Extracto
El cáncer de pulmón es una de las enfermedades más letales con una alta tasa de recurrencia y metástasis. Estudios recientes indican que los tumores contienen un subconjunto de células de cáncer de vástago-como que poseen ciertas propiedades de células madre. En este documento, hemos utilizado Hoechst 33342 ensayo de tinte de flujo de salida y citometría de flujo para aislar y caracterizar la población lateral (SP) células de línea celular de cáncer de pulmón humano NCI-H460 (H460). Se demuestra que las células H460 SP albergan células madre similares, ya que pueden formar fácilmente esferas flotantes independientes de anclaje, poseen un gran potencial proliferativo, y exhiben una mayor tumorigenicidad. Es importante destacar que las células H460 SP fueron capaces de auto-renovación, tanto in vitro como in vivo. Finalmente, se muestra que las células H460 SP preferentemente expresan ABCG2, así como SMO, un mediador crítico del erizo (HH) de señalización, que parece desempeñar un papel importante en las células de cáncer de pulmón H460 como la obstrucción mediante ciclopamina inhibe en gran medida del ciclo celular progresión. En conjunto, nuestros resultados proporcionan mayor sustento a la existencia de células madre de cáncer de pulmón y también implican la señalización de HH en la regulación de cáncer de pulmón de células grandes (tallo) células
Visto:. Shi Y, Fu X, Y Hua, Han Y, Lu Y, Wang J (2012) La Población lateral en la línea celular de cáncer de pulmón humano NCI-H460 se enriquece en células madre, como el cáncer. PLoS ONE 7 (3): e33358. doi: 10.1371 /journal.pone.0033358
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 8 Septiembre, 2011; Aceptó 7 de febrero de 2012; Publicado: 13 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Shi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el fondo de proyectos clave de Shanghai Ciencia y Tecnología Asociación, china (Grant No.05119554). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Desde hace tiempo se apreciará que la mayoría de los tumores son heterogéneos que contiene un espectro de fenotípicamente diferentes tipos de células. El trabajo en la última década indica que varios tumores sólidos humanos también contienen células tumorales funcionalmente divergentes con subpoblaciones poseyendo un alto potencial tumorigénico y ser capaz de reconstituir la heterogeneidad fenotípica y histológico del tumor padres cuando son trasplantadas en ratones inmunodeficientes. Tales subconjuntos de células tumorales que poseen una mayor capacidad tumorigénico han sido llamados operacionalmente células iniciadoras de tumores o células madre del cáncer (CSC), que ahora se han reportado en la mayoría de los tumores sólidos [1], [2]. La mayoría de las células madre cancerosas se han identificado, enriquecido, y se purificaron usando los marcadores de superficie celular (s), entre los que CD44 y CD133 son los ensayos más populares, o funcionales, que incluyen población lateral (SP) [3] - [6] y los ensayos de Aldeflour [7], [8]. La estrategia de SP se desarrolló inicialmente para enriquecer las células madre hematopoyéticas [3] y se basa en la capacidad de las células madre, que sobreexpresan desintoxicante superficie celular bombas ABCG2 y MDR1 (es decir, P-glicoproteína), para flujo de salida de manera eficiente la célula permeable colorante Hoechst 33342 y, en consecuencia, la longitud de onda dual parcela FACS para presentar como una población Hoechst-negativo en el "lado '(o en la cola). El ensayo Aldeflour, por otra parte, se aprovecha de las células madre que sobreexpresan desintoxicantes deshidrogenasas enzimas aldehído (ALDH) [7], [8] y por lo tanto, la población enriquecida en CSC puede metabolizar de manera más eficiente un sustrato ALDH experimental para liberar más fluoróforo.
el cáncer de pulmón es el más letal maligancy en todo el mundo. El trabajo en los últimos años indica que tanto células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) contienen células cancerosas madre-como [9] - [29]. Al igual que en la mayoría de los tumores, "pulmón células madre cancerosas" se han enriquecido y purificado utilizando marcadores de superficie celular CD44 o CD133 o el uso de los dos ensayos funcionales mencionados anteriormente. Estas células madre cancerosas pulmonares se ha demostrado que poseen alta clonal, clonogénico, y con frecuencia, el potencial tumorigénico y ser generalmente resistente a los tratamientos terapéuticos. Las células madre de cáncer de pulmón se han reportado en cultivos a largo plazo, así como en xenoinjertos de tumores de pacientes y primarios. De interés, un estudio reciente utilizando modelos genéticos de ratón de cáncer de pulmón muestra que los tumores de pulmón con diferentes antecedentes genéticos tienen distintos fenotipos CSC [30], aumentando la posibilidad de que diferentes tumores pulmonares de los pacientes pueden tener diferentes fenotipos de CSC. Aunque la técnica SP se ha empleado para demostrar células madre cancerosas en varias líneas celulares de cáncer de pulmón [10], [11], [13], [25], no se sabe si todas las líneas celulares de cáncer de pulmón derivadas de tumores de pacientes poseen un SP que se enriquece en las células cancerosas madre parecido. Aquí nos ocupamos aún más esta cuestión mediante el uso de la gran línea de células grandes carcinoma humano NCI-H460 (H460) y nuestros resultados revelan que las células H460 poseen un SP que está enriquecida en células iniciadoras del tumor.
Resultados y Discusión
línea celular de cáncer de pulmón humano NCI-H460 cultivadas tiene un SP
Estamos manchados primera H460 células con Hoechst 33342, que se extruye de forma activa por transportadores ABC verapamilo-sensible en las células madre [3]. Cuando observamos las células teñidas con un microscopio de fluorescencia, la mayoría de los núcleos, como se esperaba, apareció azul; sin embargo, un pequeño número de núcleos fueron negativos para la tinción de Hoechst (Fig 1, A y B;. las flechas apuntan a una célula Hoechst-negativo). Posteriormente cuantificamos el SP por doble longitud de onda citometría de flujo [3] - [6], [10], [11], [13], [25]. Detectamos, en múltiples culturas H460 independientes, un SP de 3,80 ± 0,5% (n = 9), como se ilustra en la Fig. 1C. Es importante destacar que, el SP se eliminó por completo en presencia de verapamil (Fig. 1D), un bloqueador de los canales de calcio y un inhibidor específico de ABCG2 y MDR1 se utiliza en el tratamiento clínico de cáncer de pulmón [31], lo que indica la especificidad de la que SP detectado en las células H460.
a-B, Hoechst tinción de las células H460. Tenga en cuenta que si bien la mayoría de las células se tiñeron en el núcleo, algunas células (indicados por flechas) no parecen tener tinción Hoechst nuclear. C-D, SP fenotipos en la ausencia (C) o presencia (D) de verapamilo.
SP células muestran un alto nivel de proliferación potencial y puede auto-renovación
Hasta ahora la mayoría células madre como se han demostrado tener una capacidad para formar esferas que flotan libremente en condiciones independientes de anclaje [4] - [6], [10], [11], [13]. Además, se han reportado las CSC de poseer un alto potencial proliferativo. Para determinar si las células H460 SP tienen similares propiedades asociadas-CSC, que primero cultivadas células SP y no SP purificadas en condición libre de suero (ver Métodos). Hemos observado que las células H460 SP formaron esferas flotantes típicos con una eficiencia de 4,8 ± 0,1% (Fig. 2A), mientras que las células no SP principalmente mostraron patrón de crecimiento adherente (Fig. 2B) con capacidad mucho menor de formación de esferas (0,8 ± 0,3%). CCK-8 experimento de proliferación (véase el método) también reveló un mayor potencial proliferativo en las células SP en comparación con las células no-SP (Fig. 2C). Cuando las esferas derivadas de células SP primaria se disocian y se pasaron, se forman fácilmente esferas secundarias (datos no mostrados). Cuando esferas SP primarios disociados fueron cultivadas en medio completo que contenía suero bovino fetal (FBS) durante una semana, se detectaron nuevas células SP (6,2 ± 0,8%) con las células mayoría son células no SP (Fig. 3A). Una vez más, el fenotipo SP se bloqueó completamente en presencia de verapamil (Fig. 3B). Estos resultados sugieren que las células SP pueden auto-renovarse
in vitro
.
A-B, SP purificada y no SP células fueron cultivadas en medio libre de suero en condiciones independientes de anclaje. Las células SP formaron esferas flotantes típicos dentro de 4 días (A), mientras que las células no-SP en gran medida establecidos crecimiento adherente (B). C, Las células SP muestran mayor capacidad proliferativa de las células no-SP según lo determinado por la CCK-8 kit (
P Hotel & lt; 0,05 para todos los puntos temporales, Estudiante
t-test
).
a-B, SP reanálisis cuando las esferas SP células fueron disociadas desglosados y cultivadas en medio que contiene suero normal para una semana. C-D, SP reanálisis en los tumores derivados de células SP. E-F, SP reanálisis en los tumores derivados de células no-SP. A, C, E, sin verapamil. B, D, F, con verapamilo.
Las células H460 SP demuestran tumorigenicidad mayor que las células no-SP
El estándar de oro para el ensayo de propiedades CSC es para llevar a cabo la limitación correspondiente dilución experimentos de trasplante del tumor [1], [2] y para comparar la tumorigenicidad, comúnmente miden por la incidencia de tumores, la latencia (es decir, el tiempo entre la implantación de células tumorales a cuando los tumores primero se pueden palpar), tasa de crecimiento (es decir, el volumen del tumor), y el peso del tumor punto final. Se purificó el H460 SP y las células no SP y se inyecta el número de células cada vez mayor en Matrigel por vía subcutánea (s.c.) en el diabético /inmunodeficiencia combinada severa (NOD /SCID) los ratones no obesos (Fig. 4A). Se encontró que las células SP global mostraron tumorigenicidad mayor que las células no-SP. Por ejemplo, las células SP regeneran tumores en el número de células más bajo (es decir, 5000) implantado mientras que las células no-SP no regenerar cualquier tumor a esta dosis de células (Fig. 4A). Las células SP regeneran 6/6 tumores (es decir, 100%), mientras que las células no dieron lugar a SP 4/6 tumores (67%;
P = 0,039
, pruebas de Chi-cuadrado). Además, las células SP establecieron tumores con una latencia más corta que las células no SP correspondientes (Fig 4A;.
P
= 0,007). Además, los tumores derivados de células H460 SP crecieron más rápido que conduce a tumores mucho más grandes que los tumores derivados de células no-SP (Fig 4A-C;.
P
& lt; 0,01). Histológicamente, los tumores de xenoinjertos regeneradas tenían características morfológicas del cáncer de pulmón de células grandes. En particular, los tumores SP muestran la abundancia de células y figuras mitóticas y mostraron invasión capsular evidente (Fig. 4D, izquierda). Por el contrario, los tumores no mostraron SP áreas necróticas más (Fig. 4D, derecha).
A, Tabla presentación del potencial tumorigénico de SP H460 y las células no-SP. Tres parámetros de tumorigenicidad, es decir, la incidencia de tumores, la latencia, y el volumen (*
P Hotel & lt; 0,01) se muestra. Todos los animales fueron terminados (plazo.) 28 días después de la implantación. B, Las células SP regenera tumores más grandes que las células no-SP correspondiente en cada dosis de células. C, imágenes de tumor macroscópico cuando los tumores se cosecharon a los 28 días después de la inyección s.c. la inyección de las células SP y no SP en ratones NOD /SCID. D, Representante fotomicrografías HE-manchadas de tumores SP y no SP.
Fue sorprendente y potencialmente interesante que las células no-SP, a 50.000 y 100.000, también regeneran tumores aunque los tumores eran más pequeños (Fig. 4B-C). Dado que las células no-SP no forman tumores a 5.000 células (Fig. 4A), la explicación más sencilla sería que la población de células no-SP podría estar contaminada con un pequeño número de células SP, lo que daría lugar a tumores cuando grande se implantaron número de células no-SP. Alternativamente, las células no-SP podría ser capaz de "des-diferenciar atrás a las células SP a una velocidad tan baja que en vivo algunas células no-SP fueron convertidas en células SP, que luego dieron lugar a tumores. Este último escenario se ha demostrado recientemente por otros en varios sistemas de células tumorales cultivadas [32]. Para comenzar a explorar estas posibilidades diferentes, analizamos la composición de SP en ambos SP-SP y no celulares derivadas de tumores H460. Hemos observado que los tumores SP contenían 8,4 ± 0,6 células SP% (Fig. 3C-D), mientras que los tumores no contenían SP células SP 1,4 ± 0,2% (Fig. 3E-F). Aunque estos resultados no podían distinguir definitivamente la contaminación de la conversión, que proporcionaban una explicación de por qué las células no-SP sigue dieron lugar a tumores - que era porque los tumores no contenían células SP SP
La célula madre. marcadores ABCG2 y SMO son altamente expresado en células SP
El fenotipo SP en células madre hematopoyéticas está mediada principalmente por ABCG2 con alguna participación de MDR1 o la proteína de resistencia a múltiples fármacos 1 [31]. Muchos CSC-enriquecido sobreexpresan de SP ABCG2 [4], [6]. por lo tanto, se analizaron los niveles de ABCG2 de ARNm y observó que, en comparación con las células normales FBS-cultivadas en monocapa H460 (Fig. 5A, carril 1), tanto en la esfera (Fig. 5A, carril 2) y células SP purificadas (Fig. 5A, carril 3) expresado un aumento significativo de los niveles de ARNm de ABCG2, mientras que las células H460 no SP purificadas prácticamente carecían de expresión ABCG2 (Fig. 5A, carril 4). Del mismo modo, los tumores SP (Fig. 5A, carril 7) también expresan niveles más altos de ABCG2 que los correspondientes tumores no SP (Fig. 5A, carril 8). Una presentación cuantitativa se muestra en la Fig. 5B.
A, gel de imágenes Representante de RT-PCR. M, marcador; carril 1, las células NCI-H460 normalmente cultivadas en medio que contiene suero; carril 2, las esferas H460; carril 3, se purificaron células SP; carril 4, se purificaron células no SP; carril 5, el grupo de control tomatidina; carril 6, el grupo experimental ciclopamina; carril 7, los tumores SP; carril 8, los tumores no-SP. B, la presentación cuantitativa de los niveles de ARNm y ABCG2 SMO como se determina mediante densitometría (
P Hotel & lt; 0,001, excepto ABCG2 ARNm carril 6 vs carril 8 y SMO ARNm carril 1 vs carril 5 y el carril 4 carriles vs. 6).
células de cáncer de pulmón tumorigenos incluyendo células SP han demostrado que expresan preferentemente moléculas auto-renovación como Oct-4, Nanog, Bmi-1 y c-Kit [14], [ ,,,0],16], [17], [22], [29], componentes de señalización Notch [18], [28], y Wnt /β-catenina [23]. Nuevas evidencias sugieren que el Hedgehog (HH) vía de señalización puede ser también íntimamente involucrado en el desarrollo del cáncer de pulmón y la progresión [33], [34]. La activación de la señalización de HH requiere la proteína transmembrana Smoothened (SMO) como un mediador crítico de la señalización de HH [35] y ABCG2 puede actuar en la regulación aguas arriba de la vía de señalización Hh para proteger la stemness del compartimiento de SP [36]. por lo tanto, a fin de determinar los niveles de mRNA de SMO en el mismo conjunto de muestras que se utilizaron para el análisis ABCG2. Sorprendentemente, muy parecido a ABCG2, los niveles de ARNm de SMO fueron significativamente elevados en esferas H460, células SP, y los tumores derivados de células SP (Fig. 5A-B). A nuestro entender, este hallazgo puede representar la primera vincular SMO sobreexpresión de las células del cáncer de pulmón enriquecidos-CSC.
La ciclopamina inhibidor SMO inhibe la proliferación celular H460
HH vía de señalización ha sido implicado en el mantenimiento de las células madre o progenitoras en muchos tejidos adultos. Esta vía regula la proliferación celular, la polaridad del tejido, y la diferenciación celular durante el desarrollo normal. Es importante destacar que la activación anormal vía HH, tales como altos niveles de expresión de SMO, puede jugar un papel en el mantenimiento de la capacidad de las células madre tumorales, lo que favorece la auto-renovación, y la proliferación de su progenie [36], [37]. Para determinar si la señalización de HH juega un papel en las células H460, se emplearon ciclopamina, un alcaloide esteroideo que inhibe la actividad SMO. Como control para la ciclopamina, se utilizó un alcaloide estructuralmente relacionado, tomatidina, que no afecta a la actividad SMO y la señalización de HH. En comparación con tomatidina, ciclopamina pareció reducir los bajos niveles endógenos de SMO mRNA (Fig. 5A, carriles 5 y 6). En comparación con el control del vehículo y grupo tomatidina, ciclopamina de la dosis y dependiente del tiempo inhibió el crecimiento de células H460 cuando se utiliza a 2-40 mmol /L (Fig. 6A-E). El análisis del ciclo celular demostró que ciclopamina, en 20 mol /L, en función del tiempo causada células H460 para detener en la fase G1 /S del ciclo celular (Fig. 6F). En concreto, el tratamiento ciclopamina aumentó las células G1 de ~71% a las 24 h hasta ~93% a las 96 horas, mientras que la disminución de células en fase S del 18% a las 24 h al 2% a las 96 h (Fig. 6F). A las 96 h, ligeramente aumento de la apoptosis (es decir, ~ 2%) también se observó (Fig. 6F). Cabe señalar que los dos grupos de vehículos y control tomatidina también mostraron aumentos dependientes del tiempo en células en fase G1 y disminuciones relacionadas con el tiempo en las células en fase S (Fig. 6f), probablemente debido al hecho de que todas las células se cultivaron hasta a 96 h sin la reposición de los medios de comunicación. Por lo tanto, el agotamiento de los factores de crecimiento y nutrientes causada detención del ciclo celular parcial en los grupos control. En conjunto, estos resultados demuestran que la señalización de HH es vital en células H460 y el bloqueo de la señalización HH provoca drásticamente la detención del ciclo celular. Desde SMO se expresa preferentemente en SP y esferas (Fig. 5), suponemos que la señalización de HH impone sus posibles efectos sobre las células madre cancerosas de pulmón.
A-C, fotomicrografías representativas de células H460 72 h CSC enriquecida después del tratamiento con vehículo de control (A), tomatidina (B), o ciclopamina (C). maginifications originales: × 200. D, ciclopamina dependiente de la dosis la proliferación de células H460 inhibido (
P
& lt; 0,05; ANOVA de una vía). E, Evolución temporal de la inhibición de las células H460 ciclopamina (
P Hotel & lt; 0,05, ANOVA de una vía). La ciclopamina se utilizó a 20 mmol /L. F, Efectos de la ciclopamina en el ciclo celular de las células H460.
En resumen, en este estudio se presentan pruebas de que la línea celular de carcinoma de pulmón de células grandes H460 humano contiene un SP detectable. Además, se muestra que las células H460 SP albergan células madre como ya que pueden formar fácilmente esferas flotantes independientes de anclaje, poseen un gran potencial proliferativo, y presentan una mayor capacidad de regeneración de tumor. Es importante destacar que las células H460 SP parecen ser capaces de auto-renovación in vitro (evidenciado por resiembra células esfera en medio de cultivo regular; Fig. 3A) e in vivo (evidenciado por los tumores SP que contienen un pequeño porcentaje de células SP con la mayoría siendo las células no-SP; Fig. 3C). Finalmente, se muestra que las células H460 SP preferentemente expresan ABCG2, así como SMO, un mediador crítico de la señalización de HH, que parece desempeñar un papel importante en las células de cáncer de pulmón H460 como su obstrucción mediante ciclopamina inhibe en gran medida la progresión del ciclo celular. En conjunto, nuestros resultados proporcionan apoyo adicional a la presencia de células cancerosas madre-como en líneas celulares de cáncer de pulmón cultivadas y también implican la señalización de HH en la regulación de cáncer de pulmón de células grandes (tallo) de las células.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas institucionales. Todos los estudios relacionados con los animales fueron aprobados por el comité de la Universidad de Tongji IACUC institucional. NOD /SCID (el número de permiso: SYXK20070005) a nivel de SPF se utilizaron para experimentos de implantación de células tumorales en este estudio. Todos los otros estudios presentados en este informe fueron iniciadas por el investigador y no requieren la aprobación de otros organismos reguladores.
Líneas celulares y animales
pulmón línea celular de carcinoma de células grandes NCI-H460 humano fue comprado a la Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas, CAS (Shanghai, china) y se mantuvieron en medio recomendado por ATCC. Todos los medios se complementaron con 1% de penicilina /estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS; Invitrogen-Life Technologies). Las células se incubaron en un incubador humidificado a 37 ° C se suministra con 5% de CO2. Las células se mantuvieron rutinariamente en 75 cm
2 frascos de cultivo de tejidos (Corning Incorporated, EE.UU.) y cosechados utilizando tripsina al 0,25% cuando estaban en la fase logarítmica de crecimiento para el análisis de SP. La inmunodeficiencia combinada /grave diabéticos no obesos (NOD /SCID) los ratones fueron adquiridos de la Shanghai SLAC Animales de Laboratorio Co. Ltd.
SP análisis
El protocolo básico se basa en Goodell et al [3 ]. Brevemente, las células NCI-H460 se resuspendieron a 1 x 10
6 /ml en DMEM precalentado (Invitrogen-Life Technologies). Hoechst 33342 tinte se añadió a una concentración final de 5 mg /ml en presencia o ausencia de verepamil (50 mmol /L; Sigma) y se incubaron las células a 37 ° C durante 90 min con agitación intermitente. Al final de la incubación, las células se lavaron con HBSS enfriado con hielo (Invitrogen-Life Technologies), se centrifugaron hacia abajo a 4 ° C, y se resuspendieron en HBSS enfriado con hielo. El yoduro de propidio (Sigma) a una concentración final de 2 mg /ml se añadió a las células a las células viables de la puerta. Las preparaciones de células se filtraron a través de un filtro de células de 40 micras para obtener una suspensión de células individuales. citometría de flujo análisis y la clasificación se realiza en un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS, Beckman Coulter Epopeyas Altra).
experimentos implantación de células tumorales
FACS-purifican células H460 SP y no SP se mixted con Matrigel (Becton Dickinson), y a continuación, por vía subcutánea (sc) se inyectan en ratones NOD /SCID. Grupos de ratones se inocularon con células SP o las células no SP en 5 × 10
3, 5 × 10
4 y 1 × 10
5, respectivamente. El crecimiento tumoral se controló semanalmente y los volúmenes tumorales individuales se midieron usando un calibrador digital y aproximada de acuerdo con la fórmula V = 1 /2ab
2 (a ser el diámetro largo y el diámetro corto b del tumor). Al final de los experimentos, los ratones se sacrificaron después de 4 semanas y los tumores cosechadas, medidos y fotografiados. Los órganos internos como el pulmón e hígado fueron observados cuidadosamente nódulos de metástasis y el tumor secciones se examinaron bajo el microscopio. Por último, los tumores también fueron digeridos para hacer la suspensión de una sola célula de SP reanálisis.
ensayos de formación de Esfera en cultivos sin suero
Las células SP-SP y no se cultivaron en suero libre de DMEM-F12 (Tecnologías Invitrogen-Life), suplementado con 20 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 10 ng /ml de base factor de crecimiento fibroblástico (bFGF), 5 mg /ml de insulina (todos de Sigma). Las células (1000 /pocillo) se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos en 200 l de medio de crecimiento y 20 l de medio por pocillo se añadieron cada 2 días. se evaluó para cada pozo después de 5 días de cultivo
RT-PCR análisis
Las células fueron cosechadas y ARN total fue extraído y se prepararon para RT-; el número de esferas (150 micras Φ & gt). PCR mediante el uso de un Kit PrimeScript ™ RT-PCR (Takara, Kyoto, Japón). Los parámetros del ciclo para ABCG2, SMO, y GAPDH ADNc fueron de 30 segundos a 94 ° C, 30 seg a 58 ° C (para ABCG2 y GAPDH) o 55 ° C (para SMO), y 45 seg a 72 ° C durante 35 ciclos, respectivamente. Los cebadores para la RT-PCR fueron las siguientes: ABCG2 (F) 5'-CACCTTATTGGCCTCAGGAA-3 ', ABCG2 (R) 5' CCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3 ', SMO (F) 5'-TTACCTTCAGCTGCCACTTCTACG-3', SMO (R) 5'-GCCTTGGCAATCATCTTGCTCTTC-3 ', GAPDH (F) 5'-ACGACCACTTTGTCAAGCTC-3', y GAPDH (R) 5'-GGTCTACATGGCAACTGTGA-3 '.
Ensayo de proliferación celular
La proliferación celular los ensayos se realizaron usando el Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japón). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 5 x 10
4 células por pocillo y se cultivaron en el medio de crecimiento. se añadieron ciclopamina y tomatidina (todos de Sigma), respectivamente, a una concentración de 20 mol /L y se añadió medio de crecimiento apropiado en muestras de control. Se añadió CCK-8 en cada pocillo a 24, 48, 72 y 96 h, y, después de un adicional de cultura 4-h, se determinó la absorbancia de cada pocillo y se representó gráficamente la curva de crecimiento. Los perfiles del ciclo celular se analizaron mediante citometría de flujo.
El análisis estadístico
Los datos generalmente se presentan como media ± SD y diferencias estadísticas entre los grupos experimentales se analizaron mediante Estudiante de
t
test, ANOVA de una vía, o la regresión lineal utilizando SPSS11.5 software estadístico y de acuerdo con la naturaleza de los datos analizados. Un
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo en todos los casos
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos con el Dr. Zhang Guoping (de los Institutos de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Fudan, Shanghai, china) para obtener ayuda con las mediciones de citometría de flujo.