Extracto
Objetivo
El objetivo del presente estudio fue examinar la apoptosis efectos y mecanismos de éter monometílico de hematoporfirina -promover (HMME) terapia -sonodynamic (SDT) en las células de cáncer de endometrio
in vitro
.
Métodos
muestras de células de cáncer de endometrio se dividieron en cuatro grupos: 1) grupo control no tratado, 2) grupo HMME, 3) grupo puro ultrasonido, y 4) HMME combinado con ultrasonidos, es decir, grupo de SDT. método de CCK-8 se utilizó para evaluar el efecto inhibidor de SDT sobre la proliferación de células de cáncer de endometrio. microscopio óptico de campo y microscopía electrónica de transmisión de emisión se utilizaron para caracterizar los cambios en la morfología de las células cancerosas inducidas por los tratamientos. tasa de apoptosis, las especies reactivas de oxígeno (ROS) y el potencial de membrana mitocondrial (MMP) se examinaron por citómetro de flujo. La intensidad de fluorescencia se mide por microscopía de barrido láser confocal se usó para explorar la variación de ion de calcio intracelular (Ca
2 +) la concentración. proteínas relacionadas con la apoptosis implicados en ambas señalizaciones de apoptosis intrínsecos y extrínsecos se analizaron por Western blot.
Resultados
SDT puede inducir eficazmente la apoptosis de las células de cáncer de endometrio. En comparación con el ultrasonido que se conoce como un método anti-tumor eficaz, SDT conduce a una mejora significativa en la supresión de la viabilidad celular y la inducción de apoptosis, junto con modificaciones más notables en la morfología y la subestructura tanto en las células de cáncer de endometrio sensibles y resistentes de ultrasonido. Otros estudios revelan que el TED promueve la producción de ROS, induce la pérdida de MMP y aumenta intracelular de Ca
2 + concentración más eficientemente que HMME o ultrasonido solo. grupos SDT también muestran una alta expresión en lugar de las proteínas de la apoptosis, incluyendo la promoción de Bax, Fas y Fas-L, y una baja significativa expresión de las proteínas de la apoptosis, incluyendo la suspensión de Bcl-2 y survivina. caspse-3 Mientras tanto, tanto escindido y la caspasa-8 se han mejorado de manera espectacular en los grupos de SDT. Múltiples vías se ha propuesto en el proceso, incluyendo la activación intrínseca por la producción excesiva de ROS y la sobrecarga de Ca
2 +, el silenciamiento de genes survivina, y la vía extrínseca mediada por el receptor de muerte.
Conclusión
Dada su considerable eficacia tanto en las células sensibles y resistentes ultrasonido, SDT, por lo tanto puede ser un método terapéutico prometedor para el tratamiento de los cánceres endometriales
Visto:. Sun H, Ge W, X Gao, Wang S, S Jiang, Hu Y, et al. (2015) Efectos de la hematoporfirina monometil éter-Sonodynamic Terapia (HMME-SDT) en cáncer endometrial apoptosis Promotoras. PLoS ONE 10 (9): e0137980. doi: 10.1371 /journal.pone.0137980
Editor: Eric Asselin, Universidad de Quebec a Trois-Rivières, Canada |
Recibido: 29 Diciembre, 2014; Aceptado: July 29, 2015; Publicado: 14 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Sun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 30872650); Programa para el Nuevo Siglo talentos excelentes en la Universidad de China (Subvención Nº NCET-09-0131); MI reconoce el apoyo financiero del Programa de Reclutamiento de Global jóvenes expertos, China
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de endometrio es uno de los tumores malignos ginecológicos comunes, tratados tradicionalmente por cirugía y suplementados por la quimioterapia y la radioterapia, que, desgraciadamente, tienen un más bien baja sensibilidad a la fase temprana o metastásico del cáncer de endometrio, normalmente acompaña con efectos secundarios significativos [1-2]. Hasta el momento, todavía es una cuestión abierta que tan temprano del cáncer de endometrio puede ser tratada conservando la fertilidad. Y no hay ningún informe en la literatura sobre la conservación de órganos para los pacientes en una fase intermedia o avanzada. Obviamente, un enfoque eficaz con baja toxicidad es primordial.
La incitación de la apoptosis se prefiere en el tratamiento del cáncer [3]. Se ha demostrado que el ultrasonido puede causar apoptosis de una gran variedad de células, tales como células de leucemia mieloide, linfocitos y células de sarcoma [4-6]. Sin embargo, el efecto letal retrasado [7], junto con la eficacia ineficiente en las células tumorales resistentes a ultrasonido puede limitar en gran medida sus aplicaciones clínicas. Recientemente, como una combinación de ultrasonido y sonosensitizers, terapia sonodynamic (SDT) se ha convertido en un método anti-tumor no invasivo fascinante, con alta eficiencia y alta selectividad en las células tumorales y no evidente influencia sobre los tejidos normales adyacentes [8-10]. Entre los diversos agentes químicos aplicados en SDT, éter monometílico de hematoporfirina (HMME) es especialmente popular como un sonosensitizer debido a sus propiedades ópticas óptimas y la retención preferencial satisfactoria en el tejido [11]. Más importante aún, HMME tiene una tasa de absorción mucho mayor por el tumor que los tejidos normales [10], y esta alta selectividad asegura la energía de ultrasonidos que se centra específicamente en las células cancerosas.
La aplicación de SDT en tumores malignos ginecológicos es emergente rápidamente. Aunque un estudio anterior
in vitro
mostró que el TED metileno azul mediada puede aumentar significativamente las especies reactivas del oxígeno en las células de cáncer de ovario y por lo tanto inducir la apoptosis [12], los efectos del TED en el cáncer de endometrio todavía por explorar hasta ahora.
en este estudio, la influencia de HMME-SDT tanto en células de cáncer de endometrio sensibles y resistentes de ultrasonido se ha investigado
in vitro
. efectos y los mecanismos de apoptosis promotoras se discuten a la luz de la información disponible.
Materiales y Métodos
2.1. Cell Cultura y
líneas celulares de adenocarcinoma de endometrio humano Ishikawa y HEC-1-A se adquirieron de Shanghai Bogoo Biotecnología. Co., Ltd. Las células se cultivan en un RPMI 1640 (Hyclone, Thermo) que contiene suero de ternera fetal solución al 10% (Hyclone, Thermo) y se incubó en una incubadora saturada de humedad (HF240, Heal Force) a 37 ° C con 5% de CO
2. Los experimentos se llevaron a cabo cuando las células alcanzaron la fase de crecimiento logarítmico.
2,2. Cell Tasa de supervivencia
Las células en la fase logarítmica de crecimiento se colocaron en 0,25% de tripsina para la digestión y la centrifugación y se preparan en una suspensión de una sola célula con una concentración de 1 × 10
5 /ml. Después las células se sembraron en placas de 6 pocillos. Hubo cuatro grupos de la muestra como sigue: 1) grupo control sin tratar (control), 2) grupo HMME (HMME), 3) grupo de ultrasonido puro (ultrasonido), y 4) de ultrasonido combinado grupo HMME (SDT). Para el grupo de SDT, HMME se añadió una hora antes de la interferencia de ultrasonido, que fue de 1,0 W /cm
2 a 1 MHz durante 60 s para Ishikawa y 2,0 W /cm
2 a 1 MHz tratada 240 s para HEC- 1-a. Y la concentración final de HMME fue de 15 mg /ml para Ishikawa y 50 mg /ml para HEC-1-a. Una esponja húmeda se coloca entre la parte inferior de placa de cultivo y la sonda de ultrasonidos para evitar reflexiones múltiples de ultrasonido. Después de la irradiación, las células se digieren y se recogieron inmediatamente, luego se transfirieron a placas de 96 pocillos después de ajustar la concentración, con 100 l en cada pocillo. Dos horas más tarde, se añadieron 10 l Cell Counting Kit-8 de reactivo (CCK-8, Dojindo) a cada pocillo. Después de una hora de cultivo adicional, la absorbancia a 490 nm se midió utilizando un instrumento automático marca de enzima (Multiskan MK3, Thermo) [13].
2.3. Preparación para la caracterización de la Morfología celular y la subestructura
La morfología y el crecimiento de las células adherentes se observaron 6h después de los cuatro tratamientos diferentes mediante el uso de un microscopio invertido (Olympus CKX4). Las células se digirieron en tripsina al 0,25% para los 90, se lavó por solución salina tamponada con fosfato, después se centrifugó a 2000 r /min durante 5 min. Eliminar el sobrenadante, las células se fijaron entre 2,5% de glutaraldehído y ácido ósmico al 1%, se deshidrataron con etanol y acetona, se incluyeron en resina epoxi Epon812, y cortados por la máquina de cortar III ultra-fina. Las muestras fueron luego doble teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y luego caracterizados utilizando una emisión de campo microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEM-2010, JEOL).
2,4. Análisis Apoptosis
6h después de los tratamientos, las células de los cuatro grupos mencionados anteriormente se recogieron y se contaron, a continuación, conservan evitar la luz durante 15 minutos después de una adición de 10 l de isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con AnnexinV (20 microgramos /ml) durante 1 × 10
6 células. Después, se añadió 5 l de yoduro de propidio (PI) (50 mg /ml). Después de la reacción durante 5 min, 400 l de tampón de unión se mezcló. Las muestras fueron analizadas por citometría de flujo (BD FACSCanto) inmediatamente.
2.5. Especies reactivas del oxígeno (ROS) y mitocondrial potencial de membrana (MMP)
Después de la irradiación ultrasónica, las células se incubaron durante 2 h. 2'7'-diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA, Beyotime) y rodamina 123 (Sigma) con una concentración final de 10 mmol /L y 200 nmol /L se añadieron a cada muestra para la prueba de ROS y MMP. En ambos casos, las células se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2 evitar la luz durante 30 minutos. a continuación, la intensidad de fluorescencia se midió por un citómetro de flujo a una longitud de onda de excitación y emisión de 480 nm y 520 nm para la prueba de ROS, y 490 nm y 530 nm para la prueba de MMP, respectivamente.
2,6. Determinación de calcio intracelular (Ca) Concentración de Iones
células del cáncer endometrial de control y el grupo SDT se lavaron tres veces por solución de tampón fosfato, cargado por Fluo-3 /AM (Bio-Rad) con una concentración final de 10 mol /L a 37 ° C durante 45 min, y después se transfirieron a una pequeña ranura especial. La intensidad de fluorescencia se analizó mediante un microscopio láser confocal de barrido (Meridian, Insight-PlusIQ) a una excitación láser de argón de 488 nm. La libre Ca
2 + concentración en las células se calibró con la ecuación: [
Ca
2 +] =
K
d
[ ,,,0],(
F CD -
F
min) /(
F
max -
F
)], donde
K
d
es de 400 nmol
F
es el valor de fluorescencia relativa medida,
F
max es la
valor máximo de fluorescencia después de la adición de 10 mmol /L 4-Br-A23187 alta líquidos Ca (10 mmol /LK
2CaEGTA, 10 mmol /L de K-fregonas y 100 mmol /L de KCl, Bio-Rad Company),
F
min es el valor mínimo de fluorescencia después de la adición de 10 mmol /L de solución de 4-Br-A23187 Ca-libre [14]. Este es un método simple y de bajo costo relativo que normalmente se aplican para intracelular de Ca
2 + concentración.
2.7. La expresión de apoptótica relacionadas proteínas
proteínas relacionadas con la apoptosis se analizaron 24 h después de cada tratamiento por Western blot. Brevemente, las células se recogieron después de diferentes tratamientos. Las proteínas fueron separadas por el gel SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de PVDF, que fueron bloqueados en primer lugar con 5% de leche desnatada y después se incubaron con anticuerpos específicos tal como se indica en las figuras a 4 ° C durante la noche. Se añadieron los secundarios conjugados con peroxidasa de rábano después. La expresión de proteínas se visualizó por el sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Thermo Scientific Pierce).
2,8. Análisis estadístico
Todos los experimentos fueron reproducidos tres veces de forma independiente en las diferentes células. El SPSS versión 13.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois) se utilizó para el análisis de datos. Los datos se presentan como media ± desviación cuadrada (SD). La fecha se analizó mediante la prueba t para datos independientes. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
> 3.1.. Efecto de SDT en la tasa de supervivencia de las células de cáncer de endometrio
Con el fin de evaluar el efecto de SDT sobre la viabilidad celular, se aplicó un ensayo de CKK-8 a Ishikawa y HEC-1-a células tras diferentes tratamientos como se indica en la figura 1. La tasa de supervivencia se reduce con el tratamiento único de cualquiera de HMME o ultrasonido en tanto Ishikawa y células-a HEC-1 (Fig 1). Curiosamente, la viabilidad celular de las células de Ishikawa se reduce a 33,99 ± 4,06% con 1 MHz de ultrasonido (1,0 W /cm
2) durante 60 s; mientras que no hay inhibición evidente crecimiento se observa en HEC-1-a células en las mismas condiciones (Consulte la Figura S1 A). Además, se encontró que la viabilidad de las células de HEC-1-a células se mantiene no menos de 81,39 ± 4,83% tras el tratamiento incluso con ultrasonido más fuerte (2,0 W /cm
2) para una duración prolongada de 60 s a 240 s (Fig S1B). Esto indica directamente la sensibilidad de Ishikawa y la resistencia de HEC-1-A en el tratamiento de ultrasonido. Es importante destacar que, como se muestra en la figura 1, aunque ultrasonido inhibe la viabilidad celular de las células de cáncer de endometrio a diferente extender, la sinergia de ultrasonido con HMME puede consistente y sustancialmente despertar una gran parte mejorada efectividad matar, es decir, 165% y 115% que el de ultrasonido solo en HEC-1-a y las células de Ishikawa, respectivamente.
ensayo de CCK-8 se utilizó para evaluar las viabilidades de células en control, HMME, ultrasonido y los grupos de SDT en Ishikawa (a) y HEC-1-a (b ) Células. HMME o ultrasonido muestra un efecto inhibidor evidente en la supervivencia celular. SDT inhibe la viabilidad celular de manera más eficaz que cualquiera solo tratamiento. Los datos se presentan como la media ± SD (n = 3), ** P & lt; 0.01.
3.2. Efecto de SDT en la morfología y la subestructura de las células de cáncer de endometrio
Visto desde las imágenes de la figura 2, para los grupos de control y HMME, la mayoría de las células se cultivan de forma adherente y uniforme en una estructura de 'piedra de pavimentación ", que muestra el contorno claro, buena transparencia y vitalidad; mientras que las células de la ecografía y grupo SDT son poco transparentes, no unido firmemente o incluso suspendido, y la morfología de las células se convierte en parte circular.
La morfología y el crecimiento adherente de Ishikawa (a) y HEC-1-A se observaron las células (B) 6h después de los cuatro tratamientos diferentes mediante el uso de un microscopio óptico invertido (Olympus CKX4). Los grupos de control muestran células con contorno claro y buena transparencia adherente cultivan; ultrasonido y grupo SDT muestran células mal transparentes, que no están firmemente unidos o incluso en suspensión. La ampliación de las imágenes es de 40 veces, barra de escala = 100μm.
Más detalles se pueden explorar a partir de las imágenes de TEM en la figura 3. Se ha encontrado que las células del grupo de control y HMME poseen intacta las membranas celulares y nucleares, las estructuras de orgánulos y estructuras claras mitocondrial completo sin modificación obvia. Con respecto al grupo de ultrasonido, el núcleo de la célula de la cromatina es, obviamente, en espiral o congelado y marginados; las mitocondrias se hinchan, se deforma y vacuolar, y se aumenta el lisosoma, que son todas las indicaciones hacia la apoptosis celular. Para el grupo de SDT, fenómenos típicos de la apoptosis ya se puede observar desde las células, donde los núcleos se encuentran bajo picnosis obvia en una estructura de bloques heterogéneos, mostrando pequeños cuerpos apoptóticos, lagunas perinuclear agrandados y poros nucleares, aparato de Golgi ampliado y retículo endoplasmático bajo la desgranulación, así como borrosa o desaparecido crestas mitocondriales. Algunas células muestran incluso gránulos de glucógeno acumulado en su citoplasma celular con un volumen reducido.
La subestructura de los cuatro grupos de células se caracterizó por microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEM-2010, JEOL). (A) control y (b) grupo HMME, mostrando membrana intacta celular y la membrana nuclear, estructura orgánulo claro y la estructura mitocondrial completo sin modificación obvia; (C) grupo de ultrasonido, mostrando tendencia a la apoptosis de las células, incluyendo la cromatina en espiral o congelado y marginados celular núcleo, mitocondrias y deforme vacuolar y el aumento de lisosoma; (D) Grupo de SDT, mostrando los fenómenos típicos de la apoptosis, en donde los núcleos están bajo picnosis obvio en una estructura de bloques heterogéneos, con pequeños cuerpos apoptóticos, brecha ampliada perinuclear y de poro nuclear, aparato de Golgi expandido y retículo endoplasmático bajo la desgranulación, así como borrosa o desaparecido crestas mitocondriales. La barra de escala en todas las imágenes es de 2 micras.
3.3. Efecto de SDT en ROS Generación y reducción de MMP
Como se muestra en la figura 4, la tasa de apoptosis de SDT, ultrasonido, HMME y el grupo de control es 96,66 ± 0,45%, 91,21 ± 3,44%, 4,75 ± 1,10% y 0,42 ± 0,35%, respectivamente, en las células de Ishikawa y 67,54 ± 12,65%, 18,88 ± 3,73%, 43,50 ± 5,02% y 3,09 ± 1,37%, respectivamente, en HEC-1-a células. La apoptosis inducida está inversamente correlacionada con la viabilidad celular determinada por CCK-8 de ensayo en los cuatro grupos diferentes (Fig S1 y Figura 4), lo que sugiere que la apoptosis es uno de los principales mecanismos que atribuyen a la viabilidad celular baja sobre los tratamientos. Las tasas de apoptosis en grupos SDT se aumentó significativamente en comparación con cualquiera de HMME o tratamiento ultrasonido solo tanto en las células de Ishikawa (p & lt; 0,05, Fig 4B) y HEC-1-a células (P & lt; 0,01, Fig 4D). Sin embargo, SDT promueve principalmente apoptosis temprana en las células de Ishikawa (Fig 4A), mientras que más tarde apoptosis en HEC-1-un caso (Fig 4C).
Los niveles de apoptosis son mucho más altos en los grupos de SDT que el control, HMME o grupos de ultrasonido en Ishikawa células y HEC-1-a (C y D) (a y B). perfiles FACS representativos se muestran en A y C. Histogramas presente media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (B y D, * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01) guía empresas
intracelular de ROS son importantes mediadores de la apoptosis [15]. Para entender si la apoptosis inducida SDT se debe a la producción de ROS, los niveles de ROS fue visualizado por el DCF-A, una sonda que emite fluorescencia cuando se oxida. Se ha encontrado que entre los cuatro grupos diferentes, SDT puede aumentar más significativamente los niveles de ROS en tanto Ishikawa y HEC-1-a células (P & lt; 0,01, Fig 5). En comparación con el ultrasonido, la tasa de generación de ROS de grupos SDT se incrementan hasta 1,48 veces en las células de Ishikawa (p & lt; 0,01) y 4,7 veces en la HEC-1-a células (p & lt; 0,01), respectivamente
los niveles de ROS se han mejorado significativamente en los grupos de SDT en comparación con el control, HMME, y los grupos de ultrasonido en Ishikawa (a y b) las células y HEC-1-a (C y D). perfiles FACS representativos se muestran en A y C. Histogramas presente media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (B y D, ** P & lt;. 0,01) guía empresas
Enhanced ROS pueden inducir cambios de MMP, que fomenta aún más la apoptosis progresión [16]. El potencial de membrana mitocondrial se mide de este modo de las células tratadas con rodamina. Como se muestra en la figura 6, una ligera disminución de MMP se observa en grupos HMME y ultrasonido, tanto para Ishikawa y HEC-1-a células. Es importante destacar que, la pérdida de MMP se hace mucho más evidente en el grupo de SDT en comparación con los grupos de tratamiento de mono en ambas líneas celulares implicados. (P & lt; 0,01)
Ishikawa (ayb) y HEC-1-a (C y D) fueron sometidas a cuatro tratamientos diferentes: control, HMME, ultrasonido y SDT. La pérdida de la MMP fue más evidente en el grupo de SDT que los otros grupos. perfiles FACS representativos se muestran en A y C. Histogramas presente media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (B y D, ** P & lt; 0,01).
3.4. Efecto de SDT en intracelular Ca Concentración de Iones
Como se indica en la figura 7 y en la Tabla 1, la concentración de iones Ca en las células del endometrio de Ishikawa para el control, HMME, ultrasonido y el grupo de SDT es de 92.533 nmol, 204.539 nmol, 2991.485 nmol y 3455.750 nmol respectivamente. Aparentemente, intracelular de Ca
2 + concentración por tratamiento de ultrasonidos se puede aumentar a 32,3 veces en comparación con la del grupo de control, y SDT puede inducir un aumento adicional de la concentración en aproximadamente 37,3 veces.
fluorescencia intensidad de las células de cáncer de endometrio Ishikawa 1 h después de los tratamientos se analizó mediante un microscopio láser confocal de barrido (Meridian, Insight-PlusIQ) a una excitación láser de argón de 488 nm. (A) Control y (b) grupo SDT, que muestra la concentración de ion de calcio intracelular en SDT es mucho mayor que en el grupo de control.
3,5. Efecto de SDT en la expresión de proteínas apoptóticas-relacionadas
A fin de comprender los mecanismos moleculares de la apoptosis inducida por SDT, la activación de la caspasa-3 y caspasa-8 se detectó por primera vez por el Western Blot después de diferentes tratamientos. Como se muestra en la figura 8, tanto exfoliados caspasa-3 y caspasa-8 se han mejorado significativamente en los grupos de SDT, sugiriendo ambos casapses se activan en el tratamiento. Además, la survivina proteína anti-apoptótica de Bcl-2 y se reducen y la pro-apoptótica Bax se incrementa con SDT. Además, los marcadores de vía del receptor de muerte, tales como Fas y Fas-L, también se han mejorado por SDT (Fig 8). Estos datos en conjunto sugieren que ambas vías intrínseca y extrínseca han estado involucrados en la apoptosis inducida por SDT
Ishikawa (a) y HEC-1-a (b) se sometieron a cuatro tratamientos diferentes:. De control, HMME, ultrasonido y SDT. marcadores relacionados con la apoptosis se detectaron por transferencia de Western con anticuerpos específicos tal como se indica. β-actina se utilizó un control de carga.
Discusión
Aunque la ecografía ha sido considerado como un tratamiento eficaz para el cáncer, matando a efectos insatisfactorios haber sido sugerido por HEC-1-a células en este estudio como por el trabajo previo [7]. Es importante destacar que, SDT no sólo actúa de manera eficiente en células sensibles a los ultrasonidos de Ishikawa, y también los ultrasonidos HEC-1-a células resistentes, lo que indica que SDT puede tener aplicaciones en una gama más amplia de las células cancerosas. El efecto pro-apoptosis sinérgico por la combinación de HMME y la ecografía en el cáncer de endometrio se puede atribuir a dos factores, es decir, la alta eficiencia de HMME como sonosensitizer y el efecto letal de la ecografía.
SDT tiene normalmente dos matanza modos en las células tumorales, es decir, necrosis y la apoptosis [17]. El cambio dominante apoptótica como de la morfología celular y la subestructura se muestra en el microscopio invertido y las imágenes de TEM señala que la apoptosis es la forma principal de muerte de las células de cáncer de endometrio en el presente caso. En base a los resultados experimentales, se proponen posibles mecanismos de SDT sobre la apoptosis de las células de cáncer de endometrio como siguiente:
(1) Pérdida de MMP por la generación de ROS y Bcl-2 alternancia familia puede ser una de la apoptosis inducida por SDT vías.
se puso de manifiesto que las ROS en las células tratadas por SDT es más excesiva entre todas las muestras. En condiciones normales, las células mismas pueden eliminar continuamente pequeñas moléculas generadas durante la respiración aeróbica, incluyendo oxígeno singlete [18,19]. Sin embargo, en un estado de desequilibrio, ROS intracelular puede ser acumulado, el daño de la membrana mitocondrial y reducir el potencial de membrana [20-22]. Esto es consistente con los resultados experimentales, donde se observaron la tasa de generación de ROS más significativo y la tasa de reducción de MMP simultáneamente en grupos SDT. Además, el potencial de membrana mitocondrial también está sujeta a la regulación de Bcl-2 miembros de la familia. En este estudio, miembro de la familia Bcl-2 Bax se incrementa y Bcl-2 se redujo en los grupos de SDT. El aumento de Bax puede así formar homodímeros Bax /Bax o antagoniza el efecto anti-apoptosis de Bcl-2 a través de la formación de Bax /Bcl-2 heterodímeros en la membrana externa de la mitocondria [23]. Tales cambios pueden aumentar la permeabilidad de la membrana de modo que los factores que promueven la apoptosis, tales como el citocromo c, se liberan de la mitocondria al citosol, donde se desencadenan cascadas de caspasas y, finalmente, conducen a la apoptosis de las células de cáncer de endometrio. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el exceso de ROS y cambios en los miembros de la familia Bcl-2 en SDT pueden activar la vía de la apoptosis intrínseca al afectar los potenciales de membrana mitocondrial.
(2) La sobrecarga de iones de Ca en las células pueden ser otro factor intrínseco importante para la apoptosis de las células en el TED.
la sobrecarga de iones Ca implica varios procesos de apoptosis, en particular los de regulación aguas arriba. iones Ca se almacenan normalmente en el retículo endoplásmico. El estrés del retículo endoplásmico debido a la excesiva ROS [14] puede aumentar Ca
2 + capacidad de almacenamiento de células, así como la velocidad de liberación de Ca
2 + en las células. Como se ha demostrado por los presentes resultados microscopio confocal, Ca
2 + sobrecarga en las células es bastante severo para el grupo de SDT. Desde la liberación de citocromo c tiene una retroalimentación positiva sobre el Ca
2 + concentración [24-26], el Ca
2 + sobrecarga en SDT puede ser otro estimulante para la gran liberación de citocromo c, que a su vez activa caspasa-3 e inducir la apoptosis de las células como se ha mencionado anteriormente.
(3) SDT puede silenciar eficazmente gen sobrevivir.
Recientemente, se ha demostrado que la tasa de expresión de survivina en el carcinoma endometrial tejido es (100%) superior a la de la hiperplasia endometrial más largo (73%) [27], lo que implica que la survivina puede estar estrechamente asociada a la transformación maligna de endometrio. Más importante aún, el trabajo anterior ha señalado que la proteína survivina supervivencia puede inhibir fuertemente la apoptosis estimulada por diversos factores [28]. por lo tanto, Silenciamiento de survivina puede romper la protección y favorecer la apoptosis de las células cancerosas. En este trabajo, SDT se ha demostrado ser una forma eficaz para suprimir este gen, lo que lleva a una expresión extraordinariamente debilitada de la survivina y la activación más eficaz de la caspasa-8 y la caspasa-3 en comparación con los otros tres grupos.
(4) y la vía extrínseca puede ayudar a los factores intrínsecos de la apoptosis en el TED.
la presencia de Fas /Fas-L es un signo de la vía extrínseca de la apoptosis mediada por receptores de muerte donde los actos de caspasa-8 como un importante caspasa iniciación y la caspasa-3 es la caspasa ejecutivo. Nuestros resultados muestran que las proteínas del receptor de muerte Fas /Fas-L aumentaron significativamente en los grupos de SDT y tanto la caspasa-8 y la caspasa-3 se activan con el mismo tratamiento, lo que indica directamente la activación de las vías de apoptosis extrínsecos en respuesta a SDT.
en resumen, SDT puede inhibir significativamente la proliferación de células de cáncer de endometrio, mucho más eficaz que HMME o ultrasonido solo tanto en las células sensibles y resistentes de ultrasonido. La apoptosis inducida por HMME-SDT involucra múltiples vías, incluyendo la vía intrínseca de apoptosis activada por la generación de ROS, la reducción de MMP y Ca
2 + sobrecarga, el silencio efectiva del gen survivin, junto con la vía de la apoptosis mediada por Fas extrínseca l-Fas /. Teniendo en cuenta la notable eficacia tanto en las células sensibles y resistentes ultrasonido, HMME-SDT, por tanto, puede haber abierto un nuevo camino de rehabilitación para pacientes que no pueden sobrevivir de la cirugía, la radioterapia o la quimioterapia, y que requieren órganos preservando e incluso las funciones reproductivas.
Apoyo a la Información
S1 Fig. sensibilidad ultrasonido de las células de cáncer de endometrio analizados por CKK-8 ensayos.
(a) Ishikawa y HEC-1-a células se trataron con ultrasonidos (1 MHz) a la intensidad de 1,0 W /cm
2 de 60 s y después se somete a un ensayo de CKK-8. Ishikawa es más sensible a tratamiento con ultrasonidos de HEC-1-a. Los datos se presentan como la media ± SD (n = 3), ** P & lt; 0.01. (B) El ultrasonido resistentes HEC-1-a células se trataron con ultrasonidos a una mayor intensidad de 2,0 W /cm
2 por 0 s, 60 s, 120 s, y 240 s, respectivamente. Una inhibición de la viabilidad celular ligero y dependiente del tiempo se observa con los tratamientos. Los datos se presentan como la media ± SD (n = 3)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0137980.s001 gratis (TIF)