Extracto
Los pacientes con cáncer de próstata avanzado, casi invariablemente, el desarrollo de metástasis óseas. Aunque muchos estudios indican que la activación de la señalización de NF-kappa B parece estar correlacionada con cáncer avanzado y promueve la metástasis tumoral, influyendo en la migración de células tumorales y la angiogénesis, la influencia de la señalización de NF-kappa B alterada en células de cáncer de próstata dentro de óseas lesiones metastásicas no es claramente entendido. Mientras que las células de cáncer de próstata PC3 C4-2B y crecen bien en el hueso, las células LNCaP son difíciles de cultivar en el hueso murino después de la inyección intraskeletal. Nuestros estudios muestran que en comparación con LNCaP, la actividad de NF-kappa B es significativamente mayor en C4-2B y PC3, y que la activación de la señalización de NF-kB en las células de cáncer de próstata dio lugar a la expresión incrementada de los osteoclastos inducción de genes PTHrP y RANKL. Además, el medio acondicionado derivado de NF-kappa B activado células LNCaP inducen la diferenciación de osteoclastos. Además, la inactivación de NF-kB de señalización en células de cáncer de próstata inhibe la formación de tumores en el hueso, tanto en el PC3 osteolítica y las células osteoblásticas C4-2B mixtos /osteoclástica; mientras que la activación de la señalización de NF-kB en las células LNCaP promovido establecimiento tumor y la proliferación en el hueso. La activación de NF-kB en las células LNCaP dio como resultado la formación de un /tumor mixto osteoclástica osteoblástica con el aumento de los osteoclastos que rodean el hueso nuevo formado, similar a las metástasis comúnmente observados en los pacientes con cáncer de próstata. Estos resultados indican que se requiere reacción osteoclástica incluso en las células cancerosas osteoblásticas y la activación de NF-kB señalización en las células de cáncer de próstata aumenta la osteoclastogénesis hasta la regulación de los genes osteoclastogenic, contribuyendo así a la formación de metástasis ósea
Cita.: Jin R, Sterling JA, Edwards JR, DeGraff DJ, Lee C, Parque SI, et al. (2013) La activación de NF-kappa B Señalización Para promover el crecimiento de células de cáncer de próstata en el hueso. PLoS ONE 8 (4): e60983. doi: 10.1371 /journal.pone.0060983
Editor: Qiming Jane Wang, de la Universidad de Pittsburgh School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Agosto, 2012; Aceptado: March 5, 2013; Publicado: 5 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Jin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo de RJ por el Departamento de Defensa (DOD) Programa de Investigación de cáncer de próstata (PCRP) (W81XWH-10-1-0236); JAS por el TMEN (5U54 CA 126 505), la Universidad de Vanderbilt Centro de hueso PPG (5P01 CA40035) y la concesión de carrera Desarrollo del Departamento de Asuntos de Veteranos; a RJM por el Instituto Nacional del Cáncer (4R01 CA076142-14) y los Laboratorios Preston Frances de la T. J. Fundación Martell. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Casi todos los pacientes con cáncer de próstata avanzado (CaP) desarrollan metástasis óseo. El desarrollo del crecimiento del tumor en el hueso es la complicación más crítico de CaP avanzado, con frecuencia resulta en la morbilidad y mortalidad significativas [1]. A diferencia de otros tipos de cáncer, un depósito metastásico inicial de células de CaP es casi estrictamente limitada a los huesos y es a menudo el único sitio de la propagación distal incluso en etapas tardías de la enfermedad [2]. Una vez que las células tumorales de la próstata entran en el esqueleto, un ciclo destructivo de daños óseos y el crecimiento tumoral se produce bruto, momento en el que la terapia curativa ya no es posible y el tratamiento paliativo se convierte en la única opción. El tiempo medio entre el diagnóstico de una metástasis del esqueleto clínicamente evidente y la muerte es de aproximadamente 3-5 años [3]. Por lo tanto, la comprensión del mecanismo por el cual las células de CaP vivir en el medio y el desarrollo de los huesos método (s) efectiva para prevenir o tratar la metástasis ósea CaP es fundamental para aumentar la tasa de supervivencia de los pacientes con CaP avanzado.
A diferencia de otros sólida tumores que están asociados con metástasis óseas osteolíticas, metástasis ósea CaP se asocia con metástasis osteoblástica. Sin embargo, la colonización con éxito de hueso por células de CaP requiere tanto procesos osteoblásticas osteolítica y. Esto ocurre en parte porque células de CaP son capaces de producir factores de crecimiento que pueden afectar tanto a los osteoblastos y osteoclastos, lo que resulta en la formación ósea osteoblástica y resorción ósea excesiva [1], [4]. Si bien la función de los osteoblastos en la metástasis ósea CaP es bien reconocida, varios hallazgos sugieren fuertemente un papel importante para la función de los osteoclastos en la formación exitosa de las metástasis óseas CaP [5] - [10]. Por ejemplo, cuando células de CaP inicialmente colonizan un hueso, que se cree que induce la osteoclastogénesis primera [11], y la posterior resorción ósea. evidencia histomorfométrico indica que las metástasis osteoblásticas forman en el hueso trabecular en los sitios de reabsorción anterior osteoclastos y la resorción tal se requiere para la formación ósea osteoblástica posterior [12]. Estos hallazgos sugieren que el CP potencia la deposición de hueso a través de un aumento general de la remodelación ósea. Además, la resorción ósea osteoclástica contribuye a la mayoría de las secuelas del esqueleto, o eventos relacionados con el esqueleto (IEEE, tales como fracturas y el dolor), en pacientes con metástasis óseas. Además, la resorción ósea osteoclástica también contribuye al establecimiento de tumores en el esqueleto. Por lo tanto, la osteoclastogénesis inducida por células de CaP se sugiere a ser un evento temprano de la metástasis ósea y es un requisito previo necesario para la colonización inicial de hueso CaP. Aunque el concepto de la activación de los osteoclastos como un componente subyacente de crecimiento de CaP en el hueso ya es bien reconocido, los detalles mecanicistas por el que las células de CaP aumentar la activación de los osteoclastos y posteriormente inducen metástasis en el hueso medio ambiente son todavía no está claro
.
ahora se cree ampliamente que la tríada molecular - activador del receptor de NF-kB ligando (RANKL), su receptor RANK, y el inhibidor de RANKL soluble endógeno, la osteoprotegerina (OPG) - juegan papeles esenciales y directos en la formación, función y supervivencia de osteoclastos. Muchos estudios han indicado que RANKL /RANK /OPG son los principales reguladores del metabolismo óseo, tanto en condiciones normales y patológicas, incluyendo metástasis óseas CaP [13], [14]. Otro gen importante, proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP), es conocido por estar involucrado en la diferenciación de osteoclastos. PTHrP es producido por prácticamente todos los tumores que metastatizan al hueso, y numerosos estudios han demostrado una correlación entre la expresión de PTHrP y la localización de los tumores esquelético. PTHrP tiene efectos prominentes en el hueso a través de su interacción con el receptor PTH-1 en las células osteoblásticas. A través de medios indirectos, PTHrP es compatible con la osteoclastogénesis hasta la regulación de RANKL en osteoblastos [15]. células de CaP se han demostrado para expresar varios factores que regulan la osteoclastogénesis, incluyendo PTHrP, factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), los miembros del factor de crecimiento transformante β (TGF-beta) superfamilia, y de tipo activador del plasminógeno uroquinasa (uPA- plasmina), lo que resulta en la activación de las metaloproteinasas de la matriz (MMPs, en concreto MMP-2 y MMP-9), así como la interleuquina-1 (IL-1) y la interleucina-6 (IL-6) [16]. Sin embargo, la identificación del mecanismo (s) crítico o vía (s) principal responsable de que la expresión inicial de gen (s) osteoclastogénicos y la resorción excesiva que resulta en la promoción de la metástasis ósea del CP sigue siendo difícil de alcanzar.
Es ampliamente aceptado que RANKL /RANK /OPG son los principales reguladores del metabolismo óseo y la PTHrP es uno de los principales reguladores más importantes de los osteoclastos y la diferenciación de osteoblastos. Por lo tanto, en el presente estudio nos hemos centrado en la comprensión de cómo RANKL y PTHrP se encuentran regulados en células de CaP por NF-kB. proteínas NF-kB son una clase importante de los reguladores de la transcripción en el CP. abundantes datos apoya un papel clave para la vía de señalización de NF-kappa B en el control de la iniciación y la progresión del cáncer humano [17] - [20]. La sobre-expresión de NF-kappa B en el núcleo de células de CaP parece estar correlacionada con CaP quimiorresistencia, etapa avanzada, la recurrencia de PSA y la diseminación metastásica [21] - [27]. Varios estudios han publicado pruebas que indican la ruta de NF-kB es un contribuyente a la metástasis visceral o "tejidos blandos" en el CaP [18], [19], [28], [29]. Anteriormente, hemos informado de que la activación de la señalización de NF-kB promueve el crecimiento resistente a la castración del CP [30]. En este estudio, hemos investigado el papel de la señalización de NF-kB en la colonización de células de CaP en el hueso medio ambiente y el papel de este mecanismo juega en la destrucción ósea asociada con la metástasis ósea CaP. Nos informan de que la activación de la señalización de NF-kappa B aumenta la expresión de genes en células de CaP osteoclastogenic, que es suficiente para que las células cancerosas se adhieren y crecen en el hueso medio ambiente y mejorar la formación de la lesión. A nuestro entender, este es el primer informe que la activación de la señalización de NF-kappa B en células de CaP aumenta la osteoclastogénesis hasta la regulación de los genes osteoclastogenic, contribuyendo así a la formación de metástasis óseas. Nuestro estudio indica que la orientación baja regulación de la NF-kB podría tener un impacto importante en la reducción de la metástasis ósea dolorosa en pacientes con CaP avanzado.
Materiales y Métodos
cultura y los materiales de la célula
Las líneas celulares de carcinoma de próstata humano LNCaP y PC-3 se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA). C4-2B células fueron un regalo del Dr. Leland Chung (Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, CA) [31]. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en el aire. Las líneas celulares se cultivaron de forma rutinaria en medio RPMI 1640 (Gibco-BRL) que contenía 5% de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone), 0,1% ITS y 0,1% de glutamina (Gibco-BRL).
Generación de NF kappa B señalización activa continuamente líneas de células inactivadas /CaP
Para generar una línea celular de señalización NF-kB CaP constitutivamente activado, las células LNCaP fueron infectadas de forma estable con el vector retroviral IKK2-EE que resulta en LNCaP-EE, en el que NF-kB actividad fue activado con una constitutivamente activa (EE) mutantes de IKK2 [32], [33]. Para generar NF-kappa B de señalización de líneas de células de CaP continuamente inactivadas, células PC3 C4-2B y se infectaron de forma estable con IKK2-KD vector retroviral (C4-2B-KD y PC3-KD), en la que la actividad de NF-kB se inhibió con una quinasa muertos (KD) IKK2 mutante [32], [33]. Las células infectadas con el vector vacío se utilizaron como controles (LNCaP-EV, C4-2B-EV y PC3-EV). Todos los vectores retrovirales fueron un regalo del Dr. Martin Leverkus, Universidad de Magdeburg, Alemania.
La transcripción inversa y PCR en tiempo real
Total ARN de LNCaP, LNCaP-EE, y C4-2B células PC3 se extrajeron utilizando Trizol (Gibco-BRL), y el ADN genómico residual se eliminó por tratamiento ADNasa I (Invitrogen). Los ARN fueron transcritas inversa usando cebadores aleatorios y Superscript II (Gibco-BRL) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los cebadores utilizados para amplificar RANKL fueron 5'-TGGAAGGCTCATGGTTGGAT-3 '(hacia adelante), 5'-CATTGATGGTGAGGTGTGCAA-3' (hacia atrás); PTHrP fueron 5'-TTAAAGCAGTACCCCCCTACCA-3 '(hacia adelante), 5'-ATGGGCTCTAGCGCCTCTCT-3' (hacia atrás). En tiempo real las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 20 l usando un formato de placa de 96 pocillos y se detectó la fluorescencia utilizando el sistema de detección de IQ en tiempo real Bio-Rad I-Cycler. La expresión génica se normalizó a 18S rRNA por la 2
-ΔΔCt método [34].
RANKL ensayos ELISA y PTHrP radio-inmuno (RIA) guía
Para la determinación de los niveles de RANKL y PTHrP secretada por las células de CaP, LNCaP-EV, LNCaP-EE, PC3-EV y PC3-KD células se cultivaron por separado durante 48 horas; Se contaron el número de células. 40 y 100 l de medios de cultivo se utilizan en el ELISA (MyBioSource) y RIA (Beckman Coulter) según las instrucciones del fabricante, respectivamente. Cada muestra se analizó por triplicado mediante lector de ELISA o un contador gamma (Beckman Coulter) y las concentraciones se determinaron según las instrucciones del fabricante.
análisis de transferencia de Western
lisado celular total se extrajo a partir de NF-kB células activadas /inactivadas de PCA. Una parte alícuota de 20 g de cada muestra de proteína se separó en un gel de gradiente de Tris-glicina 4 a 12% (Novex ™), y después se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & amp; Schuell, Alemania). Las membranas se bloquearon con 5% de leche descremada en TBS-T (solución salina tamponada con tripsina, Tween-20 al 1%) de tampón. Los anticuerpos RANKL (N19, Santa Criuz) o PTHrP (N19, Santa Criuz) se añadieron a las concentraciones óptima (1:1000) y las manchas de transferencia se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces durante 10 minutos cada una en TBS-T, la incubación se realizó durante 1 hora con los anticuerpos anti-ratón de cabra con peroxidasa de rábano conjugada secundaria, respectivamente. Las señales fueron desarrollados por un sistema de detección ECL (Amersham Biosciences, Amersham, EE.UU.).
La transfección transitoria de ensayo
El vector NGL [un vector indicador sensible NF-B que tiene la luciferasa y verde fluorescente Protein (GFP) genes informadores] [35] se utilizó para medir la actividad de NF-kB en las células de cáncer de CaP por experimentos de transfección transitoria. LNCaP, PC3 y C4-2B células se sembraron a una densidad inicial de 2,5 x 10
4 placas de cultivo de tejidos /pocillo en 24 pocillos. Después de 24 horas, las células fueron transfectadas con el vector de NGL usando Lipofectamine (Invitrogen) durante cuatro horas de acuerdo con el protocolo del fabricante. La eficiencia de la transfección se determinó por co-transfección de PRL-CMV que contiene el gen indicador de luciferasa de Renilla (Promega). Se determinó la actividad de luciferasa usando el sistema de ensayo de luciferasa Promega Corp 24 horas después de la transfección. Los valores trazados representan la media de al menos tres muestras individuales ± SEM.
diferenciación de los osteoclastos ensayo
células de médula ósea fueron aisladas de fémures de ratón por la presión de fluido aplicada con una jeringa. Para obtener la médula ósea derivadas de monocitos /macrófagos, las células de médula ósea se cultivaron en el medio DMEM que contiene 10% L929 sobrenadante como fuente de M-CSF y RANKL [36]. Después de que las células de médula ósea cultivadas primarias diferenciadas en monocitos /macrófagos (alrededor de 6 días), las células se sembraron en placa de 24 pocillos y se trataron con medio condicionado de diferentes células de CaP (LNCaP, LNCaP-EE, C4-2B y células PC3) . Para generar los medios condicionados que contienen secreciones de células de CaP, medio RPMI 1640 (que contiene 5% de FBS, 0,1% ITS y 0,1% de glutamina) se añadió a la placa de cultivo de células de CaP. Después de 24 horas, el medio se recogió y se transfirió a las células diana (monocitos /macrófagos). El medio se cambió diariamente condición. Luego, después de 10 días de cultivo adicional con medio condicionado, las células diana se fijaron y la diferenciación de los osteoclastos se confirmó por tinción con tartrato resistente a fosfato ácido de (TRAP) (Sigma). Las células con una tinción positiva para TRAP que contiene 3 o más núcleos se contaron como osteoclastos. Para la cuantificación, el número de osteoclastos en cada pocillo de placa de 24 pocillos fue contado en el microscopio. Cada grupo cuenta con 6 pozos (pozos de placa de 24 pocillos). Los resultados mostraron que el número medio ± desviaciones estándar.
proliferación de osteoblastos ensayo
Uno de 3 días de edad cachorro de tipo salvaje C57BL6 se anestesió en hielo después de la inmersión en etanol al 70%. Entonces sacrificaron por decapitación con las tijeras, el cuero cabelludo se hizo una incisión en la línea media y se expuso el cráneo. Cráneo (frontal, parietal, temporal y occipital) se escindió con un par de tijeras finas iris y el cerebro eliminado en los medios de α-MEM (sin suero) en el plato de 60 mm. hueso craneal que fue cortado en pedazos 4-5. Los huesos se pusieron en 15 ml tubo cónico con 2 ml de medio de colagenasa [Media α-MEM libre de suero con colagenasa A (2 mg /ml)]. Los huesos se incubaron durante 30 minutos a 100 rpm en 37 ° C agitador bacteriano. medios sobrenadante se descartó suavemente, y los huesos se añadieron 5 ml de los nuevos medios de colagenasa y se incubaron durante 2 horas a 150 rpm en una incubadora sacudida. Después de centrifugar a 1500 rpm durante 3 min, medios sobrenadante se descartó suavemente y se resuspendieron 5 ml en α-MEM suplementado con 10% FBS y 2 × Penn /Strep y crecieron en el plato 60 mm. Después de 2 semanas, los osteoblastos en cultivo primario se sembraron en plats 96 pocillos y se trataron con medio condicionado de NF-kappa B activado /células de CaP inactivadas (LNCaP-EV, LNCaP-EE; C4-2B-EV, C4-2B-KD; PC3-EV y células PC3-KD). Para generar los medios condicionados que contienen secreciones de células de CaP, medio RPMI 1640 (que contiene 5% de FBS, 0,1% ITS y 0,1% de glutamina) se añadió a las placas de cultivo celular de CaP. Después de 24 horas, el medio se recogió y se transfirió a las células diana (osteoblastos). MTT ensayo se realizó a las 48 horas después del tratamiento.
modelo de ratón de la enfermedad ósea inducida por tumores
Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Vanderbilt Institucional Animal Care & amp; El empleo Comisión (Número de Permiso: M /09/387). Tanto el NF-kappa B activado (PC3-EV, C4-2B-EV y LNCaP-EE) y inactivada (PC3-KD, C4-2B-KD y LNCaP-EV) se utilizaron células de CaP para investigar si la activación de NF señalización kappa B contribuye a la creación y el crecimiento del tumor CaP en el entorno de los huesos. Para reducir la variabilidad inter-host cuando se compararon los grupos control y de prueba, el NF-kappa B activado y células de CaP inactivadas fueron injertados en el mismo ratón. En cada host individual, la tibia izquierda se inyectó con NF-kB activado CaP (PC3-EV, C4-2B-EV y LNCaP-EE) de las células, mientras que la tibia derecha fue inyectado con NF-kB inactivado CaP (PC3-KD, ) las células C4-2B-KD y LNCaP-EV, respectivamente. En concreto, una suspensión de una sola célula de 2 × 10
5 PC3-EV o PC3-KD; C4-2B-EV o C4-2B-KD; células LNCaP-EV o LNCaP-EE /10 l de PBS se colocó directamente en el 6-7 semanas de edad ratones macho atímicos desnudos (/c cepa BALB) hueso por inyección intratibial bajo la anestesia con isoflurano, respectivamente. Cada grupo tenía un mínimo de 4 ratones. lesiones osteoblásticas fueron evaluados utilizando imágenes de pequeños animales de rayos X radiografía (Faxitron LX-60; Lincolnshire). Tras el sacrificio, el volumen de hueso se evaluó en los escaneos CT micro y el análisis histológico en 3 (para PC3-EV y PC3-KD células inyectadas ratones) y 10 (para LNCaP-EV, LNCaP-EE, C4-2B-EV y C4-2B células -kd inyectaron ratones) semanas después de la inoculación del tumor. tibias cosechado fueron fijadas en 10% de solución tamponada con formalina neutra durante 24 horas y descalcificadas en 0,5 mol /L EDTA en Ca
2 + - y Mg
2 + libre de PBS de Dulbecco por una semana antes de la incrustación en parafina. de serie de secciones longitudinales de seis micrómetros se cortaron de la tibia y se tiñeron con H & amp; E o con IHC para analizar el crecimiento del tumor en el hueso. análisis histomorfométrico al volumen tumoral (TV) y el volumen de hueso trabecular (BV) se realizaron utilizando el software Metamorph (Molecular Devices, Inc.) como se ha descrito anteriormente [37].
microtomografía tomografía (μCT) Análisis
para la determinación de la arquitectura tridimensional del hueso después de la inoculación del tumor, los ratones se sacrificaron y se recogieron y se fijaron durante la noche en 10% de solución tamponada con formalina neutra durante 24 horas, seguido por 70% de etanol las tibias. Las muestras se escanearon utilizando un sistema de μCT (Scanco μCT 40; Bassersdorf, Suiza). El barrido se compone de 129 sectores, con un valor umbral de 263. Una reconstrucción tridimensional de las imágenes se realizó con la región de interés consiste en áreas trabecular. Las regiones de interés fueron dibujados en cada una de las rebanadas 100, justo en el interior del hueso cortical, para incluir sólo el hueso trabecular y la médula.
La inmunohistoquímica
secciones de tejido embebidas en parafina de las tibias eran manchada por inmunohistoquímica con anticuerpos contra la AR (clon N20, Santa Cruz), PSA (clon LK2H10, Santa Cruz) y Fox A1 (T20 clon, Santa Cruz). El anticuerpo primario se incubó a la concentración apropiada (AR: 1:1000; PSA: 1:500; Fox A1: 1:1000) durante una hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario se incubó durante 60 minutos, utilizando peroxidasa de rábano conjugada con anticuerpo de cabra anti-conejo o de cabra anti-ratón (1:1000), respectivamente. Las láminas fueron lavadas extensivamente en agua del grifo, counterstained con hematoxilina de Mayer y montado
El análisis estadístico y la imagen
En su caso, los grupos experimentales se compararon mediante dos muestras
t
. - prueba, con un significado definido como
P
. & lt; 0,05
resultados
la activación de la señalización de NF-kappa B aumenta la expresión de los genes asociados a la osteoclastogénesis en células de CaP
I? B? inhibe la señalización NF-kappa B mediante la unión a NF-kB y la prevención de localización nuclear [38], [39]. Por lo tanto, la regulación por disminución de I? B? Resulta en la activación continua de NF-kB de señalización [40], [41]. Con el fin de investigar el papel de NF-kB de señalización sobre la próstata desarrollo /CaP y la progresión, se realizó RNA microarrays para comparar directamente los tejidos de la próstata de I? B? Knock out (KO) de ratón [40], [41] (incluyendo I? B? - /- y los ratones I? B? +/-) con los tejidos normales de la próstata del ratón. Los resultados de análisis de microarrays mostraron que la expresión de muchos genes osteoclastogénesis asociada, como RANKL, PTHrP, GM-CSF y uPA, aumentó más de 2 veces en tanto I? B? - /- Y I? B? +/- Tejidos prostáticos, en comparación con la de próstata normal (datos no mostrados). Con el fin de confirmar aún si la señalización de NF-kappa B está implicado en la regulación de los genes osteoclastogénesis asociada en células de CaP, hemos activado NF-kappa B señalización en las células LNCaP mediante la infección con IKK2-EE vector retroviral, en el que se activó la actividad de NF-kB con unos mutantes constitutivamente activos de IKK2 [32], [33]. La activación de la señalización NF-kB se confirmó usando el reportero NGL, un plásmido indicador de NF-B, que tiene un elemento de respuesta a NF-kappa B acoplado a un reportero GFP /luciferasa [35] (fig. 1A). análisis de QRT-PCR mostró que RANKL y expresión PTHrP se incrementan significativamente en NF-kappa B activado células LNCaP, en comparación con las células control vector vacío (Fig. 1B y 1C). RANKL y PTHrP se conocen como factores clave de la osteoclastogénesis en el hueso, y juegan un papel clave en la metástasis ósea de muchos tipos de cáncer [15], [42] - [45]. Por lo tanto, los resultados de nuestro QRT-PCR indican que la señalización de NF-kappa B está implicado en la regulación de RANKL y PTHrP, los genes osteoclastogénesis-asociado en células de CaP.
señalización NF-kappa B se activa en las células LNCaP por infectar con IKK2-EE vector retroviral (LNCaP-EE), mientras que se usaron células LNCaP infectadas con el vector vacío como los controles (LNCaP-EV). la actividad de NF-kB en las células LNCaP-EE LNCaP-EV y se midieron mediante el uso de un reportero NGL sensible NF-kappa B (A). La expresión de RANKL (B) y PTHrP (C) se midió mediante qRT-PCR. Los valores trazados representan la media de al menos tres muestras individuales ± SEM. La significación estadística se determinó mediante dos muestras
t-test
. **,
P
. & Lt; 0,01
células de CaP capaces de crecer en el microambiente óseo tienen una mayor actividad de NF-kB
Se ha informado de que C4- 2B células PC3 con CaP y crecen bien, pero las células LNCaP son difíciles de cultivar en el hueso murino después de la inyección intrafemural /intratibial [46]. Esto indica que los eventos de expresión de genes específicos de células contribuyen a la colonización exitosa de hueso por células de CaP. Con el fin de determinar si la actividad de NF-kB refleja CaP crecimiento celular en el hueso, la actividad endógena de NF-kappa B en LNCaP, C4-2B y células PC3 se midió usando el reportero NGL [35]. Curiosamente, la actividad de NF-kB en C4-2B y células PC3 (que crecen bien en el hueso) es significativamente mayor que la de las células LNCaP (Fig. 2A). Además, QRT-PCR indican PTHrP (ARNm) de expresión es significativamente mayor en NF-kappa B activado LNCaP-EE, C4-2B y células PC3, en comparación con la de las células LNCaP (Fig. 2B). ensayos de ELISA y RIA muestran que la activación de NF-KB de señalización aumento de RANKL y la secreción de PTHrP (proteína) de manera significativa en células LNCaP-EE, en comparación con las células control vector vacío (Fig. 2C, D y E). Sin embargo, la inactivación de NF-kappa B señalización en las células PC3 (PC3-KD) mediante la infección de ellos con IKK2-KD vector retroviral en el que la actividad de NF-kB se inhibió con una quinasa muerta (KD) IKK2 mutante [32], [33] ( Fig. 2C), resultó en una disminución significativa en los niveles de RANKL y PTHrP comparación con las células de control del vector vacío (PC3-EV) (Fig. 2D y e). análisis de transferencia Western confirmó además que la expresión de RANKL y PTHrP se incrementó en NF-kappa B activado células de CaP (LNCaP-EE), mientras que, disminución en NF-kappa B inactivado células de CaP (PC3-KD), en comparación con las células control vector vacío ( LNCaP y PC3-EV-EV) (Fig. 2F). Estos resultados indican que las células de CaP que son capaces de crecer en el microambiente óseo tienen una mayor actividad de NF-kappa B y la activación de NF-kB señalización hasta regula los genes osteoclastogénesis asociada en células de CaP, lo que podría aumentar su capacidad de unir y crecer en el hueso células de CaP microambiente
.
(a) capaces de crecer en el microambiente de la médula exhiben aumento de la actividad de NF-kB. la actividad de NF-kB en LNCaP, C4-2B y células PC3 se midieron mediante el uso de un reportero NGL sensible NF-kB. (B) Expresión de PTHrP se correlaciona con la actividad de NF-kB de señalización en células de CaP. La expresión de PTHrP en LNCaP, NF-kB activado LNCaP-EE, C4-2B y células PC3 se midió mediante qRT-PCR. (C) la generación de NF-kB inactivado líneas celulares de CaP. la señalización de NF-kB se inactivó en C4-2B y células PC3 infectando con IKK2-KD vector retroviral (C4-2B-KD y PC3-KD), mientras que las células de CaP infectadas con el vector vacío se utilizaron como los controles (C4-2B y PC3-EV). la actividad de NF-kB se midió mediante el uso de un reportero NGL sensible NF-kB. (D y E) Expresión de RANKL (D) y las proteínas PTHrP (E) en NF-kappa B activado LNCaP-EE y NF-kB inactivan células PC3-KD se midieron mediante ensayos de ELISA y RIA, respectivamente. Las células infectadas con el vector vacío (LNCaP-EV y PC3-EV) se utilizaron como control. (F) Expresión de RANKL y PTHrP se correlacionan con la actividad de NF-kB de señalización en células de CaP. RANKL y expresión PTHrP se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. Los valores trazados representan la media de al menos tres muestras individuales ± SEM. La significación estadística se determinó mediante dos muestras
t-test
. **,
P
. & Lt; 0,01
La activación de NF-kB de señalización en las células de CaP contribuye a la osteoclastogénesis
Los osteoclastos son células multinucleadas altamente especializadas encargadas de hueso resorción, un proceso crítico para el mantenimiento de la estructura ósea y la homeostasis del calcio. Sin embargo, la activación patológica de los resultados de osteoclastos en la pérdida de hueso asociada con la artritis inflamatoria, enfermedad periodontal, y la metástasis del cáncer a los huesos. Los osteoclastos derivan de monocitos /macrófagos progenitores del linaje bajo la influencia de la citoquina RANKL [47]. Con el fin de determinar si la activación de NF-kB de señalización en el CaP células influencias osteoclastogénesis en la médula ósea, las /los progenitores del linaje de los macrófagos monocitos a partir de células de médula ósea primaria fueron tratados con medio condicionado de NF-kappa B activado /células de CaP inactivadas, y supervisados por los osteoclastos diferenciación. Nuestros resultados muestran que el medio condicionado de NF-kappa B activado células LNCaP (LNCaP-EE) inducida por TRAP positivas formación de células multinuclear característica de los osteoclastos, mientras que el medio acondicionado de células LNCaP no lo hizo (Fig. 3A y la Tabla 1). C4-2B y medios de comunicación de células PC3 acondicionado también indujeron TRAP-positivo la formación de células multinucleadas (Fig. 3A y la Tabla 1). Para comprender mejor cómo la señalización NF-kappa B en células de CaP influencias componentes celulares de la microenviornment hueso, los osteoblastos a partir de cultivos primarios de células de médula ósea murina se trataron con medio condicionado de NF-kappa B activado células de CaP /inactivadas. Nuestros resultados muestran que el medio condicionado derivado de NF-kappa B activado células de CaP no tuvieron efecto significativo sobre la proliferación de osteoblastos (Fig. 3B). Estos resultados indican que la activación de NF-KB de señalización en células de CaP contribuye a la osteoclastogénesis, pero no a la proliferación de osteoblastos.
(A) medio condicionado de NF-kappa B activado células de CaP induce la formación de células similares a osteoclastos
in vitro. macrófagos derivados de médula ósea fueron tratadas con medios acondicionados de LNCaP, NF-KB activa LNCaP-EE, C4-2B y células PC3. tinción TRAP se realizó después de 10 días de cultivo adicional con medios acondicionados. Las flechas indican las células similares a osteoclastos. (B) de activación de la señalización de NF-kappa B en células de CaP tiene ningún efecto significativo sobre la proliferación de osteoblastos. osteoblastos en cultivo primario se trataron con medio condicionado de NF-B activadas (LNCaP-EE, C4-2B-EV y PC3-EV) o inactivados (LNCaP-EV, C4-2B-KD y PC3-KD) células de CaP. Proliferación de ensayo (ensayo MTT) se llevó a cabo a las 48 horas después del tratamiento.
antagonización de señalización NF-kB inhibe la creación y el crecimiento del tumor CaP en la médula
Con el fin de determinar si antagonizar la señalización NF-kB inhibe la creación del tumor CaP y el crecimiento en el microambiente de la médula, generamos señalización NF-kB líneas celulares de CaP inactivadas por infectar de forma estable con vectores IKK2-KD (PC3-KD y C4-2B-KD) (Fig. 2C ). A pesar de NF-kB bloqueo ligeramente alteradas las tasas de proliferación (Fig. 4), todas las células de ingeniería crecieron bien (sobrevivir)
in vitro
después regulación a la baja de la actividad de NF-kB. NF-kappa B y las células PC3 inactivada C4-2B (PC3-KD y C4-2B-KD) se inocularon en el hueso de los ratones por inyección intratibial, y la imagen radiografía animal pequeño de rayos X se llevó a cabo para controlar el desarrollo de la lesión ósea. Los ratones fueron sacrificados para el análisis histológico a las 3 semanas (para PC3-EV y células PC3-KD ratones inyectados) y 10 semanas (por C4-2B-EV y las células C4-2B-KD ratones inyectados) después de la inoculación. Todos los tumores injertados con células C4-2B-EV PC3-EV y (PC3 y las células C4-2B infectadas con el vector vacío, se utilizaron como controles) crecieron bien en el hueso; mientras que, NF-kB inactivado PC3-KD y el crecimiento celular C4-2B-KD no se detectó (0/4 en ambos grupos) de formación de imágenes por radiografía de rayos X o análisis histológico (Fig. 5A y 5B). Los análisis histomorfométricos mostraron que el promedio BV /TV es de 5,3% para el PC3-EV y el 13,9% para los tumores C4-2B-EV. Estos resultados indican que la inactivación de la señalización de NF-kB inhibe tanto osteolíticas (PC3) y osteoblástica /osteoclástica mixto (C4-2B) CaP tumores establecimiento y crecimiento en el entorno del hueso.
NF-kB activado /desactivado de células CaP líneas se generaron por infectar de forma estable con vectores IKK2-KD IKK2-EE /. IKK2-EV fue utilizado como vector de control. tasa de proliferación se determinó mediante el ensayo de MTT.
NF-kB inactivado células PC3 C4-2B-KD-KD y fueron injertados en los huesos de ratones por inyección intratibial.