Extracto
La queratina 23 (KRT23) se expresa fuertemente en los adenocarcinomas de colon, pero ausente en la mucosa del colon normal. Matriz basada perfiles de metilación de 40 muestras de colon mostró que el promotor de KRT23 fue metilado en la mucosa del colon normal, mientras que en la mayoría de los adenocarcinomas hypomethylated. metilación del promotor correlacionada con la expresión ausente, mientras que el aumento de expresión KRT23 en muestras tumorales correlaciona con el promotor de hipometilación, como se confirmó por secuenciación de bisulfito. La desmetilación expresión inducida KRT23
in vitro.
Perfiles de expresión de shRNA mediada desmontables KRT23 estable en líneas celulares de cáncer de colon mostró que KRT23 agotamiento de las moléculas de la replicación del ciclo celular y el ADN, la recombinación y reparación afectada.
in vitro
análisis confirmó que el agotamiento KRT23 disminuyó significativamente la proliferación celular de las células SW948 y LS1034 y una marcada disminución de la expresión de genes implicados en la respuesta al daño del ADN, principalmente moléculas de la vía de recombinación homóloga doble filamento romper la reparación. KRT23 caída disminuyó la expresión de la transcripción y proteínas de moléculas clave como, por ejemplo, MRE11A, E2F1, RAD51 y BRCA1. Desmontables de KRT23 rindió células de cáncer de colon más sensibles a la irradiación y la proliferación de las células KRT23 empobrecido en comparación con células de control irradiados reducidos
Visto:. Birkenkamp-Demtröder K, Hahn SA, Mansilla F, Thorsen K, Maghnouj A, Christensen R, et al. (2013) Keratin23 (KRT23) Derribo reduce la proliferación y afecta a la respuesta al daño del ADN de las células del cáncer de colon. PLoS ONE 8 (9): e73593. doi: 10.1371 /journal.pone.0073593
Editor: Kerstin Borgmann, Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Alemania |
Recibido: noviembre 20, 2012; Aceptado: July 25, 2013; Publicado: 9 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Birkenkamp-Demtröder et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por becas de la Fundación John y Birthe Meyer, la Fundación Lundbeck, la Fundación Novo Nordisk y el Consejo danés de Investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) representa aproximadamente el 10% del total de los casos de cáncer en todo el mundo con un total de cinco años de supervivencia de alrededor del 50% [1]. El diagnóstico precoz y un mejor tratamiento del CCR requiere la identificación de nuevos biomarcadores, así como conocimientos sobre los mecanismos moleculares de la carcinogénesis colorrectal.
Existen dos subgrupos moleculares principales de cáncer de colon, microsatélite inestable (MSI) y microsatélites estables (MSS ) [2], donde los tumores MSI representan aproximadamente el 15% de la incidencia total [3]. Microsatélites tumores inestables muestran mutaciones o alteraciones epigenéticas en los genes reparadores de desajustes que conducen a alteraciones en el ADN de microsatélites (secuencias cortas de ADN repetidas). La evidencia creciente sugiere que los tumores MSI se asocian con un mejor pronóstico [4] y que los pacientes con MSI no podrán beneficiarse de la quimioterapia adyuvante basada en fluorouracilo [5] [6].
Varias alteraciones epigenéticas se han descrito para el CCR [ ,,,0],7]. metilación aberrante en el colon se puede observar ya en lesiones premalignas primeros, así como en la mucosa de apariencia normal de tumor adyacente. la activación de genes epigenética basado en la desmetilación del ADN o la hipometilación de la región promotora está implicado en la iniciación y progresión del cáncer [7].
Las queratinas son el filamento intermedio de formación de proteínas de las células epiteliales. Hoy en día, se sabe que las queratinas 54 de mamíferos, 28 de tipo I (ácido) y queratinas 26 Tipo II (básico a neutro) [8]. Varios estudios han proporcionado evidencia de la participación de la queratina activo en la proliferación de células de cáncer, invasión y metástasis, así como en la capacidad de respuesta del tratamiento. Por otra parte, se ha sugerido para explorar aún más el papel de las queratinas como reguladores multifuncionales de la tumorigénesis epitelial [9].
queratina 23 (
KRT23
) pertenece al tipo I queratinas ácidas [10] . Se encontró que la transcripción KRT23 a ser altamente inducida en la línea celular de cáncer pancreático humano AsPC-1 tras el tratamiento con un inhibidor de histona desacetilasa (HDACi) [11]. Además, K23 fue identificado como un antígeno asociado a tumor en el suero de pacientes con carcinoma hepatocelular [12]. En estudios anteriores, hemos identificado la transcripción y proteínas KRT23 K23 a ser fuertemente regulados por incremento en los adenocarcinomas de colon en comparación con la mucosa normal [13] [14]. Ni la transcripción KRT23 ni la proteína K23 se ha demostrado que es un marcador de pronóstico en el cáncer de colon; Sin embargo, se observó una tendencia a que los pacientes con estadio II adenocarcinomas de colon con altos niveles de transcripción KRT23 parecía tener una menor tasa de recurrencia. La fosfoproteína K23 acumula en el aparato de Golgi de la mayoría de los tumores del SMS, mientras que la mayoría de los tumores MSI mostraron menor expresión citoplasmática o eran completamente negativas para la expresión de la proteína K23 [14]. La sobreexpresión de KRT23 redujo la viabilidad celular de líneas celulares de MSI si bien no tuvo un impacto significativo en el funcionamiento de las líneas celulares del SMS [14]. Promotor análisis de unión identificado varios genes que correlacionan con la expresión KRT23 en los adenocarcinomas. Recientemente, se identificó la proteína K23 inducible Smad4 para interactuar con queratinas K8 y K18, proteínas de choque térmico 60 y 70, plectina 1, así como 14-3-3epsilon y gamma [15], lo que sugiere un papel importante para K23 en procesos de regulación . Su papel regulador también puede ser apoyado por muy recientes descubrimientos de Starman y otros que identifican KRT23 como un biomarcador potencial para la esteatohepatitis [16]
.
El objetivo de este estudio fue identificar un mecanismo de regulación para la expresión KRT23. Por otra parte, la intención de identificar los genes diana y las vías asociadas a KRT23 desmontables, para dilucidar los efectos del agotamiento KRT23 sobre las funciones moleculares y celulares de las células cancerosas.
Materiales y Métodos
informado por escrito se obtuvo el consentimiento de todos los pacientes y todos los estudios fueron aprobados por los comités centrales Dinamarca Región de Ética de la Investigación Biomédica.
Genoma análisis de metilación
ADN genómico a partir de criosecciones en serie se extrajo utilizando el kit de purificación de ADN Puregene (Gentra Systems, Plymouth, MN). Cuando sea necesario, las biopsias de tumores fueron recortados macroscópicamente para enriquecer la fracción de células neoplásicas a un mínimo de 60% antes del aislamiento del ADN. porcentaje de células cancerosas media fue de 80%. Un microgramo de ADN fue modificada utilizando EpiTect bisulfito Kit (Qiagen, Copenhague, Dinamarca) mediante el software EZ-96 La metilación del ADN D5004 (Zymo Research, Orange, CA) para microarrays y secuenciación de bisulfito bisulfito. Bisulfito de ADN modificado fue amplificada del genoma completo y se hibrida a Infinium HumanMethylation27 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) durante la noche como se describe por el fabricante. BeadChips fueron escaneados con un instrumento BeadXpress lector (iluminación) y los datos se analizaron usando el grano de metilación Estudio Módulo de software (Illumina) como se describe en detalle en [17]. los niveles de metilación se proporcionan en valores beta, con un valor beta de 0 corresponde a no metilación, y 1 correspondiente a la plena metilación. Para la comparación de estado de metilación en comparación con los datos de expresión, las intensidades de expresión log2 se obtuvieron por expresión de microarrays de perfiles de las mismas muestras, las muestras se normalizaron por RMA y transcripción intensidades log2 & lt; 5 fueron considerados como "no expresado"
secuenciación de bisulfito.
bisulfito de ADN modificado fue amplificado utilizando cebadores diseñados con MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/index1.html). Los productos de PCR se purificaron en gel y se clonaron usando TOPO TA Cloning Kit ® para la secuenciación (Invitrogen, Taastrup, Dinamarca). la amplificación por PCR para la secuenciación se llevó a cabo directamente sobre las colonias con los cebadores M13 (tecnología ADN, Risskov, Dinamarca) y TEMPase ADN polimerasa (amplicón, Skovlunde, Dinamarca). Para cada gen, 10 clones se seleccionaron aleatoriamente y se secuenciaron utilizando BigDye Terminator ciclo de kit de secuenciación y una 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). En detalle, se analizó una secuencia que comprende 253 pb solapa con el inicio de la transcripción (+1) y el primer exón KRT23. ADN genómico se aisló a partir de dos conjuntos diferentes, 23 muestras de biopsia de tumor del paciente (4 mucosa normal, 3 adenomas, 5 MSI y 12 MSS) y las células AZA tratada células HCT116 descritos más arriba usando el Gentra PUREGENE DNA Purification Kit (Qiagen). ADN fue bisulfito convertidos usando el kit de ADN MethylEasy bisulfito de modificación (Diagenode)
El amplicón de 253 pb KRT23 se amplificó por PCR con arranque en caliente TEMPase ADN polimerasa (amplicón) utilizando una mezcla que contiene cebadores F1 (C): 5. ' - GTGGTTTTCGTTTTTAGATTGTTT-3 'y F1 (T) 5'-GTGGTTTTTGTTTTTAGATTGTTT y R1:5'- TCAAAACCAAACAACCCTAACCTA-3'. Los amplicones se purificaron en gel (Gel 11Band Purification Kit; GE Healthcare) y se subclonaron en el vector pCR4-TOPO (Invitrogen) fueron 12-16 clones de cada experimento se secuenciaron usando cebadores directos M13. Para la visualización del estado de metilación, se utilizó el siguiente software:. Http://quma.cdb.riken.jp/
líneas celulares de colon
Se obtiene de la American Type Culture Collection (ATCC-LGC normas, Borås, Suecia) u obtenida del laboratorio de Hahn se volvieron a autenticados a través de análisis de STR [18] utilizando el ID del sistema celular (G9500, Promega, Nacka, Suecia), los productos se analizaron en un analizador genético Applied-Biosystems3130. Sin contaminación por micoplasmas se detectó mediante detección de micoplasmas basado en la PCR anidada. líneas celulares de cáncer de colon en este estudio fueron HCT116 (MSI), DLD1 (MSI), SW480 (MSS, p53 mutado), SW948 (MSS, los Duques de tipo C, grado III, tumorigénico, p53 mutado), LS1034 (MSS, Dukes C , las mutaciones en p53 (G245S), APC (E1309fs * 4) y KRAS (A146T). La línea celular de riñón embrionario humano HEK293 utiliza para E2F1 sobreexpresión también fue re-verifica a través de análisis de STR.
Las células fueron cosechadas por raspando los frascos con tampón de lisis 1 ml y el ARN total fue extraído utilizando el kit GenElute mamíferos Miniprep total de ARN (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, nº de cat RTN350) según las instrucciones del fabricante y la integridad del ARN se evaluó mediante una . Bioanalyzer (RIN & gt; = 9,9) ARN se analizó en U133plus2.0 o matrices ExonST1.0 (Affymetrix), análisis de comparación se realizó utilizando el software MAS5.0 Sondas acompañados de una llamada /Disminuir y una relación log 2 | & gt;. 0,5 |. se incluyeron, pero excluidos cuando aparece como '' ausente '' los genes fueron anotados utilizando la anotación de Affymetrix NetAffx (NCBI build 36.1, NetAffx-build = 28). exón serie de datos se normalizaron cuantil-utilizando el algoritmo Exon16 con transcripciones de núcleo (17881 transcripciones) y sondas fondo antigenomic o la consola de expresión IterPLIER. Todos los análisis de los datos se realizó utilizando el software GeneSpring GX 10 (Agilent).
Las muestras de tejido de colon
El ARN total se purificó a partir de criosecciones en serie con contenido tumoral más del 75% usando columnas RNeasy MinElute siguiente al del fabricante instrucciones (Qiagen). Buena calidad del ARN (RIN & gt; 7) se verificó mediante análisis en el 2100 Bioanalyzer (Agilent). Se realizó un análisis en U133A GeneChips y U133plus2.0 y normalización de los datos como se ha descrito previamente (10). Expresión valores se dan en "log2". Para el exón 1,0 ST matriz de análisis de las muestras se marcaron de acuerdo con el GeneChip Whole Transcripción (WT) Sense Target Labeling Ensayo humano y se hibridaron con el exón 1,0 ST arrays (Affymetrix) como se describe previamente (11). exón serie de datos se normalizaron cuantil-utilizando el algoritmo ExonRMA16 con transcripciones de núcleo (17881 transcripciones) y sondas fondo antigenomic. Todos los análisis de los datos se realizó utilizando el software GeneSpring GX 10 (Agilent).
Síntesis de cDNA
transcripción in vitro y el etiquetado de cRNA, hibridación a Affymetrix GeneChips U133plus2.0 y escaneo de éstas se realizó a través procedimientos estándar, véase la referencia (12). La comparación de los análisis de datos de la línea celular se realizaron utilizando el software de Affymetrix MAS5.0. Filtros aplicados: Las sondas se incluyeron si la comparación aparece una llamada /Disminuir acompañada de una relación de log 2 & gt; 0,5 o & lt; -0.5 (umbral de registro & gt; 0,5 o log2 & lt; -0.5 se definió arbitrariamente). Las sondas fueron excluidos del análisis si se les aparece como '' ausente '' y /o tenían valores de expresión & lt; log2 4 en ambas muestras comparadas. Los genes fueron anotados utilizando la anotación de Affymetrix NetAffx (NCBI Build 36.1, NetAffx-build = 28).
Tratamiento 5-Aza-2'- desoxicitidina de células de cáncer de colon HCT116
negativo
KRT23 o DLD1 células de cáncer de colon se trataron con 2,5, 5 o 7,5 M 5'-aza-dC en DMSO o CH3COOH (Sigma-Aldrich, Copenhague, Dinamarca) cada 24 horas durante 2 días, seguido de un día de la reconstitución como se describe en la literatura.
Reverse Transcription PCR cuantitativa (RTqPCR)
ARN fue extraído de las células de cáncer de colon HCT116 tratados con diferentes concentraciones de AZA utilizando columnas RNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). ADNc a partir de estas muestras se sintetizó como se describe (13), usando el cebador oligo-dT en vez de cebadores aleatorios. análisis RTqPCR se realizó por triplicado en una Fast System ABI 7500 de tiempo real (Applied Biosystems) usando el ensayo de sonda TaqMan® Ker23 ID Hs0021096_m1 como se recomienda por el fabricante. Los datos se normalizaron en contra de ubiquitina C (UBC), como se describe anteriormente [19].
Preparación shRNA-vector, Lentivirus Producción e infección de Lentiviral
Preparación de shRNA-vector, se llevó a cabo la producción y la infección por lentivirus lentiviral como se ha descrito previamente (9). Para cada una de las tres líneas celulares SW480, SW948 y LS1034, una línea celular de control estable que contiene un vector lentiviral vacío y cinco caídas estables específicos KRT23 diferentes fueron establecidos; los dos más eficiente sh-1010 y SH-1506 se utilizaron para estudios adicionales. En resumen, las construcciones de vector de ARNhc fueron producidos con puro pLKO.1 (amablemente proporcionados por Sheila Stewart, Universidad de Washington, EE.UU.) que contiene una secuencia de relleno 1,8 kb en el lugar de la casete de shRNA. El plásmido pLKO.1 fue doblemente digerido por EcoRI y AgeI durante 1 hora para liberar el fragmento de relleno 1,8 kb. Los fragmentos de ADN fueron separados usando un gel de agarosa al 1%. El 7,1 kb banda EcoRI /AgeI se extrajo y el ADN se extrajo utilizando Qiaquick kit de extracción de gel (Qiagen, Hilden, Alemania). Los pares de oligonucleótidos sentido y antisentido de la horquilla se obtuvieron de MWG Eurofins Operon (Ebersberg, Alemania). Para formar el shRNA cassette de 5,4 g de cada oligonucleótido fue recocida en un volumen de 100 l. El tampón de reasociación era 1x tampón de ligasa T4-DNA (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). La mezcla de hibridación se incubó en un ciclador térmico (DNA Engine Opticon®2 ciclador MJ Research, Waltham, MA, EE.UU.), enfriar gradualmente desde 99 ° C a 16 ° C durante 70 min. La ligación se llevó a cabo en 20 l de volumen de reacción utilizando 1 unidad de ADN ligasa de T4 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y 100 ng de ADN del vector en una relación de vector-inserto 1:04 molar y se incubó a 16 ° C durante la noche. Se utilizaron 2 l de mezcla de ligación para transformar 40 l de células TOP10 competentes (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) utilizando el procedimiento de electroporación estándar. Las células transformadas se recuperaron en 0,8 ml de LB durante 1 hora a 37 ° C y se sembraron en ampicilina (100 mg /ml) que contiene placas de agar. preparaciones de ADN de plásmido fueron hechos de más de la noche cultivos de colonias individuales usando el sistema de Pure Yield® plásmido Midiprep (Promega, Mannheim, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La secuencia correcta se verificó mediante secuenciación de ciclos estándar para cada casete shRNA. Los lentivirus se hicieron mediante la transfección de células de empaquetamiento (HEK293T) con un sistema de 3-plásmido. ADN para transfecciones se preparó mezclando 12 g pCMVΔRR8.2, 1 g phit G y 12 g pLKO.1 plásmido de ADN con 62 l de 2 M CaCl
2 en un volumen final de 500 l. Posteriormente 500 l de tampón de fosfato de 2 × HBS fue gota a gota a la mezcla y se incubaron durante 10 min a TA. La mezcla de 1 ml de la transfección se añadió a las células confluentes HEK293T 50% sembradas el día antes en una placa de 10 cm. Las células se incubaron durante 16 h (37 ° C y 10% de CO
2), y se cambió el medio para eliminar el reactivo de transfección restante. sobrenadantes lentivirales se recogieron a 36 h después de la transfección y para cada sobrenadante ml infección 3 que contiene 4 mg /ml de polibreno se utilizó inmediatamente para infectar células diana sembradas el día antes en placas de 6 cm así para alcanzar 70% de confluencia en el día de la infección. Las células se incubaron durante 24 h, y se cambió el medio para eliminar las partículas de virus. Para controlar la tasa de infección por una infección paralela en las condiciones idénticas dirigidas a la misma línea celular se preparó utilizando un vector lentiviral control de la expresión de GFP (pRRLU6-CPPT-PSK-GFP, proporcionado amablemente por S. Stewart). 6 días después de la infección 2 mg /ml de puromicina se añadieron al medio de cultivo celular. RT-PCR cuantitativa se utilizó para validar knockdown eficiente y los datos se normalizaron en contra GAPDH, HPRT1 o PPIA. El ARN total de líneas celulares transfectadas de forma estable se aisló mediante extracción con fenol ácido. cDNA se sintetizó usando 2 g de RNA total, oligo (dT)
18 cebadores y superíndice ™ II RNasa H
- transcriptasa inversa (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante y se diluyeron hasta un volumen final de 50 l con 1x tampón de primera cadena. Intrón conjuntos de cebadores que abarca de QRT-PCR fueron diseñados utilizando el software Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). QRT-PCR se realizó usando una mezcla de reacción SYBR Green I que contiene 75 mM Tris-HCl (pH 8,8), sulfato de amonio 20 mM, 0,01% (v /v) de Tween 20, cloruro de magnesio 2 mM (todos de Sigma-Aldrich, Munich, Alemania), 1 l de una dilución de 600 veces de SYBR Green I (BioWhittaker, Rockland, mE, EE.UU.), 2,5 U de Taq polimerasa (NEB, Frankfurt aM, Alemania), dNTP 0,2 mM (Promega, Mannheim, Alemania) y 0,2 M de cebador directo e inverso (Qiagen, Hilden, Alemania) en un volumen final de reacción de 20 l. Las reacciones se realizaron en un termociclador DNA Engine Opticon®2 (MJ Research, Waltham, MA, EE.UU.). Las condiciones de los ciclos consistían en 3 min de desnaturalización a 94 ° C y 40 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg y 80 ° C durante 3 seg. Se midió la fluorescencia en el último paso de cada ciclo. Las curvas de fusión se obtuvieron después de cada ejecución PCR y mostraron productos de PCR individuales. Los ADNc se realizaron por triplicado, no RT (sin transcriptasa inversa) y sin plantilla controles se realizaron por duplicado. eficiencia de la PCR se determinaron mediante diluciones seriadas de un ADNc derivado de la línea celular SW480 Los niveles de expresión de genes de interés y de servicio de limpieza genes se midieron en el corre PCR independiente. ratios de expresión se calcularon como se describe por M. Pfaffl [20] utilizando el geométrica significa la expresión de los genes de limpieza GAPD, HPRT1 y PPIA para normalizar los datos de expresión para el gen de interés.
Western Blotting
Western Blot se realizó como se describió anteriormente [21]. El anticuerpo anti-K23 policlonal de conejo, se describe en detalle en [14], se utilizó en una dilución 1:500 y 1:1000. Un anticuerpo monoespecífico se generó mediante purificación por afinidad contra los péptidos CKWHQQRDPGSKKDYS, la posición 106 a 120 en la secuencia de proteínas NP_056330.3 (Eurogentec, Bélgica). El anticuerpo monoespecífico, anti-K23 se utilizó en una dilución 1:150 para el Western Blot. BioRad de "All Blue" se utilizó como marcador de peso molecular, el anticuerpo monoclonal beta-actina (# A-1978, el clon AC-15, Sigma-Aldrich Denmark A /S) diluido a 0.05μg /ml se utilizó como control de carga. Ratón anticuerpo MRE11A anti-humano monoclonal (ab214, Abcam, UK, lote 912394) se utilizó en 1:500-1:1000 diluciones, monoclonal de ratón anti-humano RAD51 (H-92) (sc-8349, Santa Cruz, EE.UU., muchos E0610) en una dilución 1:100, BRCA1 monoclonal de ratón anti-humano (MS110) (ab16780, Abcam, Reino Unido, lote GR3646-1) en una dilución 1:200. El anticuerpo monoclonal de ratón anti-E2F1 fue una especie de regalo del Prof. Kristian Helin, BRIC, Copenhague, Dinamarca, y se utilizó en una dilución de 1:05. Extractos de HEK293 células que sobreexpresan recombinante E2F1 marcada con HA del vector de expresión pCMVHA-E2F1 se utilizaron como control [22].
microscopía de inmunofluorescencia
Las células se sembraron en 16 portaobjetos de cámara así ( . Nunc, vidrio cat No. 178599; no de fluorescencia endógena), se fijaron en metanol frío (-20 C) y se tiñeron con los siguientes anticuerpos: anticuerpo policlonal de conejo contra K23 (1:500) (11), monoclonal de ratón anti-KI67 (1:100, DAKO Cytomation), anti-E2F1 sin diluir, anti-MRE11A 1:1000, anti-RAD51 1:50 y anti-BRCA1 1: 200. Los anticuerpos secundarios utilizados eran AlexaFlour 488 IgG de cabra anti-conejo altamente cruz adsorbido (1:2,000;. Mol Probes Inc., Eugene, OR) o AlexaFlour 488 de cabra anti-IgG de ratón altamente cruz adsorbido (1:2,000; Mol. Probes Inc., Eugene, OR). Hoechst 33342 se utilizó para las manchas nucleares y las diapositivas fueron montadas con fluorescencia medio de montaje (Dako) y un cubreobjetos (Nunc, Cat No. 171080). Las imágenes fueron adquiridas con un Axiovert 200 M (Zeiss MicroImaging, Inc.).
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Los datos de microarrays de expresión se normalizaron con RMA (robusto multichip media) se sometieron a IPA, versión 8.8. Los datos inferiores al umbral fijado arbitrariamente de log2 lt; 4.0 y fueron excluidos del análisis, las intensidades de log2 log2 & lt; 5 eran considerados como la expresión ausente. los valores de expresión se normalizaron en torno a cero. coeficientes normalizados dados como (-INF, -1] y [1, + INF) fueron sometidos a IPA.
Estudios proliferación
La viabilidad y la proliferación de líneas celulares de colon transfectadas de forma estable con sh-ARN contra KRT23 se evaluó mediante un ensayo de MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] bromuro de 2,5-difeniltetrazolio) como una función del metabolismo celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche, Alemania). La absorbancia a 550 nm /690 nm se midió a diferentes puntos de tiempo. La proliferación de células de cáncer de colon se evaluó por el ensayo de CyQUANT® NF de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). intensidades de fluorescencia se midieron con un lector de microplacas ™ HT Sinergia (Biotek, Alemania) usando excitación a 485/20 nm y la detección de fluorescencia a 528/20 nm. citotoxicidad celular se evaluó mediante un ensayo de LDH-(lactato deshidrogenasa) según las instrucciones del fabricante (kit de detección de citotoxicidad, Cat. No. 11644 793 001, Roche Diagnostics, Hvidovre, Dinamarca). monitoreo etiqueta libre de la proliferación y viabilidad a lo largo de un intervalo de varios días se realizó en 96 pocillos E-placas en un RTCA (monitorización en tiempo real de las células) SP solo instrumento Placa o 16 pocillos E-placas o placas de CIM (invasión celular y la migración) en un instrumento Plate DP Dual (Roche). La adhesión se vigila por medio de E-placas en intervalos de 1-5 minutos durante las primeras 1-6 horas después de la siembra. La proliferación se vigila por medio de E-placas en intervalos de 15 minutos dentro de los períodos de 1-120 horas, sembrando 4000-16000 células por pocillo, respectivamente. Los análisis se realizaron por triplicado y los resultados se validaron mediante ensayos convencionales. La migración celular en CIM-placas se monitorizó en los duplicados en intervalos de 1 minuto dentro de períodos de 2-48 h horas, la siembra de 40.000-60.000 células por pocillo. Usando el software intrínseca RTCA, el tiempo de duplicación (DT) se calculó de acuerdo con DT = log2 /pendiente publicada por Zhang et al [23], http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/RTCA. html. El DT calculado es el Índice de Células Tiempo de duplicación, que no es igual al tiempo cuando el número de células se duplica, porque los valores de índice de células son una combinación de la medida de la viabilidad celular, número de células, la morfología celular y el grado de la adhesión celular.
la irradiación de las células del cáncer de colon
Para determinar si la irradiación puede tener un impacto en las células SW948 o LS1034 con una caída KRT23 hemos realizado una optimización de la dosis de irradiación con 0-10 Gy de rayos gamma usando un
137Cs radiador Gammacelle 2000RH (AEK Risø, Dinamarca) como se describe anteriormente [24].
análisis estadístico
el análisis estadístico se realizó utilizando STATA 10 (Statacorp, Texas, EE.UU.). Transcripción valores se expresaron como medias ± log2 desviación estándar (DE). la prueba t de Student de dos colas se aplicó y los valores de p p. & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativa
Resultados
KRT23 la metilación del promotor
El estado de metilación del promotor KRT23 se evaluó en 40 muestras de tejido de colon (seis mucosa normal, seis adenoma, cinco MSI y 23 tejidos de adenocarcinoma SMS) utilizando conjuntos de Illumina Bead interrogar CG-sitios en la posición cg06378617 y cg22392708 situado en el promotor KRT23 (Figura a en la Figura S1 en presentar S1). Una disminución muy significativa en los niveles de metilación de los adenocarcinomas del SMS se pudo observar tanto CG-sitios interrogados en comparación con seis muestras de mucosa normal (Mann-Whitney U-test, p-valor de 1.9E-04 para cg06378617 y 5.3E-04 para cg22392708). MSI adenocarcinomas, así como los adenomas mostraron significativa metilación reducida para el sitio CG cg06378617 solamente (Mann-Whitney U-test, p-valor de 1.7E-02 y 2,2E-03, respectivamente). Parallel perfiles de expresión transcripción de las mismas muestras usando arrays exón 1,0 ST mostró que la transcripción KRT23 estaba ausente en la mucosa normal, lo que confirma los resultados previos (8). Sin embargo, se identificaron los niveles de transcripción no ambiguas en 4/6 adenomas y en la mayoría de los adenocarcinomas. Se identificó una correlación negativa entre la metilación del promotor y la expresión del transcrito KRT23 en las posiciones tanto interrogado sitios CG, posición cg06378617 y cg22392708 con rango de Spearman coeficiente de correlación de -0.64 y -0.74, respectivamente (Figura 1). Illumina serie de datos fueron validados mediante el uso de muestras de secuenciación de bisulfito con diferentes niveles de expresión KRT23 que van de menor a mayor de una muestra independiente establecido anteriormente no se analizan en matrices de Illumina, y donde las muestras de ADN y los datos de microarrays de expresión estaban disponibles. Como no fue posible obtener cebadores específicos para la cg06378617 Illumina CpG in situ, se analizó la metilación del promotor en cg22392708 (posición 116 en la Figura 2A) y en cinco CpG sitios adyacentes adicionales (posiciones 152, 167, 174, 189 y 228) . secuenciación de bisulfito de al menos 10 clones por muestra se realizó en ADN extraído de muestras 23 de tejido que comprende mucosa normal (n = 3), una piscina normal (n = 10), adenomas (n = 3) y adenocarcinomas (MSI n = 5 y MSS n = 11) (Figura 2A). A continuación, el estado de metilación se comparó con los datos de microarrays de perfiles de transcripción. En todas las posiciones, excepto en la posición 116, alto nivel de metilación fue acompañada por la expresión bajo KRT23 en el 87% de los casos. El promotor KRT23 de la mucosa normal mostró & gt; 50-75% de metilación acompañada por la expresión KRT23 ausente (los niveles de transcripción de log2 & lt; 5). En contraste, la mayoría de los tumores MSS mostró menos de 25% de metilación acompañado de alta KRT23 niveles de expresión de log2 & gt; 9 en 7/11 tumores MSS analizados (Figura 2A)
Comparación de KRT23 transcripción de datos de exón. 1,0 ST arrays (- • -) a los datos de metilación de 2 sondas, cg22392708 y cg06378617 de las matrices de Illumina Bead (Box) mostraron una correlación negativa entre la metilación y la transcripción de las 40 muestras de tejidos analizados (coeficiente de correlación de Spearman de -0.64 y - 0,74, respectivamente).
Posición 116 corresponde a Cg22392708. • metilado, ○ no metilado; MSI y SMS adenocarcinomas de colon. A) El estado de metilación de las biopsias de colon se comparó con transcribir los datos de expresión del exón 1,0 ST arrays. Para la mayoría de las muestras, los valores alto de metilación están de acuerdo con bajos valores de expresión y viceversa. intensidades log2 se muestran en el panel de la derecha, los valores por debajo log2 = 5 eran considerados como la expresión ausente. B) El tratamiento de células HCT116 (MSI) que no expresan KRT23 con 5'-aza-DC demostró que la disminución de la metilación resultó en un aumento de la expresión del transcrito KRT23.
Expresión KRT23 es inducida por desmetilación
dos líneas celulares de colon MSI, HCT116 y DLD1 sin expresión KRT23, se trataron con concentraciones crecientes de 5-aza-2 'desoxicitidina (5'-aza-dC) y DMSO o CH3COOH como se monitorizó controles y la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT (no se muestra). RTqPCR análisis, ya sea usando una sonda SYBR verde o una sonda Taqman contra KRT23 mostró que 2.5μM 5'-aza-DC era suficiente para inducir una fuerte regulación por incremento de KRT23 que resulta en un 18 veces (células HCT116) o 120 veces (DLD1 células) aumento, respectivamente, en comparación con burlarse de las células tratadas (Figura B en la Figura S1 S1 en el archivo). Todo el genoma de perfiles de expresión usando Exon 1.0 arrays ST confirmó la fuerte regulación positiva de KRT23 en HCT116 y células DLD1 tras el tratamiento 5'AZA-dC y mostró la re-expresión de varios genes como por ejemplo MAEL y UCHL1 (datos no presentados), los genes se informó anteriormente para ser inducible con un agente de desmetilación [25]. secuenciación de bisulfito en seis posiciones en el promotor KRT23 de la 5'-aza-DC tratada células HCT116 confirmaron un 80% de metilación -100% en el CH3COOH controles tratados, mientras que la metilación se redujo a 25% -50% de metilación por tratamiento con 2.5- 5.0 M 5'-aza-dC (Figura 2B). En conclusión, la expresión del transcrito KRT23 es 5'-aza-DC inducible sugiere una posible regulación epigenética de KRT23.
Lentiviral mediada por derribo estable de KRT23 en líneas celulares de cáncer de colon
A medida que los adenocarcinomas en fase inicial ya expresar niveles moderados a altos de KRT23
in vivo
[14], hemos querido saber si el agotamiento de KRT23 puede afectar las funciones moleculares y celulares de las células de cáncer de colon. En una primera aproximación, lentiviral mediada desmontables de KRT23 se aplicó a la línea celular de cáncer de colon humano SW480. Se analizaron cinco secuencias diferentes shRNA dirigidos KRT23, donde las construcciones más eficientes fueron sh-sh 1010 y-1506 (Figura A en la Figura S1 S2 en archivos). Transcripción de perfiles utilizando matrices 2.0plus U133 se realizó en extractos de células SW480 transfectadas de forma estable con sh-1506 o SH-1010, y se compara con las células de control transfectadas de manera estable con un vector vacío. Construir sh-1010 resultó en 3968 genes expresados diferencialmente (log2 & gt; | 0,5 |) en el agotamiento del KRT23, mientras constructo SH-1506 con una eficacia de caída de aproximadamente el 90% resultó en 7156 genes alterados, presente 3145 (log2 & gt; | 0,5 |) objetivo genes en común para ambas construcciones desmontables, aumento o disminución en ambos análisis en la misma dirección. Construir SH-1506 se utilizó además para estudiar el efecto de la caída en KRT23 tres líneas celulares de cáncer de colon diferentes.
perfiles de expresión de KRT23 Empobrecido Líneas Celulares
En un enfoque ampliado que utiliza tres diferentes MSS