Extracto
La evidencia acumulada indica que las células de cáncer epitelial, incluyendo el carcinoma nasofaríngeo (APN) de células, inmunoglobulinas (Igs) expresas. Hemos determinado anteriormente que la expresión de la proteína de cadena ligera kappa en células NPC puede ser regulada positivamente por la proteína latente de membrana EBV-codificado 1 (LMP1). En el presente estudio, hemos utilizado las líneas celulares de la APN como modelos y encontramos que la producción de kappa-LMP1 aumentada se corresponde con elevaciones en la fosforilación de ERK. PD98059 atenúa la fosforilación de ERK inducida por LMP1 lo que disminuyó la expresión de la cadena ligera kappa. -ERK específica pequeños ARN de interferencia embota LMP1 inducida por
cadena ligera kappa
la expresión génica. los ensayos de reportero de luciferasa demuestran que la inmunoglobulina
κ
intensificador 3 '(3'E
κ) es activo en células de CNF expresan Ig-LMP1 y regula al alza la actividad de 3'E
κ en células NPC. Por otra parte, el análisis de mutación del sitio de unión de la PU en 3'E
κ y la inhibición de la vía MEK /ERK por PD98059 indican que el sitio de la PU es funcional y LMP1 mejorada 3'E
actividad κ está regulada en parte por este sitio. tratamiento PD98059 también conduce a una inhibición dependiente de la concentración de Ets-1 de expresión y la fosforilación inducida por LMP1, que corresponde con una atenuación dependiente de la dosis de la fosforilación de ERK LMP1 inducida y expresión de la cadena ligera kappa. Supresión de la endógena de
Ets-1 fotos: por pequeños ARN de interferencia se acompaña de una disminución de la expresión de la cadena ligera de Ig kappa. ensayos de desplazamiento en gel utilizando extractos nucleares de células NPC indican que el factor de transcripción Ets-1 es reclutado por LMP1 con el motivo de la PU dentro 3'E
κ
in vitro
. Chip ensayos demuestran, además, Ets-1 de unión al motivo de la PU de 3'E
κ en las células. Estos resultados sugieren que regula al alza LMP1 3'E
actividad κ y
kappa
la expresión génica mediante la activación del factor de transcripción Ets-1 a través de la vía de señalización de ERK. Nuestros estudios proporcionan evidencia de un mecanismo de regulación de la expresión de la novela kappa, por el cual las proteínas codificadas por el virus activan el
kappa
intensificador 3 'a través de la activación de factores de transcripción en las células de cáncer epitelial no-B.
Visto : Liu H, Duan Z, Zheng H, Hu D, Li M, Tao Y, et al. (2012) LMP1 VEB codificada favorece la expresión de Ig
κ
3'Enhancer Actividad e Ig
κ
Expresión en células de cáncer de la nasofaringe mediante la activación de la Ets-1 a través de ERK señalización. PLoS ONE 7 (3): e32624. doi: 10.1371 /journal.pone.0032624
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Julio, 2011; Aceptado: February 1, 2012; Publicado: 1 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el plan Estatal clave de Investigación y Desarrollo de base (973) del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (Nº 2004CB518703), Nacional de Investigación de alta Tecnología y Desarrollo (863) de China (Nº 404 2006AA 02A) y Nacional Fundación de Ciencia natural de China (Nº 30471968, Nº 30973399). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la restricción de la inmunoglobulina expresión (Ig) a las células del linaje de células B está bien establecida. Sin embargo, encontramos la cadena ligera kappa de Ig fue "inesperada" expresado en líneas celulares de cáncer epitelial y tejidos epiteliales [1], [2], [3]. La expresión de la cadena ligera kappa de Ig en líneas de células tumorales no hematopoyéticas Se informó también de otros laboratorios [4], [5], [6], [7].
Inmunoglobulina
cadena ligera kappa
expresión génica está bajo el control de elementos reguladores cis distintas, incluyendo promotores y potenciadores. Dos importantes
potenciadores kappa
: el potenciador intrónica (es decir,
κ), que se encuentra entre la J
κ-C
κ región, y el "potenciador 3 (3'E
κ), que se encuentra aguas abajo de la C
κ región, se han identificado [8], [9], [10]. Ambos potenciadores son inactivos en las etapas de células pro-B y pre-B y activa en las etapas de células B y células plasmáticas maduras que expresan Ig-[10], [11]. La actividad de estos potenciadores es generalmente transcripcionalmente silencioso en otras células que no pueden producir la cadena kappa, tales como células T linfoides (Jurkat) [10], las células epiteliales (HeLa) [10] y fibroblastos NIH3T3 [12]. Basándose en estas observaciones, se cree que en general la activación de estos elementos reguladores que son necesarios para
kappa de inmunoglobulina
la expresión génica y es un linaje restringido evento de células B [10]. Curiosamente, se ha encontrado que es decir,
κ humano es activo en Ig que expresan líneas celulares de carcinoma nasofaríngeo (NPC), que es importante para la expresión de la cadena ligera kappa en estas células [13]. Sin embargo, si los otros
kappa
potenciador, 3'E
κ, es funcional en las células que expresan Ig-cáncer epitelial sigue siendo desconocido.
La función de potenciadores está mediada por proteínas de unión a ADN que son reclutados a los elementos reguladores de los potenciadores. Varios elementos reguladores positivos se han identificado en 3'E
κ, incluyendo un consenso PU motivo (TTTGGGGAA) para las proteínas relacionadas con el factor de transcripción Ets [10]. La familia Ets comprende varias subfamilias, incluyendo ETS (Ets-1, Ets-2), TVC (Elk-1, SAP-1, etc.), y SPI (PU.1, Spi-B, Spi-C, etc.) . Miembros de la familia se identifican sobre la base de su composición estructural y sus similitudes en los dominios conservados evolutivamente Ets-que median la unión a secuencias de ADN ricos en purina con un centro de GGAA /T consenso núcleo [14], [15]. proteínas de la familia Ets son proteínas nucleares y la fosforilación es un importante modificación post-traduccional de muchos miembros de la familia Ets, que puede afectar a sus actividades transcripcionales y actividades de unión al ADN [15]. En las células B, la unión de la proteína PU.1 al promotor de la kappa 3 'juegan un papel importante en 3'E
función κ [16]. Se requiere la fosforilación de Ser148 en PU.1 para la interacción de PU.1 con Pip en el ADN y esta fosforilación puede regular la actividad transcripcional de PU.1 [17]. Sin embargo, la proteína PU.1 se expresa exclusivamente en células hematopoyéticas [15], [18] y es poco probable que ejecutar la función reguladora en Ig-expresión de las células cancerosas epiteliales. estudio reciente utilizando inmunoprecipitación de la cromatina junto con todo el genoma de microarrays promotor para consultar la ocupación de las tres proteínas ETS en una línea de células T humanas, reveló que la ocupación redundante se detectó frecuencia, mientras que la ocupación específica era menos probable [19]. Por lo tanto, podemos especular que, si 3'E
κ es de hecho funcional en las células que expresan Ig-cáncer epitelial, otras proteínas de la familia Ets son más propensos a tener un papel en
actividad κ 3'E que PU.1 . Por lo tanto, decidimos investigar más a fondo lo que factor de transcripción (s) unido al sitio de unión de la PU de 3'E
κ y si la unión es importante para 3'E
κ epitelial activación funcional de Ig kappa-expresión las células cancerosas.
Nuestro estudio anterior mostró que el
gen de la cadena ligera kappa
se expresó en la APN y otras células tumorales epiteliales. Lo más interesante, se encontró que los niveles de la cadena ligera kappa fueron sustancialmente más elevados en las células LMP1-positivas en comparación con las células LMP1-negativas [2]. Debido a su transformación y actividades tumorigénicas, LMP1 se considera que es una proteína oncogénica importante codificada por EBV. LMP1 media una variedad de vías de señalización celular que incluyen NF-kappa B, c-Jun-NH
quinasas 2-terminal (JNK), p38 /MAPK, PI3K /Akt y JAK /STAT y hace que la regulación positiva de la transcripción de varios genes celulares, tales como
IL-6, IL-8, bcl-2, CD23, a20
y
EGFR
[20], [21], [22]. LMP1 también puede activar el /ERK /MAPK vía de señalización Ras [23], y las quinasas de señalización Ras /MAPK, Raf, MEK y ERK, se activan en las células epiteliales nasofaríngeas LMP1 que expresan [24]. Por otra parte, Kim [25] informó de que la transfección estable de la
LMP1
gen en células MDCK indujo la expresión de Ets-1, lo que sugiere que
Ets
podría ser un gen diana de LMP1. Como se mencionó anteriormente, Ets-1 y Ets-2 son miembros de la subfamilia de proteínas relacionadas con Ets. Ambos son objetivos nucleares de la vía Ras y la fosforilación de residuos de treonina conservadas, Thr38 y Thr72 de señalización, es un evento molecular necesaria para la activación mediada por Ras de estos factores de transcripción [26]. Acumulativamente, /ERK /Ets /kappa cascada de señalización podría existir un LMP1 por el cual regula al alza LMP1 expresión de la cadena ligera kappa en células NPC.
En el presente estudio, el inhibidor de MEK, PD98059, se utilizó para investigar el papel de la vía ERK en la producción de la cadena ligera kappa-LMP1 reforzada en células NPC. Los datos presentados aquí demuestran que la producción de kappa-LMP1 aumentada corresponde con elevaciones en la fosforilación de ERK. PD98059 inhibe la fosforilación de ERK inducida por LMP1 lo que disminuyó la expresión de la cadena ligera kappa. -ERK específica pequeños ARN de interferencia embota LMP1 inducida por
cadena ligera kappa
la expresión génica. los ensayos de reportero de luciferasa demuestran que 3'E
κ es activo en las células que expresan Ig-APN y LMP1 expresión estable regula al alza la actividad de 3'E
κ en células NPC. Las mutaciones del sitio de unión de la PU en 3'E
kappa disminuyen significativamente 3'E
actividad κ LMP1 mejorada. LMP1 inducida 3'E
κ actividad se inhibe dramáticamente por la ERK inhibidor de la quinasa aguas arriba, PD98059. El tratamiento de PD98059 también conduce a una inhibición dependiente de la concentración de Ets-1 de expresión y la fosforilación inducida por LMP1, que corresponde con una atenuación dependiente de la dosis de la fosforilación de ERK LMP1 inducida y expresión de la cadena ligera kappa. La caída de la endógena de
Ets-1 fotos: por pequeños ARN de interferencia se acompaña de una disminución de la expresión de la cadena ligera de Ig kappa. ensayos de desplazamiento en gel utilizando extractos nucleares preparados a partir de diversas líneas de células NPC confirman que el factor de transcripción Ets-1 es reclutado por LMP1 con el motivo de la PU de la humana
cadena ligera kappa
gen. Chip ensayos demuestran además que Ets-1 se une directamente al motivo de la PU de 3'E
κ en las células. Estos resultados sugieren que regula al alza LMP1 3'E
actividad κ y
cadena ligera kappa
la expresión génica mediante la activación del factor de transcripción Ets-1 a través de la vía de señalización de ERK.
Materiales y Métodos
líneas celulares y cultivo celular
HNE2 es una línea celular humana APN VEB LMP1-negativo. HNE2-LMP1 es una línea celular que expresa constitutivamente LMP1 después de la introducción de larga duración
LMP1
ADNc en HNE2 células [27]. Las líneas celulares de mieloma humano, XG6, que expresa la cadena ligera λ citoplásmica, y XG7 que expresa la cadena ligera κ citoplasmática [28], se utilizaron como controles negativos y positivos de la cadena kappa, respectivamente. Raji es una línea celular de linfoma de Burkitt de células B humanas. Todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI1640 (GIBCO, EE.UU.) suplementado con 10% FBS (Gibco, EE.UU.), 1% de glutamina, y 1% de antibióticos en un ambiente humidificado 37 ° C que contiene 5% de CO
2. Para las células XG6 y XG7, 1 ng /ml de rIL-6 (Sigma, St. Louis, MO) se añadió a medio RPMI 1640 suplementado como se describe anteriormente [28]. Las células en fase de crecimiento logarítmico se utilizaron en todos los experimentos.
tratamientos con células Químicos y
El inhibidor de la quinasa MEK aguas arriba ERK, PD98059 (Cell Signaling, EE.UU.), se preparó como una solución madre de 20 mM en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma). células subconfluentes se trataron con el compuesto a varias concentraciones para diferentes momentos. procedimientos de tratamiento detalladas se describen en la figura de leyendas. La concentración final de DMSO en el medio de cultivo se mantuvo a menos de 0,1%, lo que no tuvo efecto significativo sobre el crecimiento celular. los controles del vehículo se prepararon para todos los tratamientos.
Los plásmidos
El humano
β-globina
promotor fue un promotor mínimo de 128 pb idéntica a la utilizada anteriormente [29]. El promotor se obtuvo mediante amplificación del ADN genómico celular HNE2 humano con los siguientes cebadores: Sentido, 5 '-
GAGCTC
acggctgtcatcacttagacctcac-3', que contiene el
Sac I
sitio de clonación; antisentido, 5 '-
AAGCTT
taagcaatagatggctctgccctgac-3', que contiene el sitio
Hind III
. El fragmento se insertó en el
Sac I /Hind III
sitios de la
pGL3-Basic Gráficos vectoriales (Promega, Madison, WI) y el plásmido fue designado como
pGL3-β
.
Un fragmento de 313 pb que contiene el 3'E humana
κ núcleo potenciador y 90 pb aguas arriba de las secuencias centrales potenciador [10], [30], [31] fue clonado. El 3'E
κ fragmento potenciador se amplificó a partir de ADN genómico celular HNE2 por PCR utilizando cebadores específicos del ser humano
gen Ig kappa gratis (GenBank adhesión no NG_000834.): Sentido, 5 '-
ggatcc
cctcttggtaccccagcata-3 ', que contiene un artificial
BamH I
sitio; antisentido, 5'-
GTCGAC
ctgaaagggtgtggagtgct-3 ', que contiene un artificial
Sal I
sitio. Los fragmentos amplificados por PCR fueron digeridos con
BamH I /Sal I
y se insertaron en los sitios de restricción correspondientes de la
pGL3-β
plásmido descrito anteriormente para generar
pβ-3 ' E
κwt
. Los productos de PCR se confirmaron por su tamaño, como se determina por electroforesis y por secuenciación de ADN. El mutante motivo de la PU (designada como
pβ-3'E
κmt
) de
pβ-3'E
κwt
se generó por PCR basado en una técnica de superposición de extensión [ ,,,0],32]. Los cebadores usados para generar mutaciones fueron: adelante, 5'-accctttgggcccctgaaaacagaacc-3 '; revertir, 5'-ttttcaggggcccaaagggtcttctcc-3 '. Los fragmentos amplificados por PCR que llevan las mutaciones deseadas fueron clonados en el
BamH I /Sal I
sitios de la
pGL3-β
plásmido. Las mutaciones esperadas y la integridad del potenciador se confirmaron mediante secuenciación automatizada usando un secuenciador de Applied Biosystems y software (Foster City, CA).
Se cultivaron células
ARN de interferencia
HNE2-LMP1 en 6 -bien placas y transfectadas con un oligonucleótido de ARN interferente pequeño-ERK específico (si-ERK; Cat no:#6560; 100 pmol; Cell Signaling) u oligonucleótidos revueltos (SI-revueltos; Cat no:#6568; 100 pmol; Señalización celular ); un ARN interferente pequeño oligonucleótido Ets-1-específica (si-Ets-1; Cat no: sc-29309; 150 pmol; Santa Cruz) o revueltos oligonucleótidos (si-revueltos; Cat no: sc-37007; 150 pmol; Santa Cruz ) usando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, EE.UU.) durante 72 horas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para confirmar o ERK Ets-1 desmontables, las células transfectadas con si-ERK, si-Ets-1, o un oligonucleótido revueltos fueron cosechadas para la extracción de proteínas e inmunotransferencia.
ensayos de reportero de luciferasa
La
pGL3-β, pβ-3'E
κwt
y
pβ-3'E
κmt
Firefly luciferase reportero plásmidos descritos anteriormente se usaron en combinación con el control de
pGL3-Basic Gráficos vectoriales (Promega) y el plásmido de control interno
pRL-SV40 gratis (Promega). Las células se cultivaron en placas de 24 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 por pocillo durante la noche y luego transfectadas con el plásmido indicado usando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada transfección contenía 800 ng /pocillo del plásmido indicador de luciferasa de luciérnaga y 80 ng /pocillo del control interno
pRL-SV40
plásmido. A las 24 h después de la transfección, las células se dejaron sin tratar o se trataron con 50 M PD98059 o 0,1% de DMSO durante 12 h. Las células se recogieron a 36 h después de la transfección y los lisados se analizaron para luciérnaga y
renilla
actividad de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el Dual-Luciferase reportero Assay Kit (Promega) con un luminómetro GloMax 20/20 (Promega) . Los plásmidos informadores de luciferasa fueron co-transfectadas con el
pRL-SV40
vector para corregir las variaciones en la eficiencia de transfección. Los datos se representan como la inducción veces en comparación con el
pGL3-Basic Gráficos vectoriales. Al menos tres experimentos de transfección independientes se realizaron por triplicado para cada construcción experimental.
Transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa
fueron tratados
Las células subconfluentes HNE2 y HNE2-LMP1 o no tratados con 50 mM de PD98059 12 h. ARN total fue aislado de las células, incluyendo las líneas de células Raji como controles XG6, XG7 o, usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. ARN se disolvió en 20 l de agua tratada con DEPC y se cuantificó a 260 nm. El ARN total (2 mg) se transcribió de forma inversa con superíndice ™ IIRT (Invitrogen) a 42 ° C durante 50 min, y el ADNc resultante se sometió a PCR. Para
cadena ligera kappa
RT-PCR, con el fin de determinar el número óptimo ciclo de PCR, se usó una cantidad constante de ADNc de entrada en las reacciones de PCR, se varió el número de ciclos entre 25 y 40 (25, 28, 32, 36, 38, 40) y el producto de PCR de 36 ciclos mostró una buena señal detectable y estaba en el intervalo lineal. Las condiciones de los ciclos de
kappa humana cadena ligera gratis (GenBank adhesión no AJ010442.) O por
actina
: 94 ° C durante 5 min seguido de 36 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 50 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg, y una extensión de 10 min a 72 ° C. condiciones de termociclado de PCR para miembros de la familia Ets, LMP1 y GAPDH son 95 ° C durante 5 min seguido de 32 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 40 seg, y una extensión de 10 min a 72 ° C. Para cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR), iTaq SYBR Green Supermix con Rox fue utilizado con las siguientes condiciones de ciclado (gato sin 172-5850, Bio-Rad..): 95 ° C durante 10 minutos, luego 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos seguido de 60 ° C durante 1 min en un sistema ABI Prism 7500 de detección de secuencias (Applied Biosystems). Los niveles relativos de expresión de ARNm se calcularon de acuerdo con el método comparativo CT (ΔΔCT) después de la normalización de la expresión de GAPDH. Las secuencias de cebadores para la amplificación de la cadena ligera kappa de Ig, miembros de la familia Ets [33], LMP1 [34] y los controles internos se enumeran en la Tabla S1. Los productos de PCR fueron separados en 1,5 a 2% en geles de agarosa y se visualizaron con bromuro de etidio.
Proteína extracción
lisados de células enteras se prepararon esencialmente de acuerdo con un método descrito anteriormente [2]. Para los ensayos de movilidad electroforesis (EMSA), extractos nucleares se prepararon utilizando el Kit NE-PER nuclear y citoplasmática de extracción (Cat. No. 78833, Pierce, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de proteína se determinó utilizando el reactivo de ensayo BCA (Cat. no. 23228, Pierce).
Western El análisis de transferencia
Las proteínas (50 a 100 mg) se hirvieron en tampón de muestra de SDS durante 5 min , se resolvieron en 10% de geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Millipore, EE.UU.). reactividad no específica se bloqueó incubando la membrana durante 30 min en una solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% de Tween-20 y 10% de leche sin grasa seca. La membrana se incubó durante la noche a 4 ° C con varios anticuerpos primarios, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 1 h con un ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante o anticuerpo secundario de conejo (Santa Cruz, EE.UU.), y después se lavó tres veces durante 10 minutos cada con solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween-20. Las proteínas de anticuerpos unidos se detectaron utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia potenciada (Cat. No. 34075, Pierce) seguido de exposición a película autorradiográfica. Después de sondeo para ERKs fosforilados o fosforilada Ets-1 para examinar ERKs estado de activación o el nivel de fosforilados Ets-1, las membranas fueron despojadas por incubación a 50 ° C durante 30 min en tampón de extracción (100 mM β-mercaptoetanol, 2% (en peso /vol) de dodecilsulfato de sodio y Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8) y reprobed con anti-ERK o anti-Ets-1. Los siguientes anticuerpos se utilizaron para transferencia Western: anticuerpo monoclonal anti-LMP1 ratón (CS.1-4, DAKO, Dinamarca), anticuerpo de conejo de cadena ligera kappa anti-humano (A0191, DAKO), Ets-1 (sc-350), treoninas fosforiladas (sc-5267), ERK (SC-93), ERK fosforilada (sc-7383), y α-tubulina (sc-5286) (todos de Santa Cruz).
p> lisados de células enteras (200 mg) se mezclaron con perlas de proteína a-Sepharose (Sigma), se incubaron a 4 ° C durante 2 h, y se centrifugaron durante 2 min a 2000 rpm para preclearing. A continuación, la fracción sobrenadante se incubó a 4 ° C durante la noche con 4 g de un anticuerpo y la proteína perlas de Ets-1 A-Sepharose, seguido de centrifugación durante 2 minutos a 12.000 rpm. Los inmunoprecipitados se recogieron y se lavaron cinco veces con tampón de PAPI (mM Tris-HCl 50 pH 7,5, que contiene desoxicolato 1% NP-40, 0,05% de SDS, 0,5% de sodio, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, e inhibidores de proteasa). Los precipitados se eluyó de las perlas de proteína A-Sepharose por ebullición durante 5 min y finalmente se sometieron a análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo para detectar la fosforilación de treonina.
electroforética ensayos de cambio de movilidad
cambio de movilidad
electroforética ensayos (EMSA) se realizaron utilizando el kit LightShift ™ quimioluminiscente EMSA (Cat. no. 20148, Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de proteína en los extractos nucleares se determinó utilizando el reactivo de ensayo de proteína BCA (Cat. No. 23228, Pierce) y EMSAs se realizaron con alícuotas que contienen cantidades iguales de proteína. Las mezclas de reacción (20 l) que contienen extractos nucleares (8 g) se incubaron con sondas marcadas con biotina de doble cadena de oligonucleótidos (2 nM) en tampón de reacción (Pierce) durante 20 min a temperatura ambiente. Las reacciones fueron sometidas a electroforesis en 5% de geles de poliacrilamida en ácido tetra-acético diamina 0,5 × Tris-borato-etileno (TBE) tampón seguido de electrotransferencia a membranas Biodyne ™ B de nylon (Cat. No. 77016, Pierce) y UV reticulación . oligonucleótidos biotinilados se detectaron entonces mediante el sondeo con estreptavidina conjugada con HRP y se visualizaron usando un kit ECL y autorradiografía. Para los análisis de la competencia, un exceso de 100 veces de la correspondiente oligo de tipo salvaje no marcado o el oligo mutante se incluye en la reacción de unión. Para los experimentos de supershift de anticuerpos, las mezclas de reacción se incubaron previamente con 2 g de un anticuerpo Ets-1 (sc-350X, Santa Cruz) a temperatura ambiente durante 1 hr. Los oligonucleótidos complementarios se utilizan como sondas o competidores son como sigue: los oligonucleótidos κPU humanos de tipo salvaje, 5'-gaagaccctttggggaactgaaaacaga-3 'y 5'-tctgttttcagttccccaaagggtcttc-3', derivado de la secuencia del sitio de PU dentro de la 3'E humano
κ. Los oligonucleótidos κPU mutado (designados como mutPU) usados fueron 5'-gaagaccctttgggcccctgaaaacaga-3 'y 5'-tctgttttcaggggcccaaagggtcttc-3'. Las sondas competidoras no específicas fueron 5'-ccagagggggatttccaagaggcca-3 'y 5'-tggcctcttggaaatccccctctgg-3', que se deriva de la secuencia del sitio de NF-kB en el humano es decir,
κ. sitios de unión están subrayadas y las mutaciones se muestran en negrita. Las sondas de oligonucleótidos mutados contra el sitio de unión para κPU EMSAs son idénticos a los de las secuencias mutadas en las construcciones de genes informadores.
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayo
Chip análisis se realizó utilizando un chip kit de ensayo (Upstate Biotechnology, Lake Placid, Nueva York) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se añadió una solución de formaldehído directamente a las células HNE2-LMP1 a una concentración final de 1% y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. A continuación, se neutralizaron las células durante 5 min con glicina a temperatura ambiente y se lavaron dos veces con inhibidores de la proteasa frío de hielo 1 × tamponada con fosfato salino que contiene. Las células se rompieron usando un tampón de lisis que contiene inhibidores de la proteasa SDS. Cromatina en el lisado (350 l) se cortó a una longitud media de ~ 500 pb por sonicación con una célula Branson Sonifier Disruptor B15 (control de salida 4, el ciclo de trabajo del 40%), con 14 ciclos de pulsos de 20 segundos a 20 segundos intervalos. La suspensión se precleared en un ADN de esperma de salmón /proteína una suspensión /agarosa-50% durante 1 hora a 4 ° C. Después de la cromatina era "precleared", una pequeña alícuota (10 l) se guarda como "ADN de entrada" para el análisis de PCR después. Las alícuotas restantes (100 l cada una) de la cromatina reticulada esquilada se incubaron durante la noche con 2 g Ets-1 (sc-350X), IgG de conejo (sc-2027) (Santa Cruz), o ningún anticuerpo a 4 ° C con suave sacudida. Los complejos inmunes se incubaron durante 2 horas a 4 ° C en un ADN de esperma de salmón /proteína una suspensión /agarosa-50% con agitación suave, se lavaron y se eluyeron. La reticulación se invirtió el uso de 5 M NaCl. Después de digestión con proteinasa K, el ADN en las muestras se extrajo con fenol, se precipitó con etanol, y se resuspendió en 50 l de ddH
2O. Se utilizó la solución de ADN (2 l) durante 36 ciclos de amplificación PCR. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Los siguientes cebadores fueron utilizados en los ensayos de chip:. Humano 3'E
potenciador κ incluyendo la región PU vinculante, 5'-ccagggaccaagatagcaac -3 'y 5' ctgaaagggtgtggagtgct -3 '(158 bp)
el análisis estadístico
Todos los cálculos estadísticos se realizaron con el programa SPSS (v. 12.0) programa de software estadístico. Las diferencias entre los diferentes grupos fueron evaluados por
t
test de Student. La diferencia fue estadísticamente significativa cuando
p
. & Lt; 0,05
Resultados
LMP1 aumenta la expresión de la cadena ligera kappa a través de la vía de señalización de ERK en células NPC humanos
LMP1 puede activar el /ERK /MAPK vía de señalización Ras [23] y nuestro estudio anterior indica que regula al alza LMP1 expresión de la cadena ligera kappa en líneas de células NPC [2]. Para confirmar si la vía ERK es involucrar en la expresión de la cadena ligera kappa-LMP1 aumentada, PD98059 se usa para manipular la activación de ERK y la regulación positiva de la cadena kappa inducida por LMP1. El nivel de fosforilación de ERK fue mayor en las células HNE2-LMP1 que en las células HNE2, lo que demuestra que de hecho LMP1 activa la vía de ERK en células NPC (Figura 1A). El tratamiento de células HNE2-LMP1 con PD98059 dio como resultado una supresión dependiente de dosis de la cadena ligera kappa LMP1 inducida (Figura 1B), lo que correspondía con una atenuación dependiente de la dosis de la fosforilación de ERK inducida por LMP1 (Figura 1A). PD98059 (50 mM) mostró claramente un efecto inhibidor sobre las células HNE2-LMP1, pero no tuvo efecto sobre las células HNE2 (Figura 1C). Con el fin de determinar si la inhibición de la expresión de kappa de Ig por PD98059 tratamiento tiene lugar a nivel transcripcional, células HNE2 y HNE2-LMP1 se mantuvieron en las mismas condiciones y los niveles de
cadena ligera kappa
ARNm fueron examinados por RT -PCR. El tratamiento con PD98059 (50 mM) indujo una marcada disminución en
kappa
expresión de ARNm de LMP1 inducida, pero el
kappa
nivel de ARNm en HNE2 permaneció esencialmente sin cambios (Figura 1D), que está de acuerdo con la resultados de inmunotransferencia. Para confirmar aún más que la vía ERK desempeña un papel en LMP1 inducida por
cadena ligera kappa
expresión génica, se tiró al suelo
ERK
expresión de interferencia por ARN. Considerando que la transfección de células HNE2-LMP1 con un oligonucleótido revueltos no afectó LMP1 inducida
expresión kappa
gen,
si-ERK
mitigado el efecto de LMP1 (Figura 1E), lo que indica que la ERK vía está involucrada en este caso. En general, estos resultados confirman la idea de que la regulación positiva de la cadena ligera kappa por LMP1 se produce a través de la activación de la vía de señalización de ERK /MAPK.
células HNE2-LMP1 (A) se trataron con las concentraciones indicadas de PD98059 o 0,1 % de DMSO durante 2 horas. Lisados de células enteras se prepararon y los niveles totales de ERK fosforiladas y se determinaron mediante transferencia Western. (B) células HNE2-LMP1 se trataron con las concentraciones indicadas de PD98059 o 0,1% de DMSO durante 12 h. expresión de la cadena ligera kappa en las células de la APN se evaluó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo específico. (C) y las células HNE2 HNE2-LMP1 se trataron con PD98059 50 M o DMSO al 0,1% durante 12 horas y Western Blot se realizó para detectar la expresión de la cadena ligera kappa. células HNE2 y HNE2-LMP1 (D) se incubaron con medio que contenía la concentración indicada de PD98059 o 0,1% de DMSO durante 12 h. ARN total fue aislado de las células y se sometió a RT-PCR, utilizando cebadores específicos diseñados para amplificar
cadena ligera kappa Opiniones y
actina
ARNm. (E) células HNE2-LMP1 se transfectaron con
SI-ERK
oligonucleótido o revueltos. los niveles de proteína ERK y Ig kappa se detectaron por inmunotransferencia. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. Fosforilación o nivel de expresión total de cada proteína, así como mRNA se estimó por densitometría y se presentan como una proporción a la respectiva control de carga (paneles de la derecha). XG7 células y XG6 se muestran como controles positivos y negativos, respectivamente, para la cadena ligera kappa.
El sitio de unión de la PU está involucrado en la actividad LMP1-mejorada de 3'Eκ a través de la vía ERK
se requiere la activación de la 3'E
κ
kappa de la inmunoglobulina expresión génica
. Con el fin de investigar si 3'E
κ podría ser activado funcionalmente en las células de la APN, hemos vinculado un 3'E
fragmento κ humana promotor de 313 pb, que contiene el núcleo potenciador y 90 pb aguas arriba de las secuencias de núcleo potenciador que es necesario para la actividad máxima potenciador cuando el núcleo potenciador no es directamente adyacente al promotor [31], a la humana
β-globina
promotor para conducir la expresión del gen de la luciferasa de luciérnaga y se analizaron este constructo reportero por transitoria la transfección de líneas celulares de la APN (Figura 2A, B). El humano
β-globina
promotor fue elegido porque se ha utilizado anteriormente para varios estudios de potenciadores de la inmunoglobulina [35], [36], [37], y también porque nos pareció que para ser mínimamente afectada por LMP1 en nuestros experimentos (Figura 2C y la Figura 3). Los constructos se introdujeron en células y HNE2 HNE2-LMP1 para probar la actividad de 3'E
κ. La transfección de
pβ-3'E
κwt
genera una mayor actividad de la luciferasa de transfección de la
pGL3-β
construir (sin potenciador), independientemente de si LMP1-negativo (
p Hotel & lt; 0,05) o LMP1-positivo (
p Hotel & lt; 0,01) se examinaron las células NPC. Estos resultados indicaron que 3'E
κ es activa en células NPC que expresaban la cadena ligera kappa de Ig. Por otra parte, la actividad de 3'E
κ en células HNE2-LMP1 fue aproximadamente 3 veces mayor que la de las células HNE2 (
p
& lt; 0,05) (Figura 2C), que de acuerdo con la kappa los patrones de expresión de la cadena de estas dos líneas celulares [2].