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PLOS ONE: La activación de AMP-activated proteína quinasa por 3,3 'Diindolilmetano (DIM) se asocia con el cáncer de próstata humano muerte celular in vitro e in vivo


Extracto

Hay una gran cantidad de evidencia científica que sugiere que la 3,3'-Diindolilmetano (DIM), un compuesto derivado de la digestión de indol-3-carbinol, que es abundante en los vegetales crucíferos, alberga la actividad antitumoral
in vitro
y
in vivo
. La acumulación de pruebas sugiere que AMP-activated proteína quinasa (AMPK) juega un papel esencial en la homeostasis de la energía celular y el desarrollo de tumores y que la orientación AMPK puede ser una opción terapéutica prometedora para el tratamiento del cáncer en la clínica. Hemos informado anteriormente de que un DIM formulado (BR-DIM; en lo sucesivo como B-DIM) con una mayor biodisponibilidad fue capaz de inducir la apoptosis e inhibir el crecimiento celular, la angiogénesis y la invasión de las células del cáncer de próstata. Sin embargo, el mecanismo molecular preciso (s) para los efectos anticancerígenos de B-DIM no han sido completamente aclarada. En el presente estudio, se investigó si AMP-activated proteína quinasa (AMPK) es una diana molecular de B-DIM en células de cáncer de próstata humano. Nuestros resultados muestran, por primera vez, que B-DIM podría activar la vía de señalización de AMPK, asociado con la supresión de la diana mamífera de rapamicina (mTOR), la regulación por disminución de los receptores de andrógenos (AR) expresión, y la inducción de la apoptosis en tanto células de cáncer de próstata andrógeno C4-2B insensible a andrógenos LNCaP sensible y. B-DIM también activa la AMPK y regula a la baja la AR en xenoinjertos de tumores de próstata C4-2B independientes de andrógenos en ratones SCID. Estos resultados sugieren que B-DIM podría ser utilizado como un agente anti-cáncer de potencial en la clínica para la prevención y /o tratamiento de cáncer de próstata independientemente de la capacidad de respuesta de andrógenos, aunque puede ser necesaria AR funcional

Visto:. Chen D, S Banerjee, Cui QC, Kong D, Sarkar FH, Dou QP (2012) activación de la proteína quinasa activada por AMP por 3,3 'diindolilmetano (DIM) se asocia con la muerte de células cancerosas de próstata humano
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 7 (10): e47186. doi: 10.1371 /journal.pone.0047186

Editor: Libing Song, Sun Yat-sen Universidad del Centro del Cáncer, China

Recibido: 5 de Marzo, 2012; Aceptado: September 13, 2012; Publicado: 9 Octubre 2012

Copyright: © Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por becas de Karmanos Instituto del cáncer (a QPD) Instituto Nacional del cáncer (1R01CA120009, 3R01CA120009-04S1 y 5R01CA127258-05, a QPD). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

proteína quinasa activada por AMP (AMPK) se expresa en todas las células eucariotas y es una enzima fundamental que desempeña un papel esencial en la homeostasis de la energía celular, así como el control de procesos relacionados con el desarrollo de tumores, incluyendo la progresión del ciclo celular, célula proliferación, la síntesis de proteínas, y la supervivencia. Por lo tanto, como un objetivo anti-cáncer, AMPK ha recibido atención intensiva en los últimos años. AMPK de mamíferos es una proteína quinasa de serina /treonina trimérica compuesta de una subunidad catalítica α y dos subunidades reguladoras, β y γ. AMPK se activa a través de la fosforilación de Thr-172 en la subunidad α de un estrés de ozono de energía, como el aumento de las proporciones de AMP /ATP [1] y ADP /ATP [2], o estimulada por las quinasas celulares, incluyendo la quinasa de hígado B1 (LKB1 ) [3] - [4] y calmodulina dependiente de la proteína quinasa quinasa (CaMKK) [5]. Una vez activada, la AMPK desempeña dos funciones principales, metabólicos y no metabólicos. En la regulación de los procesos metabólicos, AMPK fosforila restos serina en muchas proteínas diana y los resultados en el cambio en las vías catabólicas para activar procesos de ATP de generación incluyendo la captación y oxidación de la glucosa y los ácidos grasos, y el apagado de las vías anabólicas incluyendo la proteína, graso de ácido y de colesterol síntesis, que consumen ATP [6]. En cuanto a las funciones no metabólicas de AMPK, la activación de AMPK puede inducir la detención del ciclo celular e inhibir la proliferación celular y la síntesis de proteínas en las células malignas a través de múltiples mecanismos tales como la acumulación del factor supresor de tumores p53 y la dependiente de ciclina inhibidores de la quinasa p21 y p27 [7 ], así como la baja regulación de la vía mTOR [8] - [9]. Una amplia investigación apoya el papel de la AMPK en la prevención y la terapéutica del cáncer, lo que sugiere que la orientación de la AMPK puede ser una opción prometedora para el tratamiento del cáncer.

A tal fin, la metformina, un fármaco antidiabético, se ha demostrado que activan la AMPK , levantando una hipótesis de que la metformina puede reducir el riesgo de cáncer en pacientes con diabetes tipo 2 a través de la activación de la vía de AMPK [10]. De hecho, los informes de los estudios clínicos han demostrado que los pacientes diabéticos tratados con metformina tuvieron una tasa significativamente menor de casos de cáncer y la mortalidad relacionada con el cáncer en comparación con los pacientes expuestos a otros medicamentos antidiabéticos [10] - [12]. Los estudios preclínicos también han demostrado que la metformina no sólo inhibe el crecimiento de células cancerosas cultivadas [13] -. [14] y tumores en ratones [15], pero también se dirige selectivamente a las células madre del cáncer [16]

Además de metformina, algunos compuestos naturales, incluyendo quercetina, genisteína [17], la capsaicina, EGCG [18], y la curcumina [19], se ha demostrado que tienen efectos contra el cáncer asociados con la activación de la vía de señalización de AMPK. De hecho, los productos naturales han sido la fuente más productiva de clientes potenciales para el desarrollo de fármacos contra el cáncer. De acuerdo con la literatura, aproximadamente el 73% de los medicamentos contra el cáncer fueron descubiertos a partir de orígenes naturales o derivados de compuestos naturales durante el último medio siglo [20]. El compuesto natural indol-3-carbinol (I3C), que se encuentra en niveles relativamente altos en las verduras crucíferas como el brócoli y la col, y su dímero 3,3, diindolylmetano (DIM) han demostrado actividad antitumoral
In Opiniones y vitro
in vivo
[21] - [22]. Recientemente, se informó de que un DIM formulado (BR-DIM, obtenido a partir de BioResponse nutrientes, LLC., Boulder, Colorado, de aquí en adelante abreviado como B-DIM), mostró aproximadamente un 50% mayor biodisponibilidad
in vivo
[23] en comparación con el DIM. B-DIM induce la apoptosis y la inhibe el crecimiento celular, la angiogénesis y la invasión de las células del cáncer de próstata, que se asocia con la regulación de Akt, NF-kappa B, VEGF y Ar vías de señalización [24] - [25]. Además, los resultados recientes han demostrado que el tratamiento B-DIM de las células del cáncer de próstata
in vitro o
-B DIM intervención en los pacientes con cáncer de próstata dado lugar a la exclusión nuclear de AR asociado con la activación de miR-34a [24 ]. Sin embargo, el mecanismo molecular preciso (s) por el cual B-DIM desempeña sus funciones contra el cáncer y preventivas de cáncer no han sido completamente aclarada; más específicamente, no se ha informado si la actividad biológica de B-DIM está relacionado con la inducción de la señalización de AMPK.

Por lo tanto, en el presente estudio, hemos investigado los efectos de la B-DIM en la señalización de AMPK y su abajo objetivos relacionados en ambos LNCaP andrógeno-sensibles y las células de cáncer de próstata andrógeno-C4-2B insensibles que contienen AR funcional. Nuestros resultados muestran, por primera vez, que B-DIM podría funcionar como un activador de AMPK. La activación de AMPK por B-DIM dio como resultado la baja regulación de la expresión del RA y el antígeno prostático específico (PSA), y causó la inducción de la apoptosis de las células, la supresión de la vía mTOR, e inhibición de la prostasphere formación en la próstata humana células cancerosas
in vitro
y
in vivo
. Nuestros resultados también demostraron que la vía de la AMPK es una de las dianas moleculares del B-DIM para sus efectos anti-cáncer contra el cáncer de próstata humano.

Métodos

Cultivo celular, extracción de proteínas, y Western Blot ensayo

humano C4-2B cáncer de próstata (obtenido del profesor Leland Chung, Universidad de Emory, Escuela de Medicina, Atlanta, GA; y en la actualidad en el Cedars-Sinai, de Los Ángeles, CA) y LNCaP (American Type Culture Collection Manassas, VA, EE.UU.) las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), 100 mg /ml de estreptomicina, 100 unidades /ml de penicilina y glutamina 2 mM, en un incubador humidificado con 5% de CO
2 y 95% de aire a 37 ° C. Un extracto de células enteras se preparó como se describe anteriormente [26]. Para el análisis de transferencia Western, una cantidad igual de proteína de cada extracto de células se sometió a electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirió a membranas de nitrocelulosa. membranas individuales se probaron con anticuerpos indicados. Las bandas inmunorreactivas se desarrollaron utilizando peroxidasa de rábano picante anticuerpos secundarios conjugados y SuperSignal WestPico sustrato quimioluminiscente (Pierce) y se visualizaron utilizando una película de rayos X.

Prostasphere ensayo de formación de

ensayo de formación de Prostasphere se realizó para evaluar la capacidad de cáncer de células madre auto-renovación siguiendo nuestro procedimiento publicado [27]. En pocas palabras, las suspensiones de células individuales de células C4-2B se suspendieron a fondo y se sembraron en ultra-adherentes pozos bajos de placas de 6 pocillos (Corning, Lowell, MA) a 1.000 células /pocillo en 1,5 ml de medio de formación de esferas (01:01 DMEM /F12 suplementado con 50 unidades /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina, B-27, y N-2). Un mililitro de medio de formación de esferas se añadió cada 3 días. Después de 6 días de incubación con diferentes concentraciones de B-DIM o metformina (como control), las esferas formadas se recogieron por centrifugación a 300 xg durante 5 minutos y los números fueron contados bajo un microscopio de contraste de fase invertida prostasphere. La proporción de células generando de esfera se calculó dividiendo el número de células sembradas por el número de prostaspheres.

Animales experimentales

Varón homocigotos CB-17 ratones SCID (4-5 semanas de edad) fueron adquiridos de Taconic Farms (Germantown, NY). Los ratones fueron alojados y mantenidos en condiciones estériles en instalaciones acreditadas por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care y de acuerdo con las regulaciones y normas del Departamento de Agricultura de EE.UU., Departamento de Salud y Servicios Humanos, y los NIH EE.UU. actuales. Los ratones fueron utilizados de acuerdo con Cuidado de Animales pautas de uso y de la Universidad Estatal de Wayne en virtud de un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Wayne State y Uso. Los ratones recibieron la dieta Lab 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN).

Hueso humano e implantación de células tumorales

tejido óseo del feto varón humano se obtuvo por una organización sin ánimo de lucro de terceros ( Advanced Bioscience Recursos, Alameda, CA), y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de la familia del donante, consistente con las regulaciones emitidas por cada estado involucrado y el gobierno federal. Después de una semana de aclimatación, los ratones se les implantó un fragmento de hueso fetal humano solo como se describe anteriormente [28] - [29]. células C4-2B se recogieron de cultivos subconfluentes después de una breve exposición a 0,25% de tripsina y 0,2% EDTA. La tripsinización se detuvo añadiendo un medio que contiene 10% de FBS. Las células se lavaron una vez en medio libre de suero y se resuspendieron. Sólo suspensiones que constan de una sola célula con & gt; 90% de viabilidad se usaron para las inyecciones. Las células (1 × 10
6) en 20 l a medio RPMI libre de suero fueron inyectados intraósea mediante la inserción de una aguja de calibre 27 y jeringa Hamilton a través de la piel de ratón directamente en la superficie ósea del hueso implantado previamente. En nuestra experiencia previa con este modelo, encontramos una tasa de captación tumoral de & gt; 95% en comparación con xenoinjerto de piel en el que la tasa de captación tumoral fue comparativamente menos con el periodo de latencia prolongado. Tan pronto como la mayoría de los implantes óseos comenzó a ampliar (que ahora se llama un "tumor óseo") como se determina por mediciones de la pinza (30a días después de la inyección de células de cáncer), los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en los siguientes grupos de tratamiento (n = 7): ( a) control sin tratar; (B) solamente B-DIM, 5 mg /día por vía oral ratones alimentados por sonda durante 4 semanas desde el inicio de la terapia. El volumen del tumor de hueso en cada grupo se determinó mediante mediciones de calibre dos veces por semana. También se midió el peso corporal de los ratones en cada grupo. Todos los ratones fueron sacrificados un día después de la última dosis del tratamiento B-DIM (5 semanas) debido a que grandes tumores se forman en los ratones de control, lo que requería la terminación, y se registraron el volumen y el peso corporal final del tumor. En la autopsia, el tumor estaba cuidadosamente extirpados, liberado de cualquier tejido adherente extraña, y parte del tejido se fijó en formalina y embebidos en parafina para inmunotinción y H & amp; E tinción para confirmar la presencia de tumor

Resultados.

B-DIM Activa señalización AMPK en células de cáncer de próstata humano

se evaluó si la vía de señalización de AMPK podría ser una de las dianas moleculares de B-DIM en tanto C4-2B andrógeno-insensible ( Fig. 1A) y células de cáncer de próstata sensibles a andrógenos LNCaP (Fig. 1B). Ambas líneas celulares se trataron con diferentes concentraciones de B-DIM durante 3 horas, y los lisados ​​celulares de las células tratadas se analizaron mediante transferencia de Western para medir los niveles de fósforo-AMPKα (T172), una forma activa de la proteína AMPK, así como algunas proteínas objetivo abajo. Los resultados mostraron que el nivel de fósforo-AMPKα en ambas líneas celulares de cáncer de próstata tratados con B-DIM aumentó de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1A, B). Como control, los niveles de proteína total AMPK se mantuvo relativamente sin cambios (Fig. 1A, B). Tanto la proteína reguladora asociada de mTOR (Raptor) y acetil-CoA carboxilasa (ACC) son sustratos aguas abajo directos de AMPK, como AMPK activado es capaz de fosforilar la proteína Raptor en residuo de serina 792 [8] y la proteína del CAC sobre residuo de serina 79 [30 ] - [31]. El tratamiento con B-DIM consecuencia un aumento de los niveles de fósforo-Raptor (S792) y de fósforo-ACC (S79) en las células tratadas (Fig. 1A, B), más el apoyo que B-DIM es un activador de AMPK. mTOR es una vía de señalización corriente abajo de AMPK, y la activación de AMPK puede inhibir la vía de señalización mTOR [32]. Nuestros datos también revelaron que la activación de AMPK por B-DIM podría suprimir la vía de mTOR, tal como se mide por la disminución del nivel de proteína de fósforo-mTOR (Fig. 1A, B), lo que demuestra, por primera vez, la funcionalidad de B-DIM como un activador de AMPK en ambas líneas celulares de próstata AR-sensibles y AR-insensibles. La inactivación de mTOR por B-DIM es consistente con nuestro informe publicado anteriormente [33].

C4-2B cáncer de próstata humano (A) o células LNCaP (B) fueron tratados con concentraciones indicadas de B-DIM para 3 horas para medir los niveles de proteína de fósforo-AMPKα, AMPKα, fósforo-Raptor, fósforo-ACC, fósforo-mTOR, o durante 24 horas para medir los niveles de proteína de AR, PSA o de escisión de PARP mediante análisis de transferencia Western. Medición de la β-actina sirvió como control de carga. Los números debajo de los resultados occidentales de fósforo AMPKα indican cuantificaron coeficientes normalizados de fósforo-AMPKα y ß-actina.

La activación de AMPK por B-DIM en horas tempranas se asocia con la posterior descenso de regulación de AR y la expresión de la proteína PSA y la inducción de apoptosis en células de cáncer de próstata humano

Los resultados mostrados anteriormente muestran que B-DIM alberga la propiedad AMPK-activación. Luego investigó si la activación de la AMPK por B-DIM podría provocar la muerte celular por apoptosis e inhibir la expresión de proteínas de la firma de cáncer de próstata, como la AR y PSA. Hemos demostrado previamente que la activación de la señalización de AMPK por B-DIM es un evento temprano que se produce tan pronto como tres horas de tratamiento (panel superior de la Fig. 1A, B). Se encontró que el tratamiento adicional de las células LNCaP con C4-2B y B-DIM por hasta 24 horas redujo significativamente los niveles de expresión de AR y PSA de una manera dependiente de la dosis, y también dio lugar a la muerte celular por apoptosis como se mide por la escisión de PARP ( el panel inferior de la Fig. 1A, B). Estos datos sugieren que la activación de la vía de señalización de AMPK es uno de los principales objetivos de B-DIM que conducen a la inducción de muerte celular por apoptosis de las células de cáncer de próstata.

La activación de AMPK por B-DIM puede ser bloqueada por un inhibidor de la AMPK

Compuesto C fue desarrollado como un inhibidor selectivo de AMPK [34]. La hipótesis de que si la AMPK es un objetivo molecular esencial de B-DIM, co-tratamiento con el compuesto C debe atenuar o bloquear los efectos de la B-DIM en las células del cáncer de próstata. Para probar esta hipótesis, C4-2B cáncer de próstata y las células LNCaP fueron pre-tratados con 20 M de Compuesto C o DMSO durante 6 horas y luego co-tratado con B-DIM a dos concentraciones de 3 horas adicionales. Los resultados de inmunotransferencia mostraron que en ambas líneas celulares de cáncer de próstata tratados con B-DIM solo, la señalización de AMPK se activó como se mide por un aumento dependiente de la dosis en la fosforilación de AMPKα (T172) y la fosforilación de Ser79-ACC (Fig. 2) , un sustrato directo de AMPK que se utiliza ampliamente como un detector de la activación de AMPK [35] - [37]. Sin embargo, los niveles de proteína de fósforo-AMPKα y fósforo-ACC se redujeron dramáticamente en las células pre-tratadas y co-tratado con el Compuesto C (Fig. 2), lo que sugiere que AMPK B-DIM-activado puede ser bloqueado por un inhibidor de la AMPK.

C4-2B El cáncer de próstata y las células LNCaP fueron pre-tratados con 20 M de AMPK compuesto inhibidor C (CC) durante 6 horas, seguido por el co-tratamiento con concentraciones indicadas de B-DIM durante 3 horas. Los extractos celulares de las células tratadas se sometieron a inmunotransferencia de anti-fósforo-AMPKα, fósforo-ACC o anticuerpos beta-actina.

B-DIM Mejora AR-que suprime el efecto de la droga anti-AR Casodex

Una de las estrategias actuales de tratamiento para el cáncer de próstata avanzado es para suprimir la función AR por la castración y anti-andrógenos. Casodex es un medicamento anti-andrógeno usado clínicamente para pacientes con cáncer de próstata metastásico /avanzado, y funciona mediante la unión y la prevención de la activación de la AR. Nuestros estudios previos han demostrado que B-DIM es capaz de inhibir la expresión de AR en células de cáncer de próstata [24]. Además, la hipótesis de que la combinación de B-DIM con Casodex puede tener un efecto sinérgico sobre la inhibición de la expresión de AR y la inducción de apoptosis en células de cáncer de próstata, que puede estar asociada con la activación de AMPK. Para probar esta hipótesis en que co-trataron las dos líneas celulares de cáncer de próstata con 100 M de Casodex y 40 mM de B-DIM durante 24 horas, y el tratamiento con cada agente solo sirvieron como controles. Los datos muestran que la co-tratamiento de C4-2B y LNCaP células con Casodex y B-DIM disminuyó significativamente el nivel de expresión de PARP división apoptosis asociada a la AR y aumentado con respecto a cada tratamiento solo, y el sinérgico o aditivo efecto fue acompañado por un aumento la activación de AMPK (Fig. 3).

C4-2B cáncer de próstata y las células LNCaP fueron tratados con 100 M de Casodex, 40 mM de B-DIM solo o una combinación de Casodex y B-DIM durante 24 horas, seguido por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti-fósforo-AMPKα, AR, PARP o beta-actina.

Tanto B-DIM y metformina inhibe de forma significativa Prostasphere Formación

Las células madre tumorales tienen las características de tumorspheres formando. Se ha demostrado que la metformina podría inhibir el crecimiento de células madre de cáncer, asociado a la activación de AMPK [16]. Con el fin de probar si B-DIM, que funciona como un activador de AMPK (Fig. 1, 2, 3) podría dirigirse a las células madre, como el cáncer e inhibir la formación prostasphere, células C4-2B fueron tratados con diferentes concentraciones de B-DIM para 6 días en pozos adherentes ultra-bajas de placas de 6 pocillos. El tratamiento con metformina sirvió como control. Los resultados mostraron que el B-DIM inhibe la formación prostasphere en un 29% y un 90% a concentraciones de tratamiento de 10 mM y 25 mM, respectivamente (Fig. 4), lo cual es consistente con nuestros resultados anteriores [27]. Los datos demuestran que la B-DIM puede poseer la capacidad de suprimir las células madre tumorales, como en el cáncer de próstata a través de la activación de la vía de la AMPK.

C4-2B células fueron tratadas con dosis indicadas de B-DIM (A, B) durante 6 días. El tratamiento con diferentes concentraciones de metformina sirvió como control (C, D). Después de 6 días, los números prostasphere se contaron bajo el microscopio y la proporción de células generando de esfera se calculó dividiendo el número de células sembradas por el número de prostaspheres (A, C). Prostaspheres a partir de células tratadas con C4-2B B-DIM (B) o metformina (D) se fotografiaron y los resultados mostraron que el 10 y 25 mM de B-DIM reducido significativamente el tamaño y el número de prostaspheres. n = 6, * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,01

B-DIM Activa AMPK y regula a la baja la AR en xenoinjertos de tumores de próstata andrógeno independiente C4-2B en ratones SCID

los resultados anteriores de nuestro
in vitro
estudios mostraron claramente que la vía de señalización de AMPK es una de las dianas moleculares del B-DIM en células de cáncer de próstata. Para confirmar este hallazgo
in vivo
, diseñamos y utilizamos el modelo animal experimental de metástasis ósea (ver Materiales y Métodos) que la metástasis ósea imita de cáncer de próstata humano. Se encontró que el tratamiento B-DIM
in vivo
el crecimiento del tumor C4-2B inhibido en el microambiente de la médula hasta cierto punto (20%; datos no mostrados). Los tejidos tumorales se retiraron y se analizaron por inmunohistoquímica utilizando anticuerpos anti-fósforo-AMPKα, fósforo-ACC y los anticuerpos de AR. Los resultados mostraron que las poblaciones de células p-ACC-positivos p-AMPK- y aumentaron significativamente, mientras que las células AR-positivas disminuyeron en gran medida en los tumores tratados con B-DIM en comparación con el control (Fig. 5). Estos resultados confirman que el B-DIM es capaz de activar la vía de la AMPK
in vivo
, asociados con su actividad anti-cáncer.

ratones ICR SCID se les implantaron células C4-2B y tratados con 5 mg /ratón de B-DIM por gavages orales al día durante 4 semanas. Los tejidos tumorales se analizaron por inmunohistoquímica utilizando anticuerpos anti-fósforo-AMPKα (T172), fósforo-ACC (S79) o anticuerpos de AR. Las secciones teñidas se visualizaron bajo el (× amplificación 400) microscopio. A diferencia del control tratados con disolvente, los ratones tratados con B-DIM presentados con la activación de la AMPK y la pérdida significativa de la AR en las secciones del tumor.

Discusión

La búsqueda de nuevos fármacos antitumorales naturales de fuentes es uno de los enfoques más prometedores para la prevención y el tratamiento del cáncer. Hemos estado estudiando formulado 3,3'-Diindolilmetano (B-DIM) y demostró que B-DIM puede inducir la apoptosis e inhibir el crecimiento celular, la angiogénesis y la invasión de las células del cáncer de próstata mediante la regulación de NF-kB, Akt y Ar vías de señalización [ ,,,0],24] - [25]. Sin embargo, el mecanismo molecular preciso (s) por el cual B-DIM suscitar sus efectos contra el cáncer de cáncer de próstata humano no han sido completamente aclarada. En este estudio, hemos descubierto que la AMPK es una de las dianas moleculares directos de B-DIM en las células del cáncer de próstata
in vitro
y
In
.

La señalización AMPK vivo vía se ha convertido recientemente en un importante foco de interés en la prevención y el tratamiento del cáncer. Bowker
et al
. investigado la incidencia de cáncer en 10.309 pacientes diabéticos tratados con insulina, metformina o sulfonilureas por un período de 5 años. Se informó que los pacientes tratados con metformina tuvieron una tasa significativamente menor de mortalidad relacionada con el cáncer en comparación con los pacientes expuestos a otros medicamentos contra la diabetes [12]. El principal mecanismo de anti-cáncer de la metformina se asoció con la activación de AMPK de señalización [34]. La activación de AMPK inhibe las vías de consumo de energía, la síntesis de proteínas y la proliferación celular, a través de la supresión de la vía de mTOR
vía
proteína Esclerosis tuberosa 2 (TSC-2) [38]. Hirsch H
et al
. informó de que la metformina se dirige selectivamente a las células madre de cáncer e inhibe el crecimiento tumoral en modelos de ratón mediada por la activación de la vía de AMPK [16]. Se ha informado de que algunos compuestos naturales incluyendo genisteína (rica en soja), el EGCG (abundante en el té verde), y la capsaicina (de pimiento picante) son capaces de activar la vía de la AMPK [17]. Descubrimiento de más activadores AMPK a partir de fuentes naturales se está convirtiendo en un enfoque atractivo para la prevención y el tratamiento del cáncer.

Nuestros resultados actuales muestran que B-DIM puede activar AMPK señalización tan pronto como tres horas en ambos andrógenos LNCaP y sensible a andrógenos células -insensible C4-2B cáncer de próstata, medidos a través de: (i) aumento de los niveles de proteína de fósforo-AMPKα (T172), (ii) aumento de los niveles de ACC fosforilada en el residuo serina 79 [30] - [31], (iii) aumentaron los niveles de proteína de fósforo-Raptor (S792), que es un objetivo directo de AMPK y un mTOR pareja de unión y el inhibidor de [8], y (iv) disminución de los niveles de fósforo-mTOR (Fig. 1). Consecuencias de la activación AMPK por B-DIM parecen estar mediados a través de la inhibición de la expresión de AR y PSA, dando lugar a la inducción de apoptosis en el tratamiento adicional durante 21 horas adicionales (Figs. 1, 6). la activación de AMPK por B-DIM podría ser bloqueado por el pre-tratamiento con el compuesto C, un inhibidor de la AMPK, en las células de cáncer de próstata (Fig. 2).

El receptor de andrógenos (AR) es una crítica factor de desarrollo del cáncer de próstata y la progresión. El cáncer de próstata es dependiente de la estimulación de andrógenos mediada por AR y AR incluso juega un papel importante en el desarrollo del cáncer y de resistencia a fármacos en células de cáncer de próstata independientes de andrógenos. Se proponen mecanismos alternativos de activación AR en el cáncer de próstata independiente de andrógenos a través de otras vías de señalización, incluyendo ERKs, Akt, β-catenina y caveolina [39] - [41]. Por lo tanto la supresión de la AR es una de las estrategias terapéuticas para pacientes con cáncer de próstata. Casodex es un medicamento anti-andrógeno usado clínicamente para pacientes en fase metastásica /avanzado. Cualquier compuestos naturales que podrían mejorar la eficacia de Casodex tienen un potencial beneficio terapéutico en la clínica. Hemos demostrado en el presente estudio que la co-tratamiento de las células con Casodex y B-DIM dio lugar a un aumento significativo de fósforo AMPKα y suprimió la expresión de AR en células de cáncer de próstata (Fig. 3), lo que demuestra un nuevo mecanismo para la sinergia de anti- la terapia AR.

tejido de cáncer de próstata contiene una rara población de células madre del cáncer de múltiples potentes con la capacidad de auto-renovación. Estas células madre de cáncer de próstata podrían enriquecerse y medidos por un ensayo de formación de colonias en cultivos tridimensionales, referidos como prostasphere formación. Las células de cáncer de próstata con características de células madre poseen la capacidad de formar prostaspheres de células individuales como condición para la auto-renovación en condiciones de cultivo no adherentes [42]. Para determinar si B-DIM podría apuntar madre de la próstata /células madre similares, hemos probado en ensayos de formación de prostasphere. El resultado mostró que después de seis días de incubación de las células C4-2B con diferentes dosis de B-DIM, no sólo eran los números de prostaspheres desarrollados disminuyeron significativamente, pero el tamaño de prostaspheres también se redujo (Fig. 4). Los resultados de la
in vitro
estudios fueron confirmadas por los resultados de inmunohistoquímica en tejidos tumorales de xenoinjertos de cáncer de próstata tratados con B-DIM (Fig. 5). poblaciones de células positivas teñidas con fósforo o fósforo AMPK-ACC se incrementaron significativamente, mientras que las células AR-positivos se redujeron en el B-DIM tratados tejido tumoral (Fig. 5).

En resumen, el presente estudio proporciona la primera evidencia de que la vía de señalización de AMPK es una de las dianas moleculares de B-DIM para su actividad anti-cáncer. La activación de AMPK por los resultados B-DIM en la supresión de su objetivo abajo mTOR, la baja regulación de la expresión del RA y la inducción de la apoptosis en LNCaP tanto andrógeno-sensibles y las células de cáncer de próstata andrógeno-C4-2B insensibles (Fig. 6). La activación de AMPK por B-DIM también se observó en los tumores de próstata tratados. Nuestros resultados demuestran que B-DIM podría ser utilizado como un agente potencial en la clínica para la prevención y /o tratamiento de cáncer de próstata independientemente de la capacidad de respuesta de andrógenos de las células.

Agradecimientos

Agradecemos Sra. Sara Schmitt para la lectura crítica del manuscrito.

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