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PLOS ONE: La activación coordinada de Candidato Protooncogenes y el cáncer de testículos antígenos a través de promotor desmetilación en cáncer de cabeza y cuello y pulmón Cancer

2015/3/2


Extracto

Antecedentes

Alteraciones epigenéticas han sido implicados en la patogénesis de los tumores sólidos, sin embargo, se ha informado de forma esporádica proto-oncogenes activados por el promotor desmetilación. Se utilizó un método de integración para analizar la expresión de la cabeza y el cuello primaria carcinoma de células escamosas (HNSCC) y líneas celulares farmacológicamente desmetilado para identificar de manera aberrante desmetilado y expresamos candidatos proto-oncogenes y cáncer de testículos antígenos en CECC.

Metodología /Principales hallazgos

Hemos observado coordinamos desmetilación del promotor y la regulación positiva de la transcripción simultánea de candidatos proto-oncogén promotor con homología, y la huella filogenética de estos promotores demostraron sitios de reconocimiento potenciales para el factor de transcripción BORIS. La expresión aberrante BORIS correlaciona con la regulación positiva de candidatos proto-oncogenes en tumores malignos humanos incluyendo múltiples no pequeñas de cáncer de pulmón de células primarias y CECC, indujo coordinada proto-oncogén promotor específico de desmetilación y la expresión en células no tumorigénicas, y transforma las células NIH3T3.

Conclusiones /Importancia

coordinado, desenmascaramiento epigenética de múltiples genes con actividad promotora del crecimiento se produce en el cáncer aerodigestivo, y BORIS está implicada en la coordinada desmetilación promotor y reactivación de genes silenciados epigenetically en cánceres humanos.

Visto: Smith IM, CA Glazer, Mithani SK, Ochs MF, Sun W, S Bhan, et al. (2009) Coordinado La activación del Candidato Protooncogenes y el cáncer de testículos antígenos a través de promotor desmetilación en cáncer de cabeza y cuello y cáncer de pulmón. PLoS ONE 4 (3): e4961. doi: 10.1371 /journal.pone.0004961

Editor: José Najbauer, City of Hope Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 5 de octubre de 2008; Aceptó 3 de febrero de 2009; Publicado: 23 Marzo, 2009

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la declaración Creative Commons Public Domain que estipula que, una vez colocado en el dominio público, este trabajo puede ser libremente reproducido, distribuido, transmitirse, modificarse, construida sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona con cualquier objeto lícito

Financiación:. NIH subvención T32, Premio clínica innovador del asistente de vuelo Instituto de Investigación médica, y la espora Instituto Nacional del cáncer (5P50CA096784-05 ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

alteraciones epigenéticas en la metilación del promotor y la acetilación de histonas se han asociado con el cáncer específicos de las diferencias de expresión en tumores malignos humanos.

la metilación se ha considerado principalmente como un mecanismo de inactivación de genes supresores de tumores (TSG), y completa de perfiles de todo el genoma se acerca a múltiples ETG putativos nuevo promotor hipermetilación han identificado silenciados por hipermetilación del promotor.

la evidencia indirecta apoya un papel para
hipo
metilación en el desarrollo de tumores. hipometilación genómica Global ha informado en los tumores sólidos casi todos [1] - [3]. Los ratones con una interrupción funcional de ADN metiltransferasa 1 (
DNMT1
) función de demostrar la hipometilación genómica significativa en todos los tejidos y el desarrollo de linfomas de células T agresivas con inestabilidad cromosómica [4]. En los tumores sólidos humanos, meta-análisis muestra una correlación general entre la hipometilación global y estadio tumoral avanzado [3].

Hasta la fecha, se han reportado sólo ejemplos esporádicos de promotor hipometilación asociadas con la expresión de oncogenes desenmascarado putativos, incluyendo :
R-Ras
en el cáncer gástrico [5],
c-Neu Hoteles en modelos de ratones transgénicos [6], el
Hox11
proto-oncogen en la leucemia [7] ,
hipometiladores BCL-2
de genes y expresión de alto nivel en los linfomas de células B linfocítica crónica [8], desmetilación en MMTV /N-RASn ratones transgénicos [9], y rara activación de dos
RAS miembros de la familia
en el cáncer de colon y el cáncer de pulmón de células pequeñas [10]. Estas observaciones demuestran que los proto-oncogenes con la expresión específica de tejido, es decir o restringido su desarrollo, durante el crecimiento temprano, la diferenciación o la gametogénesis-puede ser inapropiada re-expresa en cánceres a través de la alteración epigenética, incluyendo desmetilación.

CECC es útil como un sistema de modelo de tumor sólido, debido a la función establecida de cambios epigenéticos en su patogénesis [11], así como la disponibilidad de líneas de células normales, mínimamente transformadas para su uso en las estrategias de descubrimiento de genes [12]. El uso de desmetilación farmacológico en condiciones normales, mínimamente transformado líneas celulares de queratinocitos orales combinados con cáncer de valores atípicos Perfil Análisis (COPA) en los tejidos primarios como un enfoque de descubrimiento, hemos sido capaces de definir un conjunto de candidatos proto-oncogenes que se someten a desmetilación aberrante y una mayor expresión en tumores humanos primarios.

Los datos funcionales y observaciones publicadas anteriores sugieren que la expresión de estos genes se asocia con el desarrollo de tumores. Los análisis adicionales demostraron promotor de homología y la regulación al alza coordinada en los tumores individuales para subconjuntos de estos genes diana (proto-oncogenes). Hemos sido capaces de ampliar estas observaciones a una variedad de tipos de tumores sólidos e implicar un factor de transcripción clave, BORIS, en la activación epigenética coordinada de los proto-oncogenes. Estos datos indican que la desmetilación aberrante de múltiples fisiológicamente, reprimidos proto-oncogenes se produce de una manera coordinada en los tumores individuales de varios tipos de tumores sólidos.

Resultados

Integrativa descubrimiento de los genes epigenetically Unmasked en HNSCC

La hipótesis de que las líneas de células normales contienen genes metilados que típicamente son reprimidos en los tejidos normales, pero que estos genes pueden ser re-expresados ​​por la manipulación farmacológica. Un subconjunto de estos genes incluiría candidatos proto-oncogenes activados por desmetilación en los cánceres humanos que podrían ser seleccionados más sobre la base de análisis de matriz de expresión del tumor primario utilizando métodos de integración. Elegimos para adaptar los métodos anteriores de detección epigenética usando 5-aza tratamiento /TSA que se han encontrado para tener éxito en la definición de los genes supresores de tumores candidato. Dos líneas celulares de queratinocitos orales normales TERT transformadas fueron tratados con 5 desoxicitidina M 5-aza durante cuatro días y tricostatina A para un día antes de la cosecha total de ARN para el análisis de expresión gama utilizando dChip [12], [13].

al mismo tiempo, se les practicó un enfoque epigenético comparativa utilizando cáncer de valores atípicos Análisis de perfiles (COPA), utilizando 49 CECC primaria y 19 tejidos de las mucosas normales ensayadas para la expresión de ARNm en la plataforma de microarrays de expresión Affymetrix U133A ARNm (16.383 conjuntos de sondas) compilado a partir de un trabajo previo y pública fuentes de expresión (oncomine.org). COPA es particularmente útil para determinar las diferencias en la expresión de genes particulares en subconjuntos de muestras de tumores primarios, con un rendimiento mejorado en comparación con herramientas estadísticas que se basan en la diferencia mediana de expresión o media entre dos conjuntos de datos [14]. Se calculó la COPA en la 90
percentil para nuestros clasificación final de los 16.383 características de las matrices, ya que esto dio lugar a las diferencias más pronunciadas en la expresión con nuestro tamaño de la muestra. La significación estadística de las diferencias de expresión en los diagramas de la COPA se midieron por Mann-Whitney U test (Figura 1B)
.
(a) Inicialmente, las líneas celulares transformadas mínimamente fueron tratados con 5-aza-desoxicitidina y TSA de desenmascarar los genes silenciados epigenetically. Con el fin de correlacionar desenmascaramiento epigenética con genes específicos de cáncer upregulated significativas, se realizó un enfoque epigenético comparativo con valores atípicos análisis para la descripción del Cáncer (COPA), utilizando 49 y 19 tumores de tejidos normales que se habían caracterizado en la plataforma de microarrays de expresión Affymetrix U133A ARNm. Los genes (por probeset) se clasificaron por primera vez por grado de regulación Upfold con el tratamiento con 5-aza /TSA y en segundo lugar por la regulación positiva de la COPA en la 90
percentil. El producto de estas filas se utiliza para clasificar todos los objetivos y se eligió un umbral de significación (α = 0,005), resultando en 106 genes de los cuales se evaluaron los 26 mejores genes. Con el fin de no excluir los genes fuera de la plataforma U133A, también se consideraron todos los otros genes en el U133 Plus 2.0 plataforma sobre la única base de la regulación Upfold /TSA 5-aza. Los genes fueron seleccionados posteriormente por la presencia de islas CpG utilizando MethPrimer y todos los genes fueron validados mediante la secuenciación de bisulfito de tejidos tumorales y normales, y QRT-PCR de las líneas celulares y tumores primarios. De los objetivos de integración 7/26 pasaron nuestra validación, mientras que 2/46 de los objetivos no pasó integradoras. experimentos funcionales A continuación se llevaron a cabo en estos genes. (B) el gráfico COPA Representante de
MAGEA3
demostrar el enfoque estadístico para encontrar candidatos oncogenes sobreexpresados. Diferencia en el tumor (n = 49) frente a la normal (n = 19) fue significativa expresión, valor de p & lt; 0,001 medido mediante la prueba de Mann-Whitney. (C) El promotor desmetilación hace que la regulación positiva de la transcripción. Upregulation después del tratamiento con 5-aza /TSA se muestra en líneas de células, medida por QRT-PCR. La relación de 5-aza /TSA tratada expresión de línea de base se muestra para
C19ORF28
,
H19
,
TKLT1
,
GPR17
,
GRIN1
,
MAGEA2
,
MAGEA3 /6
,
MAGEA4
,
MAGEA11
. Cada gen demostró la regulación positiva significativa por tratamiento con 5-aza /TSA en al menos una línea celular. Las barras de error muestran SE

Se determinó filas de genes de dos maneras:. 1) Puntuación COPA en la 90
percentil de la regulación positiva en el tejido tumoral primaria frente a la expresión de tejido normal y 2) la regulación después de Upfold desmetilación farmacológica después de la normalización dChip en líneas celulares.

Un rango de productos de integración se calculó (Figura 1A). El uso de un umbral de significación (α = 0,005) y la permutación aleatoria posterior de nuestros rangos de las listas, se identificaron 106 genes que se upregulated significativamente diferente basado en la detección epigenético y la expresión de microarrays de tejidos (Tabla S1). Nosotros seleccionamos empíricamente el marcador superior 26 genes para otros análisis. Diecisiete de 26 genes que contienen las islas CpG promotoras asociadas a la utilización de software MethPrimer se seleccionaron para estudios adicionales [15].

En un análisis paralelo separado para tener en cuenta posibles proto-oncogenes activados no incluidos en la plataforma U133A, nos 32.500 genes analizados en la plataforma U133plus2 clasificados sobre la única base de la regulación Upfold /TSA 5-aza en nuestras líneas celulares normalizadas que no fueron incluidos en el análisis de expresión serie de tumor primario. Se identificaron 46 genes diana con & gt;. La regulación al alza de 2 veces en el intervalo de confianza del 90% y un promedio de expresión valor de diferencia respecto al valor basal superior a 50. Entre estos, 30 fueron confirmados tener islas CpG (Tabla S2)

validación de un tumor específico desmetilación del promotor de los genes diana

islas CpG en la región promotora de los 47 objetivos de genes seleccionados con islas CpG se secuenciaron bisulfito en muestras normales de la mucosa de pacientes sin un diagnóstico de cáncer para confirmar el silenciamiento epigenético en la parte superior madura mucosa del tracto aerodigestivo (cuadros S1 & amp; S2). Sólo 18/47 regiones promotoras demostraron metilación completa en todos los sitios CpG secuenciados en todos los tejidos normales. Estos objetivos fueron posteriormente bisulfito secuenciados en 10 HNSCC primaria a ensayo para la presencia de la hipometilación. (Figura 2A). De estos objetivos, 9/18 mostraron desmetilación (véase la Tabla 1) en los tejidos tumorales en mayor que 30% de las muestras, incluyendo
TKTL1
(4/10, p & lt; 0,05),
H19
(6/10, p & lt; 0,05),
MAGEA2 gratis (5/10, p & lt; 0,05),
MAGEA3 /6 gratis (5/10, p & lt; 0,05),
MAGEA4 gratis (5/10, p & lt; 0,05),
MAGEA11 gratis (5/10, p & lt; 0,05),
GPR17 gratis (3/10, p & lt; 0,10),
GRIN1 gratis (6/10, p & lt; 0,05),
C19ORF28 gratis (5/10, p & lt; 0,05), (ji cuadrado). Para confirmar la regulación positiva de la transcripción de genes diana con 5-aza tratamiento /TSA en nuestro sistema de línea celular (visto en la Figura S1), se realizó la RT-PCR cuantitativa en 5-aza células normales /tratados con TSA comparación con las células tratados de forma simulada para estos nueve genes (Figura 1C). Cada gen demostró la regulación positiva significativa por tratamiento con 5-aza /TSA en al menos una línea de células de soporte de la regulación del gen funcional por el promotor de la hipometilación. El uso de la cohorte inicial de 10 tumores primarios, se realizó un análisis preliminar para determinar la relación de promotor hipometilación de expresión. expresión QRT-PCR con la secuenciación de bisulfito del promotor respectivo por debajo se muestra en la Figura 2b-j. Se empleó la prueba de Mann-Whitney para comparar la expresión de QRT-PCR de los grupos metilados y no metilados. Tres genes tenían una mayor expresión estadísticamente significativa en el grupo no metilado:
MAGEA2 gratis (p = 0,007),
MAGEA3 /6 gratis (p = 0,007),
MAGEA11 gratis (p = 0,05). También se sugirieron posibles asociaciones entre la expresión y el estado de metilación en esta pequeña cohorte de
TKTL1 gratis (p = 0,06),
MAGEA4 gratis (p = 0,09),
C19ORF28 gratis ( p = 0,09),
GRIN1 gratis (p = 0,06), sin embargo,
H19 gratis (p = 0,7), pero
GPR17 gratis (p = 0,38) no mostraron esta asociación.

(a) se muestran los resultados de la secuenciación de bisulfito en 10 tumores y 10 para las normales:
TKTL1 gratis (4/10, p & lt; 0,05),
H19 gratis (6 /10, p & lt; 0,05),
MAGEA2 gratis (5/10, p & lt; 0,05),
MAGEA3 /6 gratis (5/10, p & lt; 0,05),
MAGEA4
(5/10, p & lt; 0,05),
MAGEA11 gratis (5/10, p & lt; 0,05),
GPR17 gratis (3/10, p & lt; 0,10),
GRIN1
(6/10, p & lt; 0,05),
C19ORF28 gratis (5/10, p & lt; 0,05). (B-j) la expresión QRT-PCR con la secuenciación de bisulfito del promotor respectiva a continuación (el blanco es no metilado, gris está metilado). La significación se mide por comparación de la expresión de metilado para no metilado mediante la prueba de Mann-Whitney. La significación se encuentra en MAGEA2 (p = 0,007), MAGEA3 /6 (p = 0,007), MAGEA11 (p = 0,05). También se encontraron fuertes asociaciones entre la expresión y el estado de metilación del promotor de TKTL1 (p = 0,06), MAGEA4 (p = 0,09), C19ORF28 (p = 0,09), GRIN1 (p = 0,06). H19 (p = 0,7) y GPR17 (p = 0,38) no mostraron asociaciones entre la secuenciación de bisulfito y la expresión en esta cohorte. Las barras de error representan el error estándar.

Validación funcional de genes candidatos

A continuación, realizaron transfecciones transitorias para evaluar y /o confirmar los efectos estimulantes del crecimiento de estos nueve objetivos que muestran -tumor específico promotor hipometilación. Aunque H19 codifica un transcrito de ARN no traducido, el producto H19 parece inducir el crecimiento en líneas celulares de cáncer de pulmón y de mama [16] y puede inducir la resistencia a los medicamentos en el carcinoma hepatocelular [17]. La Figura 3A muestra los resultados obtenidos por transfección transitoria de un
H19
construir en células OKF6-terc-1R. A los cuatro días, hubo un aumento del 41,4% (± 15%) en crecimiento en el vector vacío transfectadas. La familia MAGE consiste en miembros de la familia relacionados que se sabe que están upregulated en una variedad de tipos de tumores [18], pero recientemente han sido implicados en la inducción de reprogramación transcripcional en células tumorales [19].
MAGEA2
indujo un aumento 72,7% (± 26%) en el crecimiento a las tres día (la Figura 3B).
MAGEA4
transfección indujo un aumento de 203% (± 17%) en el crecimiento (Figura 3D). Se probaron las diferencias de crecimiento funcionales, pero no encontraron a
C19ORF28
.

(a) La transfección transitoria de un
H19
construir en células OKF6-terc-1R (en el día 4 , 41,4% ± aumento crecimiento del 15%). (B) La transfección transitoria de un
MAGEA2
construir en células OKF6-terc-1R (en el día 3, el 72,7% ± 26% de aumento del crecimiento). (C) La transfección transitoria de un
TKTL1
construir en células OKF6-terc-1R (en el día 4, el 50,1% ± 38% de aumento del crecimiento). (D) La transfección transitoria de
MAGEA4
construir en células OKF6-terc-1R (en el día 4, 203% ± 17% de aumento del crecimiento). Para (e) se desarrolló un ensayo cuantitativo para la medición de los promotores no metilados, denominado cuantitativa de no metilación específica de PCR (QUMSP). QUMSP porcentaje de
C19ORF28
,
GRIN1
,
H19
,
MAGEA11
,
MAGEA2
,
MAGEA3 /6
,
GPR17
, y
TKTL1
se llevó a cabo en una cohorte independiente de pacientes con cáncer de cabeza y cuello utilizando 25 tumores y 11 muestras mucosas aerodigestivo superior a promotor de ensayo de desmetilación. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas en
GRIN1
,
MAGEA11
,
MAGEA2
. Siguiente promotor desmetilación fue considerado como una causa de la expresión del ARNm aumentos observados en el conjunto de datos Expo. (F) muestra los resultados QUMSP para una cohorte independiente de 14 normales de pulmón y 13 pacientes con tumor de pulmón. No se encontraron diferencias significativas en QUMSP en
H19
,
MAGEA11
,
MAGEA2
, y
MAGEA3 /6
.

en la Figura 3C,
TKTL1
indujo un aumento del 50,1% (± 38%) en el crecimiento en cuatro días. Aumento de expresión de TKTL1 ha sido recientemente implicada en la conversión de las células para el metabolismo aeróbico, glicolítica, así como aumento de la proliferación en células de cáncer de colon [20] - [25]. TKTL1 se asoció independientemente con una baja supervivencia en el carcinoma de laringe, cáncer de colon y uroteliales, así como metástasis a distancia en el carcinoma de ovario [22], [23], [26] Para confirmar aún más TKTL1 como candidato proto-oncogén en HNSCC, se realizó Los ensayos de colonias de enfoque adherentes en TKTL1 bajos líneas celulares que expresan CECC JHU-011 y JHU-028, y se encontró aumento significativo crecimiento en ambas líneas celulares (Figura 4 a, B). A continuación, empleada shRNA construcciones en una línea celular de alta expresión de TKTL1 UM-22B en ensayos de crecimiento de anclaje independiente, y observó una disminución notable en el tamaño y el número de colonias (Figura 4 C, D) en comparación con las células transfectadas burlarse.

(a) TKTL1 sobreexpresión forzada a través de la transfección transitoria en el fondo bajo las células que expresan JHU-011 induce el aumento de la formación de colonias dependiente de anclaje y (b) TKTL1 shRNA en la línea celular de alta expresión de FaDu induce inhibición del crecimiento. crecimiento independiente (c) Anchorage de células UM-22B es significativamente inhibida por TKTL1 shRNA (d), con la disminución de tamaño de las colonias. (* = P & lt; 0,01, ** = p & lt; 0,001, chi cuadrado).

Candidato expresión proto-oncogén y promotor desmetilación en otros tipos de cáncer humano

Para determinar si el candidato expresión proto-oncogén fue alterada en una gama más amplia de tipos de tumores, analizamos la expresión de datos disponibles a través de los conjuntos de datos para la Expo 1041 tumores humanos de todas las histologías [27]. Datos era mediana de expresión normalizado por cada matriz y posteriormente por la mediana de la normalización por el conjunto de características de la sonda a través de los 1041 tumores de muchos tipos de cáncer incluyendo cáncer de pulmón y urotelial, pero no CECC. Elegimos un subconjunto de estos tumores, el cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM), linfoma, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, y cáncer urotelial, para su presentación (Figura 5A-D).
H19
se reguló de manera significativa en el CPNM (p = 0,008) y en el cáncer urotelial (p = 0,0013), según los cálculos de la prueba de Mann-Whitney comparando expresión de matriz normalizada en el tipo de tumor a todos los otros tumores. Hemos registrado un aumento significativamente la expresión de MAGEA2 en CPNM (p = 0,005), pero no en los cánceres uroteliales (p = 0,18).
TKTL1
también mostraron sobreexpresión en NSCLC (p = 0,05), pero no el cáncer urotelial (p = 0,55), y
MAGEA4
se sobreexpresa en el CPNM (p = 0,04), pero no de manera significativa en el cáncer urotelial (p = 0,12). Con el fin de confirmar la desmetilación específica de la diana observado en tumores primarios, ideamos un ensayo rápido, cuantitativo para medir específicamente los promotores no metilado, que hemos llamado cuantitativo de no metilación específica de PCR (QUMSP). Veinticinco tumores HNSCC y 11 muestras mucosas aerodigestivo superior se analizaron para determinar el promotor desmetilación (Figura 3E). desmetilación específica de tumor se encuentra en
GRIN1 gratis (p = 0,005),
MAGEA11 gratis (p = 0,001), y
MAGEA2 gratis (p = 0,002). Se realizó un análisis similar utilizando una cohorte separada, independiente de 13 muestras de NSCLC con 14 muestras de pulmón de pacientes sin enfermedad neoplásica y confirmó promotor hipometilación de genes diana. Las diferencias significativas en
H19 gratis (p = 0,02),
MAGEA11 gratis (p = 0,03),
MAGEA2 gratis (p = 0,005) y
MAGEA3 /6 gratis (p = 0,02). Ver Figura 3F.

El repositorio Expo conjunto de datos se extraía para la expresión génica tejido tumoral medida por la plataforma de expresión del ARNm de 2,0 Affymetrix U133 Plus. Inicialmente datos fue la mediana normalizado por la matriz de expresión y cada gen era medio normalizado para esta figura. Solamente se muestran los subconjuntos de células no pequeñas de cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, cáncer de páncreas y cáncer urotelial. (A) muestra la expresión de
H19
en estos tipos de cáncer. (B)
MAGEA2
expresión, (c)
TKTL1
expresión, y (d)
MAGEA4
. La significación estadística se midió en cada tipo de tumor mediante la comparación de la expresión del gen en el tipo de tumor a la expresión en todos los restantes 1041 muestras. Los tipos de tumores sin los valores de p no se acercaron a la significación estadística. Pulmón y urotelial mostraron significativa superposición de expresión.

La expresión aberrante de los candidatos proto-oncogenes se produce de una manera coordinada en los tumores primarios individuales

Durante estos análisis, se observó rápidamente que la regulación positiva de la transcripción a través promotor hipometilación tendía a ocurrir sincrónica en un subconjunto de tumores. En nuestra cohorte de 49 CECC primaria ensayó mediante análisis de expresión gama, se construyó una matriz de coeficientes de correlación de Pearson entre los niveles de expresión de cada objetivo (Figura 6A). Para nuestros nueve genes diana, la agrupación significativa de aumento de la expresión se observó dentro de la familia de los genes MAGEA. H19 no se incluyó debido a su ausencia en la plataforma U133A. Un grupo aparte de la sobreexpresión asociado se destacó por
TKTL1
,
GRIN1
, y
GPR17
. A partir de los datos de expresión de NSCLC derivados de los conjuntos de datos Expo creamos matrices similares para examinar las correlaciones entre los genes individuales. Hemos observado que la expresión de la familia MAGEA y
H19
expresión mostró correlaciones altamente significativas en persona NSCLC (ver Figura 6B). En contraste, no hubo correlaciones objetivo diana para la expresión NSCLC del otro grupo (
TKTL1
,
GRIN1
, y
GPR17
) que exhibió expresión coordinada en el CECC.

(a) muestra la correlación de expresión matriz de p-valor gen para la coexpresión para cada par de genes a través de todos los tumores. Esta comparación muestra la correlación de cada par de genes en 49 tumores de cabeza y cuello. (B) la matriz de correlación de expresión de genes par valor de p para 80 NSCLC. Es de destacar que no es de baldosas C19ORF28 en esta plataforma matriz. (C) Análisis de las regiones promotoras de los genes. Se muestra una phylogram de nuestros promotores de interés basados ​​en el análisis después de ClustalW alineación de secuencias múltiples. La región de homología significativa se muestra después de la alineación de secuencias y E estadísticas de comparación PromoterWise del EMBL-EBI. (D) El promotor hipometilación (QUMSP) matriz de correlación de p-valor para el CECC (25 tumores). (E) Promotor hipometilación (QUMSP) matriz de correlación de p-valor para el NSCLC (13 tumores).

Los patrones de expresión se correlacionan con el promotor de homología de los genes diana promotor demethylated

A continuación, queríamos determinar si el promotor de homología se asoció con la expresión enlazada de los dos grupos proto-oncogén. posteriormente Utilizamos herramienta ClustalW del Instituto Europeo de Bioinformática (Figura 6C) para el análisis phylogram después de alineación de secuencias múltiples de los respectivos promotores. Para confirmar homología cuantitativamente, se utilizó la herramienta de comparación PromoterWise del EMBL-EBI, que encontró significativas por pares áreas de promotor de homología en
GPR17
,
GRIN1
, y
TKTL1
. Como era de esperar a partir de estudios anteriores, la familia MAGE-A agrupan, como el MAGE-A miembros de la familia y H19 se sabe que tienen sitios de unión de consenso para factores de unión sensibles a la metilación
CTCF
y
CTCFL
/
BORIS
. Además, este segundo grupo de
GRIN1
,
GPR17
, y
TKTL1
agrupados por homología de secuencia.

Por último, quería ver si el grado de promotor hipometilación se correlacionó en los tumores individuales. Por tanto CECC primaria (Figura 6D) y NSCLC (Figura 6E), se encontraron varias correlaciones significativas entre el estado de metilación entre objetivos, pero el estado de metilación no se agrupan en grupos definidos por el-A MAGE expresión grupo familiar /H19 o por el
TKTL1
,
GRIN1
,
GPR17
clúster. Por el contrario, hubo correlaciones significativas entre todos los candidatos proto-oncogenes identificados. La hipometilación, por lo tanto, parece ocurrir de una manera relacionada en los tumores individuales para todos los genes diana, pero la expresión simultánea de los genes dentro de los dos grupos se asoció con el promotor de homología en lugar de estado de metilación. Esto implicaba que los factores de transcripción específicos pueden estar involucrados en la regulación de desenmascaramiento epigenética y /o activación transcripcional basado en promotor de la homología entre estos candidatos proto-oncogenes.

expresión BORIS se asocia con la activación de proto-oncogén en tumores primarios, induce el promotor desmetilación, la expresión proto-oncogén candidato, y la transformación de células

La presencia obvia de varios genes MAGE entre nuestros objetivos nos llevó a estudiar las vías de regulación aguas arriba de los antígenos de cáncer de testículo conocidos. BORIS y CTCF son un par análogo único de factores de transcripción implicados en la regulación epigenética que comparten un dominio de unión a ADN idéntico. BORIS es silenciada transcripcionalmente en la mayoría de los tejidos normales, pero expresada en normal embrionario, las células germinales y tejidos de cáncer. Se determinó si la expresión de BORIS correlacionada con el candidato expresión proto-oncogén en una cohorte independiente de 36 CECC primaria. Figura 7A presenta un mapa de calor construido a partir de la mediana normalizados, QRT-PCR datos de expresión de nuestros proto-oncogenes, ordenados por la expresión de BORIS. En estos 36 tipos de cáncer, BORIS sobreexpresión se correlacionó significativamente con la sobreexpresión de 6/9 proto-oncogenes, incluyendo:
MAGEA3 /6 gratis (p = 0,0017),
MAGEA4 gratis (p = 0,04),
MAGEA11 gratis (p & lt; 0,001),
GPR17 gratis (p = 0,01), y
C19ORF28 gratis (p = 0,001). Para examinar aún más la correlación de la expresión de BORIS con nuestros genes diana en cánceres sólidos, se analizaron los datos Expo 1041 conjunto de datos para los tumores humanos de una amplia variedad de fuentes de tejidos y histologías. Se observó correlación positiva significativa de la expresión de BORIS con la expresión de cada uno de nuestros nueve proto-oncogenes:
GRIN1 gratis (p & lt; 0,001),
C19ORF28 gratis (p & lt; 0,001),
H19
(p & lt; 0,001),
MAGEA11 gratis (p & lt; 0,001),
MAGEA2 gratis (p & lt; 0,001),
MAGEA3 /6 gratis (p = 0,003),
MAGE4 gratis (p & lt; 0,001),
TKTL1 gratis (p & lt; 0,001),
GPR17 gratis (p & lt; 0,001), (Figura S2). Aunque transcripciones BORIS son por lo general no detectable en las células normales, se determinó que 59% de todos los tumores tienen un nivel de BORIS que supera la mediana de expresión de todos los genes, y 90% de los tumores tienen un nivel de & gt expresión BORIS; 25% del valor de la expresión mediana para todos los genes, lo que indica que la expresión aberrante BORIS es un evento común en el cáncer humano
.
(a)
BORIS
expresión se correlaciona con la expresión de los genes diana en el CECC (QRT-PR) mapa de calor (Pearson correlación) (b) la transfección transitoria de
BORIS
construir en líneas celulares OKF6-Tert1R NIH-3T3 y.
BORIS
sobreexpresión resultó en un aumento del crecimiento celular en la línea celular 3T3 (en el día 3, el 77% ± 34% de aumento del crecimiento) y en la línea celular OKF6-Tert1R (en el día 3, 161% de crecimiento ± 78% incrementar). El crecimiento celular sobre la línea base se calcula dividiendo los valores de la señal de calceína día 1. crecimiento independiente (c) Anchorage se ensayó después de la transfección con el vector vacío (EV), CTCF, y BORIS a diversas concentraciones de doxiciclina, con colonia representativa (abajo). (D) QUMSP de nueve dianas de interés después de la transfección con el vector vacío (sin tratar) y BORIS constructo (tratada) en presencia de 0,0625 g /ml de doxiciclina. (E) Las veces de aumento Quantitiative RT-PCR de nueve dianas de interés después de la transfección BORIS normalizado a los valores después de la transfección con el vector vacío.

Para explorar los efectos funcionales y epigenéticos de BORIS, tetraciclina inducible pBIG2i-BORIS las construcciones se transfectaron transitoriamente en las líneas de células NIH-3T3 y OKF6-Tert1R en presencia de doxiciclina, que resulta en un aumento del crecimiento de células adherentes en el tipo salvaje, BORIS que no expresa NIH3T3, y líneas celulares OKF6-Tert1R. 3T3 tuvieron un aumento de crecimiento del 77% ± 34% en el día tres. OKF6 líneas celulares tenían un aumento del crecimiento de 161% ± 78% a los tres días (del Figura 7B). Es importante destacar que estos efectos se observaron cuando los niveles de
BORIS
expresión se regula para que sea similar a los niveles encontrados en los tumores primarios.

Este efecto no se observó con el aumento de las concentraciones de doxiciclina que indujeron niveles altos de
BORIS
transcripciones. Un análisis de las transcripciones mostró que la expresión de siete de los nueve genes diana fue significativamente mayor en las células que expresan OKF6-Tert1R BORIS (Figura 7E). Para probar si BORIS expresa en niveles bajos podría contribuir a la transformación, se estudiaron las células NIH3T3 para el crecimiento de anclaje independiente. Después de 12 días, se observaron un número significativo de colonias (30 +/- 3) en las pruebas de las células que expresan BORIS-pero no en células transfectadas con un plásmido de control (Figura 7C).

Finalmente, para probar la posibilidad que BORIS puede estar asociado con alteraciones epigenéticas, así como la regulación positiva de la transcripción de los genes diana, que cuantitativamente se ensayaron para el estado de metilación de nuestros candidatos proto-oncogenes después de BORIS transfección y señaló que seis de los nueve objetivos (C19 ORF28, GPR17, GRIN1, MAGEA2 , MAGEA3 /6, y MAge11) mostró un aumento de más del 100% en el promotor desmetilado tan pronto como 48 horas después de la inducción de BORIS (Figura 7D).

Discusión

Los datos presentados anteriormente indican que CECC y CPNM se someten a la activación de proto-oncogenes candidatos con desmetilación asociado de manera coordinada en los tumores individuales. Hemos sido capaces de demostrar los efectos de transformación asociada de BORIS ectópica expresó en líneas celulares de BORIS-negativas, así como los efectos del crecimiento con genes diana individuales que han demostrado ser activado y epigenetically expresada por BORIS. Sin embargo, esto no excluye la contribución de los genes aún no identificados a efectos relacionados BORIS o un efecto cooperativo entre los genes diana identificados.

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