Tallo
Extracto
Objetivo
ricos en leucina-repetir que contienen los receptores acoplados a la proteína G 5 (LGR5 ) es un marcador candidato para las células madre de cáncer colorrectal (CSC). En el presente estudio, se investigó el estado de metilación dentro thelgr5 promotor y evaluamos su relación con la diferenciación CSC, el pronóstico para el cáncer colorrectal, y sus características clínico-patológicas.
Métodos
El estado de metilación del promotor dentro LGR5 se detectó con una PCR específica de metilación en seis líneas celulares de cáncer colorrectal, así como 169 tejidos tumorales colorrectales primarios. La diferenciación de CSC se examinó con inmunofluorescencia e inmunocitoquímica. Baja regulación de LGR5 se logró con siRNA-gen específico. Las asociaciones entre la metilación LGR5 y las características clínico-patológicas, así como la supervivencia de los pacientes se analizaron con métodos estadísticos.
Resultados
El promotor LGR5 fue metilado en diferentes grados para las seis líneas de células colorrectales examinados, con la metilación completa observada en las células HCT116 en el que la expresión LGR5 se recuperó parcialmente después del tratamiento DAC. La formación de esferas de células madre a partir de células HCT116 fue acompañado por el aumento de la metilación en el promotor LGR5 y la disminución de expresión de LGR5. El derribo de LGR5 de siRNA también dio lugar a la formación de las células madre esferas. Dentro de los tumores colorrectales primarios, el 40% (67/169) fueron positivos para la metilación LGR5, mientras que ninguno de los tejidos de colon normales fueron positivos para la metilación LGR5. Además, la metilación LGR5 asoció significativamente con mayor grado del tumor, y la metástasis distante negativo (p & lt; 0,05), así como un mejor pronóstico (p = 0,001) en pacientes con cáncer colorrectal
Conclusiones
Nuestros datos sugieren que la metilación LGR5, a través de la regulación de la expresión LGR5 y colorrectal diferenciación de las CMC, puede constituir un marcador pronóstico novedoso para pacientes con cáncer colorrectal
Visto:. Su S, Hong M, Liang y, Zhou J, Liang Y, Chen K, et al. (2015) LGR5 metilación en cáncer de diferenciación de células madre y pronóstico de predicción en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (11): e0143513. doi: 10.1371 /journal.pone.0143513
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: 20 Marzo, 2015; Aceptado: 5 Noviembre 2015; Publicado: 24 Noviembre, el año 2015
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la licencia Creative Commons CC0 dominio público dedicación
Disponibilidad de datos: Los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este proyecto fue apoyado en parte por el National Fundación de Ciencias naturales de China (SNCF. NO. 81302156), Guangzhou Proyecto piloto de clínica y Centro de Investigación traslacional (principios de los cánceres gastrointestinales, No.7415696196402), Guangdong Provincial Bio-ingeniería Centro de Investigación de Enfermedades Gastroenterología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
evidencia acumulativa apoya la hipótesis de que un pequeño número de células madre indiferenciadas o células madre similares a, las llamadas células madre del cáncer (CSC), son los responsables de la iniciación del tumor, el desarrollo, el mantenimiento, la difusión, la regeneración y la resistencia terapéutica . Más tarde, la presencia de CSC se confirmó en una variedad de cánceres sólidos, como el cáncer de mama [1, 2], glioblastomas [3], carcinomas hepatocelulares [4], y así sucesivamente, que se consiguen con la ayuda de, y a su vez, promovió la identificación de muchos antígenos de superficie celular específicos de tumores, también conocido como marcadores CSC. Para el cáncer colorrectal, varios marcadores de CSC han sido identificados, incluyendo CD133 [5, 6], EpCAM /CD44 /CD166 [7], CD24 /CD29 [8] y LGR5 [9, 10]. Sin embargo, poco se sabe de la importancia biológica de estos marcadores, lo que puede tener importantes implicaciones en la capacidad de diferenciarse en diferentes líneas de CSC [8].
Entre los marcadores CSC colorrectales, LGR5, también conocido como GPR49, es una huérfano G-proteína del receptor acoplado (GPCR) que pertenece a la repetir que contienen GPCR rica en leucina [11]. Recientemente, se informó de que LGR5 es positiva en las células madre del intestino delgado, colon y el pelo del folículo [9, 12, 13], lo que sugiere la importancia potencial de LGR5 en la biología de células madre. Consistentemente, las células madre que expresan LGR5 eran capaces de construir estructuras de organoides in vitro, que fue demostrado experimentalmente en el intestino [14-16], estómago [17] y el hígado [18]. Por otra parte, los ratones receptores con dos puntos superficialmente dañadas fueron trasplantados con organoides derivadas de una sola célula madre LGR5
+ de colon después de una amplia expansión in vitro, en consecuencia formado criptas auto-renovación que eran funcionalmente e histológicamente normal [15]. Por el contrario, los ratones LGR5 nulo exhibió letalidad neonatal debido a anquiloglosia y distensión gastrointestinal [19]. La sobre regulación de LGR5 se ha reportado en muchos tumores sólidos humanos, tales como carcinomas hepatocelulares [20, 21], de colon [22], tumores de ovario [22], carcinoma de células basales [23] y el cáncer gástrico [24]. Funcionalmente, la expresión LGR5 mejorada promueve la proliferación de células cancerosas y la tumorigenicidad [23], mientras que el silenciamiento de LGR5 reduce la proliferación, la migración y la formación de colonias, la tumorigenicidad [25] y la apoptosis inducida por celular [22]. LGR5 es un objetivo corriente abajo de la vía de señalización Wnt-β-catenina [26]. En los animales intactos, LGR5 era una parte de un circuito de retroalimentación negativa ajuste fino de la señalización de Wnt durante la morfogénesis del intestino. deficiencia de LGR5 indujo la diferenciación prematuro de las células de Paneth, que es concomitante con la sobre regulación de la actividad de Wnt, lo que implica LGR5 es un regulador negativo de la señalización de Wnt en las células progenitoras del intestino en desarrollo [27]. Además, homólogos LGR5 son componentes facultativos de los receptores de Wnt que median la mejora de la señal Wnt por proteínas solubles R-espondina [28].
El aumento de la evidencia apunta a la importancia de LGR5, a diferentes niveles expresivos, en diversos paradigmas de enfermedades y etapas de desarrollo. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de la regulación expressional en LGR5 siguen siendo difícil de alcanzar.
metilación del ADN se ha demostrado como un mecanismo epigenético importante para la inactivación de genes durante la génesis tumoral [29, 30]. Recientemente, hay cada vez más investigaciones que revelan que la metilación de algunos genes regulan el desarrollo, la progresión, y la recurrencia de tumores [31-33], de los cuales incluyen el cáncer de colon [34]. En el presente estudio, se analizó el estado de metilación de islas CpG dentro de la región promotora inmediata de gen LGR5 en líneas celulares de cáncer colorrectal y los tejidos tumorales, y analizamos su asociación con la diferenciación CSC, características clinicopatológicas, así como el pronóstico de pacientes con cáncer colorrectal cánceres.
Materiales y Métodos
cultivo celular y tratamiento
líneas celulares de cáncer colorrectal (HCT116, SW480, HT29, LoVo, Colo205, SW620, SW1116) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (Sijiqing, Beijing, china). Para el tratamiento de desmetilación, las células cultivadas se incubaron con 3 M 5-aza-2 'desoxicitidina (DAC, Sigma, St. Louis, MO) durante 72 h con medio cambiado cada día. tratamientos farmacológicos simulacros se realizaron en paralelo con PBS (pH 7,4).
muestras de tejidos humanos y la información del paciente
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica del Sur (Guangzhou, China) y consentimiento por escrito se obtuvo de todos los participantes. 169 pacientes (edad media 57 ± 22,3 años) fueron diagnosticados de cáncer colorrectal esporádico en el Departamento de Patología (Hospital Nanfang, Universidad Médica del Sur) entre 1999 y 2001. Todos los diagnósticos se establecieron sobre la base de exámenes histológicos de secciones teñidas con HE estándar de acuerdo con las directrices de la OMS. Los tumores se realizaron en base al sistema de clasificación de Dukes. Estos pacientes no recibieron quimioterapia neoadyuvante radio ni tenían ningún complicattions con otros tumores malignos conocidos en el momento del diagnóstico. Los pacientes murieron dentro de los seis meses después de la resección quirúrgica fueron excluidos.
Western Blot análisis
25 mg de la proteína total se incubó con tampón (0,3 M Tris pH 6,8, 10% de 2-mercaptoetanol desnaturalización, 40% de glicerol, 20% SDS, 0,02% de azul de bromofenol) durante 5 min a 95 ° C, se cargó en un gel 10% SDS-poliacrilamida para electroforesis, se transfirieron a membranas de PVDF, se bloquearon en 5% de leche sin grasa /TBS-Tween para 1 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 ° C en un anticuerpo primario contra LGR5 (1: 500, Abcam, Cambridge, MA) o un anticuerpo de ratón alfa-tubulina (control interno, 1: 1000, la señalización celular, Danvers, MAMÁ). Las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante durante 1 h a temperatura ambiente. La inmunorreactividad se detectó la quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL).
RT-PCR
El ARN total se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 2 g RNA total se sometió a la la síntesis de ADNc de primera cadena (Fermentas, Ontario, Canadá) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de cebador para RT-PCR se enumeran en la Tabla 1, con GAPDH utilizado como control interno.
extracción de ADN, PCR específica de metilación (MSP) y secuenciación de bisulfito PCR (BSP)
ADN genómico fue extraído de las líneas celulares o tumores primarios siguientes un método de extracción con fenol-cloroformo estándar (Qiagen, Valencia, CA). modificación con bisulfito del ADN genómico se llevó a cabo utilizando el kit de la metilación del ADN EZ (Zymo Research, Orange, CA). El patrón de metilación en las islas CpG en el promotor LGR5 se determinó mediante MSP utilizando ADN tratado con bisulfito como molde y los cebadores MSP enumerados en la Tabla 1. Los cebadores MSP fueron diseñados siguiendo el principio como se describe anteriormente [35] y la prueba de no amplificar la no ADN bisulfited. MSP se realizó a 95 ° C durante 10 min, seguido de 38 ciclos a 94 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s, a continuación, por una extensión de 5 min a 72 ° C. Los productos MSP A continuación se separaron en geles de agarosa al 1,5% teñidos con bromuro de ethiium y visualizados bajo espectrofotómetro UV. controles con agua fueron utilizados como control negativo.
Para la secuenciación de bisulfito, se utilizaron cebadores BSP (Tabla 1) para amplificar un fragmento de 428 pb que abarca el promotor-exón 1 (-362 a +96) de la región LGR5 gene. Los cebadores se diseñaron BSP no cubrir sitios CpG. Los productos de PCR fueron subclonados en pCR2.1-TOPO plásmidos (Invitrogen) y se seleccionaron los ADN de plásmido a partir de cinco clones bacterianos para la secuenciación de ADN de acuerdo con anterior se describe [36].
formación de esferas y la diferenciación celular del tallo
Para examinar formación de esferas de células madre, 5 × 10
5 células HCT116 se cultivaron en placa de cultivo de 60 mm en suspensión en DMEM libre de suero /F12 (Gibco, Carlsbad, CA), complementado con B27 ( 1:50, Invitrogen), 40 ng /ml EGF (Sigma) y 20 ng /ml de FGF-2 (Chemicon, Billerica, MA), 100 U /ml de penicilina G, 100 ug /ml de estreptomicina (Gibco, Australia). CSC esferas comenzaron a formarse aproximadamente dos semanas más tarde. Para inducir la diferenciación de CSC, las esferas CSC se lavaron con PBS tres veces y después se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U /ml de penicilina G, 100 ug /ml de estreptomicina. ácido Nuclear y proteínas se extrajeron a partir de estas células en el día 0, 1, 3 y 7, respectivamente como se describe [37 a 39]. Todas las células se cultivaron a 37 0C en un ambiente de humedad que contiene 5% de CO2.
inmunofluorescencia (IF) e inmunohistoquímica (IHC)
En las pruebas IF, esferas CSC se fijaron con formaldehído al 4% en PBS durante 10 min a temperatura ambiente y luego se permeabilizaron con PBS que contenía 0,1% de Triton X-100. Después de bloquear con 1% de albúmina de suero bovino durante 20 min a temperatura ambiente, las esferas CSC se incubaron con CK20 anticuerpo monoclonal de ratón primario (1: 300, Santa Cruz, CA) a 4 ° C durante la noche y luego con FITC-conjugado anti-conejo IgG (Santa Cruz)
.
Para IHC descrito como nuestros métodos anteriores [40], las secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina se dewaxed en xileno y rehidratada con agua destilada., y se realizó la recuperación de antígenos mediada por el calor con tampón de citrato pH 6.0 y el bloque con 3% de BSA. Los portaobjetos se incubaron a continuación con el anticuerpo LGR5 (1: 300,#137484, Abcam) a 4 ° C durante la noche, con la señal amplificada y desarrollado utilizando el sistema ABC y el sustrato cromógeno DAB (Maixin Bio, China), respectivamente, seguido de contratinción de hematoxilina. La expresión se considera que es "positivo" cuando el 10% o más células cancerosas estaban manchadas.
La transfección de pequeños ARN de interferencia (siRNA)
La secuencia de acceso para los nucleótidos siRNA-LGR5 específica fue de 5 ' -GATCTGTCTTACAACCTAT-3 'y el siRNA revueltos secuencia 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3' se utilizó como control. Ambos dúplex de siRNA fueron sintetizados por GenePharma (Shanghai, China). La transfección se realizó utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
El análisis estadístico
Para evaluar la correlación independiente de la metilación LGR5 con otras variables, se realizó un análisis de regresión logística multivariante. Para el análisis de supervivencia, se utilizó el método de Kaplan-Meier para evaluar el tiempo de supervivencia distribución relativa a la metilación LGR5.
p valor Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
LGR5 fue metilado diferencialmente en líneas celulares de cáncer colorrectal
Para probar el potencial de la metilación del ADN en la regulación de la expresión de LGR5, hemos examinado primero la expresión de LGR5 en siete líneas celulares de cáncer colorrectal y su alteración en respuesta a 5-aza-2 'desoxicitidina (DAC), el inhibidor de la metilación clásica. Como se muestra en la figura 1A y 1B, para HCT116, células SW480 y SW620, la expresión LGR5 de ARNm tanto en estado estacionario y el nivel de proteína fueron hasta reguladas en respuesta al tratamiento DAC, lo que sugiere la expresión LGR5 podría ser inhibido en estas células a través de la metilación del ADN. En contraste, la expresión en SW1116, LoVo, HT29 y las células Colo205 no se alteró dramáticamente después del tratamiento DAC, lo que implica una irrelevancia a los mecanismos de metilación en cuestión. Consistente con estas observaciones, hemos detectado la metilación completa de la región del promotor islas CpG en células HCT116, metilación parcial en SW480 y las células SW620 y no metilación en HT29, Colo205, las células SW1116 o LoVo (Fig 1C) mediante análisis de MSP. La precisión del ensayo de MSP se confirmó con la secuenciación de bisulfito (Figura 1D). Por lo tanto, la expresión de LGR5 en estas líneas celulares de cáncer bien correlacionada con el estado de metilación de las islas CpG promotoras, el apoyo a la metilación del ADN como un mecanismo de regulación de nivel LGR5.
A. ARN total fue extraído a partir de células indicadas sin (-) o con (+) de tratamiento DAC y RT-PCR se realizó para examinar el nivel de ARNm de estado estacionario LGR5, con GAPDH como control interno. B. El nivel de proteína de LGR5 se midió en todas las siete células de cáncer colorrectal tratados como en A con análisis de transferencia Western. α-tubulina se utilizó como control interno. estado de metilación de ADN C. de una isla CpG dentro de la región promotora proximal del gen LGR5 se determinó con el análisis de MSP. H, señal de metilación; T, señal de no metilación.
dd
H2O, el agua que no contiene ADN genómico. densidad D. La metilación de la región promotora proximal del gen LGR5 en siete líneas celulares de cáncer colorrectal se determinó por análisis BSP. Panel superior, diagrama de la distribución de los sitios CpG dentro de la UTR 5 'del gen LGR5. Cada barra vertical representa un sitio CpG. Panel inferior, BSP de 14 sitios CpG dentro de -150 a 42 región con relación al sitio estrella transcripción (TSS) en siete líneas celulares de cáncer colorrectal. Cada fila representa un alelo clonado individual que se secuenció el ADN de bisulfito siguiente modificación. Los círculos representan los sitios CpG y su espaciamiento refleja con precisión la densidad de CpG de la región. círculo negro, sitio CpG metilado; círculo blanco, sitio CpG no metilado.
LGR5 metilación correlacionada con la diferenciación in vitro CSC-
Como se informó anteriormente, la expresión LGR5 fue mayor en células no diferenciadas en comparación con las células diferenciadas en el cáncer colorrectal [9]. Para investigar la implicación de LGR5 la metilación del ADN en la diferenciación CSC, derivamos madre de cáncer o de células madre similares a las células de la línea celular HCT116 siguiendo un modelo esferas como se describe [41], donde las células madre de cáncer de mama fueron enriquecidos mediante el cultivo en suspensión como esferas no adherentes. Dos semanas después del cultivo en medio libre de suero que contiene EGF y FGF-2, se obtuvieron esferas CSC de la línea celular HCT116 (Fig 2A, primero panel). No expresión de citoqueratina 20 (CK20), un marcador para la diferenciación celular epitelial, fue detectable en las esferas de CSC por IF (Figura 2B, primero de panel). Entonces, estas esferas CSC podrían crecer por la condición de suspensión, y poco a poco se convirtió en firme y fusionado (figura 2, panel superior). Pero estas esferas se incubaron con medio donde se adhirieron poco a poco a la superficie de placa de cultivo, que era la característica de differenation cellsby disociación de las células de las esferas (Fig 2A, hacia abajo del panel) que contiene suero, y la regulación de CK20 (Fig 2B) desde el día 0 al día 7. concomitante con el proceso de diferenciación, la expresión LGR5 también se redujo por qPCR y Western blot (Fig 2C y 2D). La baja regulación de la expresión LGR5 también bien correlacionado con un aumento significativo en la densidad de metilación del promotor (Figura 2E).
A. esferas de CSC de líneas celulares HCT116 crecieron con medio sin suero CSC (panel superior); O, esferas CSC cambiaron a medio normal con 10% de FBS (hacia abajo del panel). Observación punto de tiempo: 1 día, 3 días. Y de 7 días y se fotografiaron bajo microscopio de luz. B. Inmunofluorescencia tinción de CK20 en esferas CSC; Verde indica tinción CK20. C. ARN se recogió en diferentes puntos de tiempo y se analizó por qPCR en medio con FBS al 10% del grupo. D. La proteína se recogió en diferente punto de tiempo en medio con FBS grupo 10%, LGR5 se detectó con el oeste de α-tubulina blot.westernblot se utilizó como control interno. E. Análisis BSP de la densidad de metilación del promotor LGR5 en esferas CSC y el punto en el tiempo en medio con FBS al 10% del grupo. círculo negro, sitio CpG metilado; círculo blanco, sitio CpG no metilado.
El derribo de LGR5 inducida por la diferenciación de esferas CSC
Para examinar la relación causal entre la disminución de la expresión LGR5 y diferenciación de esferas CSC, transfectadas con esferas CSC -LGR5 siRNA. En comparación con el control mezclado siRNA, siRNA-LGR5 específica redujo significativamente la expresión LGR5 (Fig 3A, p & lt; 0,001). El tratamiento siRNA también dio lugar a la sobre regulación de CK20, así como la disociación de las esferas CSC (Figura 3B). Esto es consistente con los fenotipos asociados con la diferenciación de las CMC, lo que sugiere que la baja regulación de LGR5 era suficiente para inducir la diferenciación de las esferas de CSC.
A. B.Expression de LGR5 mRNA y proteína en esferas CSC transfectadas con cualquiera de revueltos o-LGR5 específica siRNAwas examinados por qPCR y Western blot (panel superior) C. Inmunofluorescencia tinción de CK20 (verde) en esferas CSC transfectadas como en A. Azul: DAPI tinción nuclear.
LGR5 metilación fue detectable en los cánceres colorrectales, pero no los tejidos normales del colon
a continuación, se investigó la metilación del promotor del gen LGR5 en los tejidos normales del colon en comparación con los tejidos de cáncer colorrectal. Como se muestra en la figura 4A y 4B, la metilación positivo fue sólo detectable en tejidos de cáncer colorrectal, pero no tejidos de colon normales. análisis de MSP en el total de 169 cánceres colorrectales reveló que 67 muestras (40%) fueron positivos para el promotor LGR5 metilación. Además, también se examinó la expresión LGR5 por IHC.Lgr5 expresión negativa se asoció con la metilación LGR5 en el mismo tejido de pacientes con cáncer de MSP. Y bajo la metilación o expresión LGR5 unmethlation fue obviamente mayor en baja metilación o grupo unmethlation por MSP (Figura 4C). Hay datos sugieren que la metilación LGR5 se cerró a su expresión.
A. MSP se realizó en tejidos normales de colon (A) o los cánceres colorrectales primarios. H, señal de metilación; T, señal de no metilación. B. Expresión LGR5 estaba en tejidos normales y tejidos de cáncer, las flechas negras que representaban la célula positiva en LGR5 por tinción inmunohistoquímica. N1 representa el uno de los tejidos de colon normales; T5 y T22 representan, respectivamente, los pacientes con cáncer de colon.
LGR5 metilación una correlación negativa con el grado tumoral, metástasis tumoral y positivamente con buen pronóstico de cáncer colorrectal
Para evaluar la importancia clínica de LGR5 metilación, se analizó la asociación entre el estado de metilación del promotor LGR5, según lo determinado por el MSP, con una variedad de características clínico-patológicas de los pacientes con cáncer colorrectal (Tabla 2). Hemos identificado una correlación inversa significativa entre la metilación positivo LGR5 y tumor de grado superior (p & lt; 0,001), la afectación ganglionar positiva (p = 0,04) y metástasis a distancia positivo (p = 0,024), sin embargo, se identificaron no otras características tales como la edad del paciente , el sexo, la posición del tumor o duques puesta en escena. Las correlaciones inversas sugieren que la metilación LGR5 se relaciona con el cáncer de un fenotipo menos invasiva,
i
.
e
., Tumor de grado superior, de ganglios linfáticos negativos y metástasis a distancia, que fue apoyado además por el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (figura 5). Entre los 169 pacientes analizados, la tasa de supervivencia de 100 meses fue significativamente mayor en los casos con la metilación LGR5 que los no metilación (
p = 0,001
). Estos resultados indican que la metilación LGR5 fue un biomarcador predictivo independiente de buen pronóstico de cáncer colorrectal.
Kaplan-Meier de supervivencia para los pacientes agrupados en base al estado de metilación LGR5. línea continua: cáncer colorrectal positivo para la metilación LGR5, n = 67; línea de puntos: el cáncer colorrectal negativo para la metilación LGR5, n = 102. HR: Cociente de riesgos; IC del 95%: 95% Intervalo de confianza
Discusión
El tejido auto-renovación es mantenido por nichos de células madre.. El patrón de metilación dentro de los nichos regula la renovación de células madre, afectando destino de la célula, la heterogeneidad, y así sucesivamente. Cuando se perturba el equilibrio de este patrón, las células con fenotípica del tallo y de las alteraciones genéticas pueden ser sometidos a la tumorigénesis. Una gran cantidad de evidencia ha demostrado que los cambios epigenéticos, como la hipermetilación de islas CpG en regiones promotoras de varios genes, son probablemente los principales contribuyentes a la tumorigénesis en una amplia gama de tipos de cáncer [42] y costas de la isla CpG en secuencias de hasta 2 kb distante está fuertemente asociada con la expresión de genes en el cáncer de colon [43]. Además, varios marcadores de superficie celular madre de cáncer también se regularon por metilación de genes. Furhtermore, estado de hipermetilación se relacionó con baja o ninguna expresión y la diferenciación celular, por ejemplo, CD133 en el cáncer colorrectal y glioma [44, 45], y EpCAM en el cáncer de mama [36]. En el presente estudio, la hipótesis de que la expresión LGR5 silenciada o reducida se relaciona con la isla CpG metilación. En apoyo de esta hipótesis, el tratamiento con 5-aza-2'- desoxicitidina restaurado expresión LGR5 en un par de líneas de células tumorales colorrectales, con dramática sobre regulación en las células HCT116 que contiene LGR5 completamente metilado y la parte media o ninguna regulación al alza en otra celda líneas que contienen LGR5 metilado parcialmente o casi. Además, el tratamiento de DAC no alteró la expresión LGR5 en Melo publicó estudio [34] en la línea celular SW620, pero un poco aumento en nuestro estudio actual. Se analizaron la metilación LGR5 en aproximadamente ~ 1 kb promotor de LGR5, y podría haber algunas islas CpG en otro & gt; fragmento de 1 kb. Así podemos `t detectar la metilación LGR5 en la línea celular SW620, pero la expresión LGR5 fue un poco aumento después del tratamiento CAD o por otra causa poco clara. Estos datos sugieren que la metilación del ADN juega un papel importante en la regulación de la expresión LGR5.
Estudios anteriores mostraron que LGR5 jugó un papel clave en el mantenimiento de las propiedades de las células madre intestinales y de colon. se detectó poca o ninguna LGR5 expresión en células diferenciadas. Por el contrario, una alta expresión de CK20, un marcador de células diferenciadas, se encuentra también en diferentes tipos de cáncer [38, 46]. De acuerdo con estos hallazgos, nuestros resultados indican que la expresión LGR5 fue alta en CSC colorrectal, y la reducción de la diferenciación, que estuvo acompañado por la metilación del ADN mejorado y CK20 sobre regulación. Por otra parte, derribando LGR5 en esferas CSC induce la diferenciación de CSC. Estos resultados sugieren que la baja regulación de LGR5, resultado de la metilación del ADN, era responsable del fenotipo diferenciado de CSC.
Además, investigó la importancia clínica de metilación LGR5 en el cáncer colorrectal esporádico. Nos dimos cuenta de que este no era el primer estudio que mira en la modificación epigenética de los marcadores de CSC. Se ha informado de que la hipermetilación de las islas CpG localizadas en la región promotora del tallo /precursor CD44 marcador de células, uno de los marcadores colorrectales y otra superficie de células madre de cáncer, podría predecir la recurrencia bioquímica en pacientes con cáncer de próstata sometidos a prostatectomía radical [47] . La hipometilación de sitios CpG en tres promotores proximales determinó la expresión CD133 en glioblastomas [42, 48] (delet: y la hipermetilación de CD133 en HCT116 condujeron a la formación de tumores de xenoinjerto en ratones desnudos en comparación con células sin CD133 metilación). Curiosamente, también se observó que LGR5 fue más frecuentemente metilado en colones con cáncer colorrectal que en dos puntos normales, y que la expresión LGR5 estaba estrechamente regulada por metilación. El análisis clínico-patológico se deshizo la asociación inversa de la metilación LGR5 positiva con tumor de grado superior y capacidad de invasión, de acuerdo con la noción de que la sobre expresión de LGR5 estaba asociado con los cánceres más malignos e invasivos. Además, también se encontró que la metilación LGR5 se asoció significativamente con mejor pronóstico en los pacientes con cáncer colorrectal.
Se informó previamente que la pérdida de expresión LGR5 se observa en aproximadamente el 40% del cáncer colorrectal [22]. En nuestro estudio, hemos observado también positivo de metilación del promotor LGR5 en aproximadamente el 40% de los cánceres colorrectales, y verificamos que la expresión LGR5 negativo se asoció significativamente con el promotor de la metilación del ADN. Estos resultados implican que LGR5 proporciona un equilibrio entre la proliferación celular y la diferenciación del cáncer CSC. Por lo tanto, la expresión desregulada LGR5 puede inclinar el equilibrio hacia una más transformado y fenotipo oncogénico, como se observa en otro marcador de células madre, Oct4 [49] .Similarly, la deficiencia de LGR5 en el intestino delgado normales conduce a la diferenciación prematura células de Paneth en el intestino delgado [ ,,,0],27]. En este estudio, hemos identificado un nuevo mecanismo para controlar la expresión de LGR5,
i
.
e
. a través de la metilación del promotor. Hemos demostrado que la baja regulación de LGR5, como resultado de cualquiera de los tratamientos siRNA o la metilación del promotor, fue suficiente para inducir la diferenciación CSC. regulaciones similares se han observado en otros marcadores de células madre, tales como Oct4 [49]. Se ha sugerido que la metilación de ADN es eficaz en el lugar para asegurar el silenciamiento de este gen cáncer potente durante el desarrollo. La hipermetilación de los resultados LGR5 en la diferenciación de células madre del cáncer. Como sabemos, las células diferenciadas no son capaces de potente auto-renovación y aresensitive a los medicamentos quimioterapéuticos tradicionales, por lo que la metilación LGR5 podría mejorar la quimioterapia que es sensible a la célula de cáncer colorrectal. Sin embargo, es de destacar que la metilación del ADN no es el único heterogeneidad cáncer de células madre mecanismo de regulación molecular. Otros mecanismos, tales como modificaciones de las histonas, microARN, remodeladores de la cromatina y así sucesivamente [50], también pueden funcionar durante la carcinogénesis, que están más allá del alcance de este estudio. Lo que es más es que la metilación del ADN puede tener una interferencia con otras vías o regulación de la expresión génica otra señalización. Melo [34]
et al
. informó de que la metilación del promotor de Wnt genes diana es un fuerte predictor de recurrencia de cáncer colorrectal, y que un muy posible mecanismo es que la inhibición de estos genes como resultado de la metilación podría de hecho aumentar los niveles de actividad de Wnt y conducir a la progresión de la enfermedad y la recaída través de la activación de todavía metas positivas no descubiertos. Por otro lado, LGR5 alta expresión se relaciona con el mal pronóstico en el cáncer de colon [51, 52]. Silenciamiento de la expresión LGR5 podría promover la apoptosis de las células de colon cáncer y la reducción de la metástasis [22]. La metilación del promotor redujo la expresión LGR5 en líneas de tejido de cáncer de colon y de células humanas en Melo et al. informar y, en nuestro estudio. Parecía que la metilación LGR5 indica el buen pronóstico y menos invasión, y nuestros resultados fue similar a esta. No era algo diferente con Melo et al. Los resultados, que pueden ser el sesgo de nuestras muestras. Las muestras de metástasis es 31 (sólo el 18,3%, 31/169) en nuestro estudio, pero las muestras eran casi fase II en el artículo Melo`s.
En general, nuestro estudio mostró que la metilación isresponsible LGR5 para el silenciamiento de genes LGR5 y la diferenciación de las células madre tumorales en el cáncer colorrectal. Por otra parte, la metilación LGR5 es también inversamente asociada con alto grado tumoral y metástasis a distancia positiva. Además, puede servir como un marcador para predecir mejor la supervivencia entre los pacientes con cáncer colorrectal primario. Estos datos sugieren que el gen LGR5 silencingof a través de la isla CpG metilación puede estar implicada en la progresión de la CRC y potencialmente puede servir como una diana terapéutica (una complementaria a la quimioterapia tradicional para el cáncer colorrectal). son necesarios para dilucidar los mecanismos de regulación in vivo detallados estudios adicionales.
Apoyo a la Información
S1 de datos. Los datos para el análisis de supervivencia (extendida Figura 5)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0143513.s001 gratis (XLSX)
Reconocimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Shunhua Jin (Departamento de Gastroenterología, hospital Nanfang, Universidad médica del Sur) para la asistencia técnica MSP.