BxPC3 (P & lt; 0,01), y Mia Paca-2 (P & lt; 0,01 ) las células, y 12,5 micras de Panc-1 (P & lt; 0,01) las células (Tabla 1). Estos resultados indican que la inducción de la detención del ciclo celular puede ser un mecanismo importante para la lucha contra el cáncer KCN1.

KCN1 modula la expresión de proteínas relacionadas con el ciclo celular

Se investigaron los posibles mecanismos responsable de los efectos de regulación anti-proliferativos y del ciclo celular de KCN1 mediante la evaluación de sus efectos sobre el nivel de expresión de diversas proteínas implicadas en la regulación de la proliferación celular y la progresión del ciclo celular (Fig. 2). En las cuatro líneas celulares, el tratamiento con KCN1 (12 h y 24 h) dieron lugar a diversos niveles de disminución de expresión de reguladores del ciclo celular E2F1, CDK2, Cdk4, Cdk6, Cdc25C, ciclina D1, ciclina y E. En contraste, la exposición a KCN1 aumentó la expresión de p21 y p27 en las cuatro líneas celulares. Estas proteínas están implicadas principalmente en la progresión del ciclo celular y la salida del punto de control. Estos resultados indican además que KCN1 ejerce su actividad anti-cáncer a través de la detención del ciclo celular.

HPAC, Panc-1, las células de cáncer de páncreas Mia Paca-2 y BxPC3 se expusieron a varias concentraciones del compuesto de 12 o 24 h y, a continuación, marcar las proteínas relacionadas con la progresión del ciclo celular fueron examinados por Western Blot.

KCN1 inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjerto

para determinar si el compuesto era eficaz contra
en vivo
tumores, se evaluó el efecto antitumoral de la administración sistémica de KCN1 en contra de la Paca-2 modelos de xenoinjerto subcutáneo Mia Panc-1 y en el
nu /nu
ratones. El tratamiento sistémico intraperitoneal (i.p.) con KCN1 (30 o 60 mg /kg en un Cremophor 01:01: formulación de etanol; 5 días /semana) se inició una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm
3
. El compuesto redujo significativamente el crecimiento de los tumores de xenoinjertos pancreáticas de una manera dependiente de la dosis. se observó a la dosis de 30 mg /kg y de 61% (P & lt; 0,01), en el modelo de xenoinjerto de Panc-1, la inhibición del crecimiento del tumor de aproximadamente 46% (0,01 P & lt) en la dosis de 60 mg /kg en el Día 21 (Fig . 3A1). Se observaron resultados similares en el modelo de xenoinjerto de Mia Paca-2. Este modelo parece ser casi de manera similar sensible a la droga, con la dosis baja (30 mg /kg) y dosis alta (60 mg /kg) la disminución de crecimiento del tumor en aproximadamente un 43% (P & lt; 0,01) y 57% (P & lt; 0,01 ), respectivamente (Fig. 3B1). Además, no hubo diferencias significativas en los pesos corporales entre los controles y los animales tratados con KCN1 en ambos modelos de xenoinjerto (Figs. 3A2 y B2), indicando que no hay toxicidad para el huésped obvio a las dosis terapéuticas de KCN1.
Se administró
KCN1 por ip inyección a ratones desnudos portadores de Panc-1 (A1) o Mia Paca-2 (B1) tumores de xenoinjertos. KCN1 se administró mediante inyección i.p. inyección en dosis de 30 y 60 mg /kg /d, 5 días /semana durante 3 semanas para Panc-1 modelo de xenoinjerto y 6 semanas para Mia Paca-2 modelo de xenoinjerto, respectivamente. Los grupos de control recibieron sólo el vehículo. los volúmenes de los tumores se midieron cada tres días. Los animales también fueron controlados por los cambios en el peso corporal como un marcador sustituto para la toxicidad cuando se administró a ratones desnudos portadores (A2) Panc-1 o (B2) Mia Paca-2 xenoinjertos de tumores.

Una método HPLC para KCN-1 el análisis se desarrolló y validó

el método HPLC se obtiene la curva de calibración lineal en plasma de ratón para el intervalo de concentraciones de 0,1-100 investigado M. El coeficiente de correlación media (
r

2) para las curvas de calibración diarias era = 1,000. Las curvas de calibración también se produjeron en los homogeneizados de diversos tejidos de ratón, incluyendo el cerebro, el músculo esquelético, los riñones, los pulmones, el bazo y el corazón, que tenía los coeficientes de correlación de al menos 0.992 para las mismas concentraciones. Las variaciones de exactitud, precisión, intra-día y entre días fueron aceptables, con coeficientes de variación (CV) entre 4,25% y 12,62%, y el límite inferior de detección (LOD) en plasma fue 0,085 M. La recuperación del compuesto en las diversas matrices varió de ~96% a ~107%. cromatogramas representativos de plasma de ratón en blanco, plasma de control del ratón sobrecargadas con 1, 5, 25, y 50 mM KCN1 se muestra en las Figs. 4A-E. Se obtuvieron cromatogramas similares para los otros tejidos examinados (datos no mostrados). La especificidad se demostró por la ausencia de cualquier interferencia endógeno en las muestras biológicas en el tiempo de retención de los picos de KCN1
.
(A) KCN1 en el control (sin drogas) plasma de ratón y plasma de ratón se disparó a contener 1, 5, 25, y 50 mM KCN1; Una muestra de plasma del ratón y plasma de ratón blanco de muestra se trataron con 1 M (B), 5 M (C), 25 M (D), y 50 mM (E) KCN1.

KCN1 es estable en ratón de plasma a diferentes temperaturas durante períodos prolongados

KCN1 fue estable en plasma de ratón a 37 ° C, con más de 80% del compuesto que queda después de una incubación de 8 horas, tanto para el bajo (1 M) y alta ( 10 mM) concentraciones. También se encontró que KCN1 se puede almacenar a 4 ° C durante al menos 24 horas, con más de 90% del compuesto restante (Fig. 5A1), o a 37 ° C durante al menos 8 horas, con más de 85% del compuesto restante (Fig. 5A2), o a -80 ° C durante un máximo de 4 semanas, con más del 92% del compuesto restante (Fig. 5A3).

Estabilidad de KCN1 en plasma de ratón a 37 ° C ( A1), 4 ° C (A2), y -80 ° C (A3). (B) La degradación de KCN1 por fracciones aisladas de hígado S9 ratón.

KCN1 une a la proteína de plasma Ampliamente

KCN1 une ampliamente a las proteínas en el plasma de ratón, con la baja (1,0 M) y (10,0 mM) concentraciones altas demostrando 90,96% y el 99,32% del compuesto que se une a las proteínas plasmáticas, respectivamente.

KCN-1 es metabolizada por las enzimas S9 (Fase I)

Debido a que apareció KCN1 para ser metabolizado o degradado en plasma de ratón ampliamente, se realizó un estudio preliminar del mecanismo (s) por el cual el potencial KCN1 se metaboliza mediante el ensayo de S9. Este ensayo se puede utilizar para determinar si el compuesto se metaboliza
vía
fase I (sistemas de NADPH-regeneración) o enzimas extraídas de microsomas de ratón fase II (UDPGA y PAPS). Los estudios S9 indicado que KCN1 tiene una relativamente larga vida media en presencia de las enzimas II (conjugación) microsomales de fase. Sin embargo, hubo una disminución de más del 60% en la cantidad de KCN1 observó cuando se incubó con la fase I de ratón (oxidación) enzimas (Fig. 5B), lo que sugiere que es probable metabolizado por la fase I de la enzima (s).

KCN1 tiene una vida media más larga y amplia distribución tisular en ratones después de las administraciones intravenosa e intraperitoneal

el análisis de las muestras de plasma recogidas de los ratones dosificados con KCN1 (35 mg /kg) mostraron que las concentraciones plasmáticas de la compuesto eran todavía detectable para ambas cepas al menos 6 horas después de la vía intravenosa (IV) inyecciones, y fueron detectables incluso 24 h después de la administración intraperitoneal (IP) (Fig. 6A y 6B). Después de bolo I.V. administración, las concentraciones en plasma fueron mayores que 5 mg /ml a los 5 minutos, tanto para CD-1 (9,98 mg /ml) y de los ratones nude (5,19 mg /ml). Estos niveles se redujeron a & lt; 0,3 mg /ml a las 6 horas después de la dosis en ambas cepas. Después I.P. la dosificación, los niveles en plasma alcanzaron su máximo a los 30 min en ratones CD-1 y en 2 h en ratones desnudos. En general, I.V. la administración dio el valor de AUC plasmática y C
valores máximos, pero inferiores T
1/2 en comparación con los valores de la I.P. la vía de administración (Tabla 2).

Plasma curvas de concentración-tiempo para KCN1 siguientes IV (A) y (B) por inyección IP de 35 mg /kg en ratones CD-1 y desnudos (nu /nu). distribución dependiente del tiempo de KCN1 en diversos tejidos siguiente (C) la administración IV o (D) la administración IP de 35 mg /kg del compuesto. Las columnas representan los ratones desnudos, mientras que las pirámides representan los ratones CD-1.

De interés, KCN1 se pudo detectar en la mayoría de los tejidos muestreados (corazón, pulmones, hígado, bazo, riñones y el músculo esquelético; Fig. 6C y 6D) de ambas cepas durante al menos 24 h después de la administración por cualquier ruta. Sin embargo, el compuesto no puede ser detectado después de 6 h en el cerebro de cualquiera de las cepas de ratones después de ambas vías de administración. Los parámetros farmacocinéticos se calcularon para el plasma y los diversos tejidos (Tabla 2). Los valores más altos de las AUC en ambos desnudos y los ratones CD-1 siguientes I.V. la inyección se encontraban en los pulmones, el hígado y el bazo y los tejidos con los más bajos valores de AUC siguientes I.V. inyección fueron el plasma, cerebro y músculo esquelético. La alta concentración observada en los pulmones después de I.V. inyección fue probablemente debido a la acumulación de fármaco precipitado, aunque esto no fue verificada experimentalmente. En ambas cepas de ratones, el bazo tenía la más alta siguiente AUC I.P. inyección, seguido por el hígado. El plasma y el cerebro tuvieron los valores más bajos de las AUC para ambas cepas tras la administración i.p. inyección
.
De los 35 mg /kg de KCN1 administra por vía intravenosa, a menos de 1% de la dosis total KCN1 se recuperó como KCN1 parental de la orina de tanto los ratones CD-1 y nude durante la primera 24 hr , con menos de 0,5% siendo recuperado de ambas cepas siguientes IP inyección. Aproximadamente el 1% de la dosis inicial del compuesto parental se recuperó en las heces de los ratones tras la administración i.p. inyección, y menos de 1% se recuperó después de I.V. inyección (datos no mostrados).

Discusión

inhibidores de la vía HIF representar un nuevo agente terapéutico dirigido. Aunque el éxito ha sido visto usando agentes de direccionamiento moléculas individuales (por ejemplo, Herceptin, Gleevec), estos agentes son típicamente limitadas en relación a los tipos de cáncer, y para subclases dentro de los tipos de cáncer, que se pueden tratar. Debido KCN1 inhibe un proceso fisiológico (hipoxia) que es inherente a la formación de tumores, en lugar de un objetivo específico del tipo de cáncer, el agente potencialmente se puede utilizar para tratar una variedad de diferentes tipos de cáncer, incluyendo aquellos para los que hay actualmente no efectiva tratamientos de cáncer, especialmente de páncreas.

El compuesto de ensayo KCN1 fue diseñado inicialmente como un HIF-1α-inhibidor, pero sus efectos inhibidores sobre la proliferación celular y el crecimiento nos ha llevado a especular sobre si podría tener un efecto en condiciones de normoxia. HIF-1α también juega un papel importante en la regulación del ciclo celular. Bajo condiciones de hipoxia, que se estabiliza dando lugar a la supervivencia del tumor
a través de
aumento de la angiogénesis y la glucólisis anaeróbica. Sorprendentemente, HIF-1α también hasta regula genes que promueven la detención del ciclo celular y la apoptosis, tales como p21, p27, p53 [34], [35]. En vista de esto, los beneficios de la inhibición de HIF-1α en la terapia del cáncer parecen cuestionable, ya que puede deshacer la detención del ciclo celular en condiciones de hipoxia y prevenir la muerte celular. Estos efectos contradictorios pueden limitar el efecto anticancerígeno de los inhibidores de HIF-1α [34], [35]. Sin embargo, si los inhibidores de HIF-1α tienen el efecto adicional de inducir la detención del ciclo celular o muerte celular, podrían ser mejores proposiciones como agentes anti-cáncer. Por lo tanto, es imperativo, mientras que el desarrollo de inhibidores de HIF-1α como agentes anticancerígenos para evaluar sus efectos sobre el ciclo celular y la muerte celular.

El presente estudio es el primero en investigar sistemáticamente la
in vitro
y
in vivo
efectos antitumorales de KCN1 en células de cáncer de páncreas en forma de HIF-1α-independiente. Hemos observado que KCN1 disminuyó significativamente el crecimiento de células de cáncer de páncreas y la proliferación, y nos llevaron a la detención del ciclo celular en condiciones de normoxia (20% O
2) las condiciones de cultivo. Después de evaluar los efectos del compuesto sobre
in vitro
proliferación, la progresión del ciclo celular y la apoptosis, se concluye que la detención del ciclo celular es el mecanismo principal por el que el compuesto ejerce sus efectos citostáticos en cultivo celular. la detención del ciclo celular es una de las estrategias más efectivas para inhibir el crecimiento del tumor [36]. En el presente estudio, se encontró que la detención del ciclo celular mediada por KCN1 se logró
a través de una modulación de
inhibidor de ciclina quinasa (CKI) - ciclina quinasa dependiente de ciclina (CDK) las máquinas que operan en la fase G1 del ciclo celular. Una familia de complejos de la proteína quinasa orquesta progresión del ciclo celular en eucariotas [37]. Cada complejo está compuesto mínimamente de una subunidad catalítica, la cdk, y su socio de activación esencial, la ciclina. Varias combinaciones de las ciclinas y cdk controlan el ciclo celular en diferentes puntos [37]. Por ejemplo, la ciclina E se expresa transitoriamente durante la transición G1 /S y se degrada rápidamente una vez que la célula entra en la fase S [38]. Ciclina E regula Cdk2 mientras Ciclina D1 regula Cdk4 y Cdk6 [38]. Estos complejos se activan en varios puntos de control después de intervalos específicos durante el ciclo celular, pero también pueden ser inducidos y regulados por factores exógenos [37] - [39]. Las cdks están sometidos a la inhibición por la unión de CKI tales como el PIC KIP (p21, p27) y INK4 familias /de las proteínas [37] - [39]. La transcripción de los genes necesarios para la transición G1 /S como la ciclina E y la ciclina D1 se inicia por E2F1, que está bajo el control del supresor de tumor Rb [37] - [39]. En este estudio, se examinó la influencia de KCN1 en la expresión de varias proteínas que se sabe están implicados en estos procesos. En las cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas prueba, encontramos disminución de la expresión de cycleproteins celulares, incluyendo E2F1, ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4 y Cdk6, y la expresión aumentada de p21 y p27. Mientras KCN1 induce la detención del ciclo celular en líneas celulares de cáncer de páncreas, tenía poco efecto citostático sobre las células de glioma y los fibroblastos inmortalizados, lo que sugiere que sus efectos pueden ser del tipo de célula dependiente [31]. Para confirmar la eficacia terapéutica del compuesto, sino que también fue investigado por
in vivo
efectos. KCN1 disminuyó el crecimiento tanto de Mia Paca-2 tumores de xenoinjertos Panc-1 y
.
Dado que no existen informes publicados acerca de la farmacocinética, toxicidad, o la biodisponibilidad de KCN1, se realizó una evaluación de estas propiedades farmacológicas. Hemos desarrollado un método de HPLC adecuado para la detección de KCN1 en diversas matrices biológicas, y demostró que KCN1 es estable en plasma de ratón (Fig. 5A1-A3), que se une ampliamente a las proteínas plasmáticas, que es probable metabolizado por la fase I enzima (s) (Fig. 5B), y que se distribuye a los diversos tejidos de ratón después de que ambos IV y I.P. la administración (Fig. 6 y la Tabla 2). Nuestros estudios iniciales de farmacología sacado a la luz varias características interesantes sobre KCN1. En primer lugar, hubo una amplia acumulación del compuesto en los pulmones de los ratones después de I.V. inyección, y en el bazo y el hígado de los ratones tras la administración i.p. inyección. Se necesitan más estudios para determinar los mecanismos para el patrón único de distribución de esta droga. Se administró por vía intraperitoneal a una dosis de hasta 60 mg /kg al día en un cremophor: formulación de etanol de hasta 12 semanas, y este régimen fue bien tolerado por los animales. No había signos evidentes de toxicidad en estos animales, y su comportamiento y apariencia eran indistinguibles de los animales de control. Nuestros análisis preliminares indican que los valores de las poblaciones de células de sangre y química de la sangre estaban dentro de límites normales (datos no mostrados). Además, el examen patológico de los órganos principales en la necropsia no mostró cambios ultra-estructurales en el cerebro, los riñones, el tracto GI o en los pulmones (datos no mostrados). El hígado es el único órgano en el que se observó un cambio relacionado con el tratamiento. La inflamación se observó en los hígados de los animales en la autopsia, edema tisular con la inmovilización de las vías biliares se indica con el examen patológico, pero sin ninguna evidencia de la muerte de los hepatocitos. La hinchazón del hígado observado se invirtió en los ratones dentro de 2-3 semanas después de la interrupción del tratamiento, y puede ha sido causado por el Cremophor:. Formulación de etanol, lo que puede interferir con el flujo sanguíneo hepático [40] - [42]

El segundo punto de interés es que no hubo diferencias en la farmacocinética de KCN1 entre CD-1 y ratones desnudos. Si bien algunas de estas diferencias puede haber sido debido a las variaciones normales entre los ratones, las diferencias en la época del año (temporada) cuando se realizan los estudios, y las diferencias debidas a la fuente de los ratones (Harlan vs. Frederick), algunas de las diferencias entre las cepas de ratones seguían siendo digno de mención. Por ejemplo, los ratones CD-1 mostró una concentración mucho más alta en los pulmones que los ratones desnudos, a pesar de recibir la misma dosis. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los ratones desnudos mostró una mayor captación del agente a los diversos tejidos examinados (hígado, riñones, bazo, corazón, músculo esquelético y cerebro). También hubo diferencias en la biodisponibilidad intraperitoneal de KCN1, con el compuesto se absorbe mucho mejor después de la inyección intraperitoneal en ratones desnudos en comparación con ratones CD-1. Este aumento de la biodisponibilidad fue probablemente responsable de la absorción de tejido superior. Si se encuentran resultados similares en estudios repetidos, será necesario para dilucidar el mecanismo (s) subyacente a estas diferencias en la absorción con el fin de determinar si tales factores pueden afectar la farmacocinética de KCN1 en otras especies, incluyendo seres humanos. Por otra parte, mientras que los ratones CD-1 se utilizan con frecuencia para evaluar la farmacocinética de nuevos compuestos, los ratones desnudos son la cepa de ratón más comúnmente utilizado para los estudios de eficacia anti-cáncer. Las diferencias en la farmacocinética entre las cepas podrían conducir a exceso o falta de estimación de la eficacia o la toxicidad de un compuesto.

También señaló que KCN1 aparentemente sufre recirculación enterohepática. No sólo era el compuesto todavía presente en muchos tejidos, pero en algunos casos fue superior a las 24 h que en 4 o 6 h (por ejemplo, hígado y bazo). Además, KCN1 todavía era detectable a un nivel bajo durante al menos cinco días después de la administración intraperitoneal (datos no mostrados). Estos hallazgos sugieren que puede ser posible para dar KCN1 relativamente con poca frecuencia, puesto que el compuesto puede permanecer en el tejido objetivo durante varios días. Sin embargo, será necesario asegurar que el compuesto no ejerce efectos tóxicos en el hígado, la vesícula biliar o de otros tejidos expuestos a alta concentración del compuesto durante períodos de tiempo prolongados.

Además de los cambios en la frecuencia de dosificación para los estudios de eficacia, el cambio de la formulación también puede mejorar la actividad del compuesto. Aunque el compuesto fue eficaz cuando se administra I.P. en Cremophor: etanol, la formulación no es la ideal. Más importante aún, mientras que la propia KCN1 no parece ejercer efectos tóxicos serios, el vehículo dio lugar a la inflamación del hígado después de varias semanas de tratamiento en los animales de control. Por lo tanto, el cambio de la formulación podría reducir la toxicidad del compuesto, y es posible que la optimización de la formulación y la administración del compuesto también mejorar sus efectos contra el cáncer

En resumen., Hemos demostrado que KCN1 puede ejercer citotoxicidad y proliferación celular potentes efectos de inhibición frente a las células de cáncer de páncreas, y dio lugar a baja regulación de importantes proteínas oncogénicas y pro-crecimiento /pro-proliferación. Hemos presentado un método válido para detectar y cuantificar KCN1 en diversas matrices. También hemos presentado los datos iniciales farmacocinéticos sobre el compuesto, indicando que se está bien distribuida, estable, y detectable en diversos tejidos de un período relativamente largo de tiempo. La información generada en este estudio será útil para el desarrollo ulterior del compuesto.

Materiales y Métodos

Productos químicos y Reactivos

KCN1 se sintetizó y se purificó como se informó anteriormente [ ,,,0],29], [43] - [44], y la estructura se confirmó por UV, IR, MS y espectroscopía de RMN. La pureza del compuesto se determinó que era mayor que 99%.

Todos los productos químicos y disolventes utilizados para el análisis de la preparación de muestras y la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) fueron de grado analítico. Metanol (grado HPLC) fue adquirido de Fisher Chemicals (Fairlawn, NJ) y trietilamina se adquirió de Sigma (St. Louis, MO).

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