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PLOS ONE: La atenuación de Ef quinasa del receptor de activación en las células cancerosas por coexpressed Efrina Ligands


Extracto

Los receptores tirosina quinasas median señales Ef juxtacrine interactuando "en
trans
" con ligandos anclados al la superficie de las células vecinas a través de un anclaje GPI (ephrin-As) o un segmento transmembrana (ephrin-B), que conduce a la agrupación de receptores y aumento de la actividad quinasa. Adicionalmente, las formas solubles de los ligandos ephrin-A liberados de la superficie celular por metaloproteasas de la matriz también pueden activar la señalización de receptores EphA. Además de éstos
trans
interacciones, estudios recientes han revelado que los receptores Eph y efrinas expresadas simultáneamente en las neuronas también pueden participar en asociaciones lateral "
cis
" que atenúan la activación del receptor por efrinas en
trans
con consecuencias funcionales críticos. A pesar de la importancia del sistema /ephrin Ef en la tumorigénesis, Ef-ephrin receptor de
cis
interacciones no han sido investigados previamente en células cancerosas. Aquí nos muestran que en las células cancerosas, coexpressed ephrin-A3 puede inhibir la capacidad de EphA2 y EphA3 de obligar efrinas en
trans Opiniones y se activan, mientras que ephrin-B2 puede inhibir no sólo EphB4 sino también EphA3. El
cis
inhibición de EphA3 por ephrin-B2 implica que en algunos casos efrinas que no se puede activar un receptor particular en Ef
trans
, sin embargo, puede inhibir su capacidad de señalización a través de
cis
asociación. También se encontró que una mutación identificada en EphA3 realza con cáncer de pulmón
cis
interacción con ephrin-A3. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo que puede contribuir a la patogénesis del cáncer mediante la atenuación del tumor efectos del receptor Eph vías activadas por efrinas en
trans
señalización supresión.

Visto: Falivelli G, Lisabeth EM, de la Torre ER, Pérez-Tenorio G, Tosato G, Salvucci O, et al. (2013) La atenuación de la quinasa del receptor Eph activación de las células cancerosas al coexpressed Ephrin ligandos. PLoS ONE 8 (11): e81445. doi: 10.1371 /journal.pone.0081445

Editor: Renping Zhou, Universidad de Rutgers, Estados Unidos de América

Recibido: 7 Agosto, 2013; Aceptado: 21 Octubre 2013; Publicado: 29 Noviembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Falivelli et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones P01CA138390 y P01HD025938, conceder 18XT-0099 del Programa relacionados con el tabaco de Investigación de Enfermedades (EBP), una beca postdoctoral de la Fundación española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT, ERT), Institutos nacionales de la post-doctoral de la Salud formación T32CA121949 concesión y post-doctorado 20FT-0076 desde el DNR relacionados con el tabaco Programa de Investigación de Enfermedades (EML), y post-doctorado 2009-7360 del Consejo Sueco de Investigación (GP). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

los miembros de la gran familia de la tirosina quinasa del receptor Eph, y en particular EphA2 y EphB4, se sobreexpresan en una amplia variedad de tipos de tumores [1,2]. receptores Eph señal mediante la interacción "en
trans
" con efrinas expresa en las células vecinas, que promueve la agrupación de receptores, la autofosforilación y la actividad quinasa [3]. Las formas solubles de los ligandos ephrin-A liberados de la superficie celular por metaloproteasas de la matriz también pueden activar los receptores EphA [4-7]. Sin embargo, los receptores Eph en células de cáncer son a menudo mal tirosina fosforilados [3]. Esto sugiere la activación bajo por ligandos ephrin y es consistente con el tumor efectos reportados para un número de receptores de Eph vías de señalización corriente abajo [1,8,9] supresión.

La falta de activación sustancial del receptor Eph es en algunos casos debido a la baja expresión de ephrin ligandos en las células cancerosas con alta expresión del receptor [1,10-13]. Además, varios otros mecanismos pueden mantener Ef bajo la activación del receptor en células de cáncer que también expresan ligandos ephrin. Por ejemplo, las mutaciones de cáncer se han demostrado que alteran la capacidad o la actividad de la quinasa de receptores Eph [14,15] unión ephrin. Por otra parte, la falta de adhesión célula-célula E-cadherina-dependiente puede poner en peligro la activación del receptor de EphA2 en células de cáncer de mama, lo que sugiere ineficiente EphA2
trans
interacción con efrinas [16]. Otro mecanismo potencial para atenuar receptor Eph de señalización corriente abajo en las células cancerosas podría implicar inhibitoria lateral
cis
interacciones entre los receptores Eph y las efrinas coexpressed en las mismas células [2,17,18]. Inhibitoria
cis
interacciones con efrinas han demostrado que desempeñan un papel importante en la regulación fina activación del receptor Eph en el sistema nervioso para controlar con precisión la búsqueda de caminos axón y la función sináptica [1,18-21]. Sin embargo,
cis
interacciones no ocurren en todas las neuronas que coexpresan receptores y efrinas Ef porque en algunos receptores de las neuronas y ligandos ocupan distintos microdominios de la membrana plasmática y por lo tanto no pueden entremezclarse [20,22]. Ya sea
cis
interacciones entre los receptores y efrinas también pueden ocurrir en las células cancerosas Ef no se ha investigado previamente.

Los estudios bioquímicos y estructurales han demostrado que
cis
interacción implica una Ef interfaz de unión distinta de la del receptor-ephrin mediar en la interacción de alta afinidad en
trans
[18,23]. La región extracelular de ambas clases de receptores EphA y EphB contiene un dominio de unión a ligando N-terminal, una región rica en cisteína y dos dominios de fibronectina de tipo III [3]. El segundo dominio de fibronectina es seguido por un segmento de transmembrana y una región citoplasmática que incluye el dominio de la tirosina quinasa, un dominio SAM y un motivo de unión PDZ. Las efrinas consisten en un dominio de unión al receptor Eph N-terminal conectada por una región de engarce corto a un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) para el ephrin-As y un segmento transmembrana seguido de una corta región citoplásmica para la ephrin-B. en unión del receptor Ef-ephrin
trans
se centra principalmente en la interacción entre el bucle G-H de la ephrin y un bolsillo dentro del dominio de unión a ligando del receptor Ef [24]. Estas interfaces predominantemente soporte a las interacciones de los receptores Eph promiscuos con efrinas pertenecientes a la misma clase A o B. Por otro lado,
han propuesto cis
interacciones involucrar a la fibronectina de tipo III dominios del receptor Eph y una región del dominio de unión al receptor de la ephrin que es distinta de la de bucle GH [18,23 ].

Aquí nos muestran que los receptores Eph y efrinas expresadas simultáneamente en las células cancerosas pueden participar en
interacciones cis
que inhiben la activación del receptor Eph por efrinas en
trans
. Curiosamente, se detectó inhibición de la activación a través de EphA3
cis
interacción no sólo con ephrin-A3 pero también ephrin-B2, que no es un ligando activador para EphA3 [25], lo que sugiere que
cis
interacciones no exhiben la misma selectividad de receptor-ligando como
trans
interacciones. También se encontró que una mutación cáncer de pulmón identificado en la repetición segundo de fibronectina de tipo III de EphA3 mejora la
cis
asociación del receptor con ephrin-A3.

Resultados

Efrina-A3 co-expresión en células de cáncer atenúa la activación de los receptores EphA en trans por soluble ephrin-A3

Para investigar el efecto de la co-expresión de ephrin receptor Eph de señalización en el cáncer células, se examinaron EphA3 (un receptor Eph para el que inhibidora
cis
interacciones con ephrin-Como han sido ampliamente estudiados en las neuronas [17,18,20]) y EphA2 (el receptor EphA expresa más ampliamente en las células cancerosas [1,26-28], pero para los que los efectos de
cis
interacciones no fueron investigados con anterioridad). Estamos infectados la líneas celulares de cáncer de pulmón A549 NCI-H226 y con lentivirus que codifica EphA3 y ZsGreen de una transcripción bicistrónico o solamente ZsGreen como control. Después de la selección por FACS clasificación, se infectaron las células con más lentivirus que codifican ephrin-A3 etiquetados con mCherry o solamente mCherry como control, seguido de la selección. Las dos líneas celulares de cáncer lentivirally infectados, que no expresan EphA3 endógena detectable o ephrin-A3 (Figura 1), se trataron a continuación con ephrin-A3 Fc (una forma soluble del ligando ephrin-A3 fusionado a la porción Fc de la IgG humana
1) para activar EphA3 través ephrin unión en
trans
. Efrina-A3 Fc aumentó la fosforilación de tirosina del receptor en las células que coexpresan EphA3 con control de mCherry, como se esperaba, pero no en las células que coexpresan EphA3 con mCherry-ephrin-A3 (Figura 1A, B). Efrina-A3 coexpresión también atenúa la activación inducida por Fc ephrin-A3 de EphA2 endógeno en células A549 (Figura 1C). Por lo tanto, en células de cáncer de pulmón, coexpressed ephrin-A3 puede inhibir EphA2 y la activación EphA3 por ligandos ephrin.

(A, B) células de cáncer NCI-H226 y de pulmón A549 se infectaron con una codificación EphA3 lentivirus y ZsGreen solo o junto con una codificación de lentivirus mCherry-ephrin-A3; control de las células fueron infectadas con lentivirus codificación ZsGreen y mCherry. inmunoprecipitados EphA3 se probaron por inmunotransferencia para fosfotirosina (PTyr) y se volvió a sondear para EphA3. Los lisados ​​se probaron para mCherry-ephrin-A3 con un anticuerpo anti-dsRed que también reconoce mCherry, por EphA3, y para β-tubulina como control de carga. Los histogramas muestran medios normalizados ± SE cuantificó a partir de 3 inmunotransferencias en A y B. En uno de los experimentos A549 utilizados para la cuantificación, las células se estimularon con ephrin-A5 Fc. ** P & lt; 0.01 por una muestra prueba de la t para la comparación de las células-A3 ephrin Fc tratada que expresan tanto EphA3 y ephrin-A3 con las células tratadas con Fc ephrin-A3 que expresan sólo EphA3. De nota, los niveles de EphA3 fueron más altos en las células A549 co-expresión de ephrin-A3 /ephrin-B2 (véase también las Figs. 2A, 3B, 4A y 5C, D), lo que sugiere que este receptor puede estabilizarse por las efrinas coexpressed. células A549 (C) se infectaron con una codificación lentivirus mCherry-ephrin-A3 o mCherry como control. Inmunoprecipitada EphA2 endógeno fue determinada por inmunotransferencia para fosfotirosina (PTyr) y se volvió a sondear para EphA2. Los lisados ​​se sondaron con un anticuerpo anti-dsRed y β-tubulina como control de carga. El histograma muestra medias normalizadas ± SE cuantificó a partir de 3 inmunotransferencias. ** P & lt;. 0,01 por la prueba t de una muestra por la comparación de las células tratadas con Fc ephrin-A3 expresan o no expresan ephrin-A3

coexpresión con ephrin-A3 en células de cáncer deteriora la capacidad de EphA3 para unirse ephrin-Como en trans

para examinar si en las células cancerosas ephrin-A3 coexpresión deteriora la capacidad de EphA3 para unir ligandos ephrin-a en
trans
, se midió la unión de solubles formas de ephrin-A5 o ephrin-A3 fusionan con fosfatasa alcalina (AP) a NCI-H226 y células A549 que expresan EphA3 solo o junto con mCherry-ephrin-A3. Detectamos ephrin-A AP unión a células que expresan solamente EphA3 pero no a las células que coexpresan ephrin-A3 con EphA3 (Figura 2A). La inmunotransferencia verificó que ephrin-A3 coexpresión no disminuye los niveles de EphA3 generales (Figura 2A). La biotinilación de proteínas de la superficie celular, seguido de un ELISA en el que EphA3 fue capturado con un anticuerpo y su nivel de biotinilación se detectó con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) mostró que ephrin-A3 coexpresión no afecta a la fracción de EphA3 presente en la célula superficie (Figura 2B). Por lo tanto, coexpressed ephrin-A3 en células de cáncer de pulmón inhibe la unión a EphA3 en
trans
sin reducir la expresión EphA3 o localización en la superficie.

Se infectaron células de cáncer del NCI-H226 y de pulmón A549 (A) ephrin con una codificación EphA3 lentivirus y ZsGreen solo o junto con una codificación de lentivirus mCherry-ephrin-A3; control de las células fueron infectadas con lentivirus codificación ZsGreen y mCherry. Los histogramas muestran la unión de ephrin-A5 AP a las células NCI-H226 y ephrin-A3 AP a las células A549, revelando que ephrin-A3 coexpresión impide la unión de proteínas AP ephrin a EphA3. se muestran medias normalizadas de 2 experimentos (cada una con tres muestras) ± SE. ** P & lt; 0,01 por ANOVA de una vía y prueba post-hoc de Dunnett para la comparación con las células que expresan sólo EphA3. Las inmunotransferencias muestran expresión de EphA3, ephrin-A3, y β-tubulina como control de carga en los lisados ​​celulares, verificando que ephrin-A3 coexpresión no redujo los niveles de EphA3. De hecho, los niveles de EphA3 aparecieron mayor en las células A549 co-expresión de ephrin-A3. El espacio en blanco indica que la eliminación de un carril irrelevante. biotinilación (B) de la superficie celular seguido por un ELISA donde EphA3 fue capturado con un anticuerpo inmovilizado y su biotinilación detectada con estreptavidina-HRP revela una fracción similar de EphA3 en la superficie de células que expresan EphA3 solo o junto con ephrin-A3. El histograma muestra las medias de 2 experimentos (cada una con tres muestras) ± SE. La incubación con el doble de lisados ​​dio resultados similares, lo que indica que se logró la unión al anticuerpo inmovilizado en los pocillos EphA3 máxima. ** P & lt; 0,01 por ANOVA de una vía y prueba post-hoc de Tukey para la comparación con las células que expresan mCherry y ZsGreen; p & gt; 0,05 para la comparación de las células que expresan EphA3 con y sin ephrin-A3. (C) EphA3 Fc se utilizó para desplegables de medio condicionado y los lisados ​​de células A549 o H226 infectadas con los lentivirus indicados. Por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-dsRed, ephrin-A3 sólo se detectó en los lisados. Los menús desplegables también se probaron para Fc para verificar los niveles de EphA3 Fc. (D) las proteínas de superficie se biotina en células infectadas con lentivirus que codifican mCherry, mCherry-ephrin-A3, o mCherry-ephrin-A3 junto con EphA3 y ZsGreen. inmunoprecipitados mCherry-ephrin-A3 (con anti-dsRed anticuerpo) se probaron con estreptavidina-HRP, lo que demuestra los niveles de la superficie celular similares de ephrin-A3 expresaron solo o junto con EphA3. IgG, inmunoprecipitado de control con IgG no inmune. Los lisados ​​se probaron para mCherry-ephrin-A3 con el anticuerpo anti-dsRed.

Una posible explicación de estos resultados podría ser que solubles ephrin-A3 libera en el medio de cultivo por metaloproteasas de la matriz [4-6] competiría con ephrin-A3 AP por la unión al ligando vinculante EphA3 dominio. Para hacer frente a esta posibilidad, se utilizó el dominio extracelular de EphA3 fusionado con Fc para tirar hacia abajo ephrin-A3 del medio de cultivo o de las células lisadas en un volumen equivalente a la del medio de cultivo. Efrina-A3 podría ser detectado por inmunotransferencia en los menús desplegables de lisados ​​de células, pero no del medio de cultivo (Figura 2C), que indica que la gran mayoría de la ephrin-A3 permaneció asociada con las células durante el período de tiempo de 24 a 48 horas de nuestros experimentos. Además, se observó una sola banda mCherry-ephrin-A3 en las inmunotransferencias, por lo que es poco probable que una parte sustancial de la ephrin se escindió para generar una forma más pequeña restante asociado con las células mediante la unión a un receptor de EphA. La biotinilación de proteínas de la superficie celular seguido por la detección de la inmunoprecipitado biotinilado ephrin-A3 con estreptavidina-HRP confirmó que ephrin-A3 se localiza de manera similar en la superficie celular A549 cuando se expresa solo o junto con EphA3 (Figura 2D).

EphA3-ephrin-A3 interacción cis no requiere el dominio del receptor

Los estudios previos de unión a ligandos han demostrado que las interacciones cis requieren localización de la membrana del receptor Eph y el ephrin [18]. Por lo tanto, para examinar si el dominio de unión a ligando EphA3 es necesaria para
cis
interacción con ephrin-A3 o si el tipo III de fibronectina repeticiones son suficientes para mediar
cis
vinculante [18,23] , transfectadas transitoriamente células HEK293 que expresan de forma estable mCherry-ephrin-A3 con plásmidos que codifican EphA3 Delta N (una forma truncada de EphA3 que carece de la N terminal de dominio de unión al ligando y la región rica en cisteína) o de longitud completa EphA3. En experimentos coimmunoprecipitation con un anticuerpo anti-EphA3 que reconoce la región C-terminal del receptor, que hemos detectado asociación de ephrin-A3 con tanto de longitud completa y truncada EphA3 (Figura 3A). Esto confirma que el dominio de unión a ligando EphA3, que media la unión de alta afinidad
trans
, no es necesario que EphA3-ephrin-A3
cis
interacción. células

(A) HEK AD-293 fueron infectadas con un lentivirus de codificación mCherry-ephrin-A3 o mCherry como control. Posteriormente, las células fueron transfectadas con plásmidos que codifican EphA3 de longitud completa o una forma truncada que carece del dominio de unión al ligando y la región rica en cisteína (EphA3 Delta N). inmunoprecipitados EphA3 se sondaron con anti-ephrin-A3 antisuero y volvieron a sondar para EphA3, revelando que la asociación ephrin-A3 con EphA3 no requiere el dominio de unión a ligando EphA3. El histograma muestra medias normalizadas ± SE cuantificada de las inmunotransferencias de 2 experimentos. p & gt; 0,05 por una muestra prueba de la t para la comparación de ephrin-A3 unido a EphA3 Delta N o de longitud completa EphA3. las células (B) HEK AD-293 infectadas con un lentivirus de codificación mCherry-ephrin-A3, el mutante mCherry-ephrin-A3 E129K, o mCherry como control, se transfectaron con un plásmido que codifica EphA3 Delta N. inmunoprecipitados EphA3 se probaron para ephrin-A3 y reprobed para EphA3, revelando que la mutación E129K no suprime el
cis
interacción con EphA3. El histograma muestra medias normalizadas ± SE cuantificó a partir de 3 inmunotransferencias. p & gt; 0,05 por una muestra prueba de la t para la comparación de ephrin-A3 E129K frente ephrin-A3 de tipo salvaje unido a EphA3 Delta N. las células (C) HEK AD-293 fueron transfectadas con pcDNA3 de control, pcDNA3-ephrin-A3, o pcDNA3-ephrin-A3 E129K. El histograma muestra los medios de dos experimentos para la unión de AP EphA3 a ephrin-A3, confirmando que mutante ephrin-A3 E129K no se une EphA3 en
trans
. *** P & lt; 0,001 por ANOVA de una vía y la prueba post-hoc de Dunnett para la comparación con las células que expresan de tipo salvaje ephrin-A3. La inmunotransferencia muestra la expresión de ephrin-A3 y ephrinA3 E129K en los carriles cargados con cantidades iguales de lisados ​​totales. Cabe señalar que ephrin-A3 sobreexpresa en células HEK produce dos bandas, con la banda superior correspondiente al tamaño de la proteína de longitud completa maduro.

Para investigar el efecto de la mutación de la GH ephrin bucle, se analizó la mutación E129K en ephrin-A3. Esta mutación no impidió que el
cis
asociación de ephrin-A3 con EphA3 Delta N (Figura 3B), a pesar de que abolió la

interacción trans con EphA3 AP (Figura 3C). Estos resultados son consistentes con los obtenidos con el correspondiente mutante ephrin-A5 E129K, que también puede atenuar aún a través de
cis
fosforilación EphA3 interacción, así como mediada por EphA colapso del cono de crecimiento y guía de axones provocada por ligandos ephrin-A en
trans
[18,20]. Por lo tanto, EphA3 y ephrin-A3 pueden asociarse entre sí, incluso cuando carecen de las regiones que median la unión de alta afinidad
trans
, el apoyo a la participación general en el
cis
interacciones del Ef fibronectina tipo III dominios y una región ephrin distinto del bucle GH.

La mutación de cáncer de pulmón EphA3 G518L mejora la interacción con cis coexpressed ephrin-A3

estudios de secuenciación recientes han identificado mutaciones en EphA3 cáncer de pulmón y otros tipos de cáncer, y la caracterización funcional ha puesto de manifiesto que muchos de ellos son deficitarias mutaciones de función que inhiben la unión ephrin, la actividad quinasa y /o localización de la superficie celular, lo que sugiere un papel supresor de tumores de tipo silvestre EphA3 [14,15,29]. Una de las pocas mutaciones que no fueron encontrados en menoscabo de cualesquiera de las propiedades EphA3 examinados en un estudio previo, sino más bien ligero aumento de localización de la superficie celular EphA3, es la mutación en el dominio G518L segundo tipo III de fibronectina [14]. Desde G518 en EphA3 corresponde a un residuo conservado que en la estructura cristalina de EphA2-ephrin-A5 participa en el
cis
interfaz, hemos examinado si la mutación G518L podría afectar a la
cis
asociación de EphA3 con coexpressed ephrin-A3. Para centrarse en el papel de la interacción cis, se utilizó EphA3 Delta N o el mutante EphA3 Delta N G518L. coimmunoprecipitation experimentos utilizando células HEK293 que coexpresan mCherry-ephrin-A3 con EphA3 Delta N o el mutante Delta N G518L revelaron más ephrin-A3 asociado con el mutante (Figura 4A). Medición de ephrin-A5 AP unión se verifica que ephrin-A3 co-expresión con el de longitud completa mutante EphA3 G518 inhibe su capacidad para unirse efrinas en trans (Figura 4B). Estos resultados sugieren que la mutación G518L mejora la unión en EphA3-ephrin
cis Opiniones y apoya la implicación en el
cis
interfaz de la glicina conservada en el dominio de segundo tipo III de fibronectina [23].
células
(a) HEK AD-293 fueron infectadas con un lentivirus de codificación mCherry-ephrin-A3 o mCherry como control. Las células fueron luego transfectadas con EphA3 Delta N o el mutante EphA3 Delta N G518L. inmunoprecipitados EphA3 se sondaron con un antisuero anti-ephrinA3 y volvieron a sondar para EphA3. La mutación EphA3 G518L encuentran en el cáncer de pulmón aumenta la afinidad de la interacción lateral entre EphA3 y ephrin-A3. El histograma muestra medias normalizadas ± SE cuantificada de las inmunotransferencias de 3 experimentos. * P & lt; 0.05 por una muestra prueba de la t para la comparación de la mutante EphA3 Delta N G518 frente EphA3 Delta N. (B) células de cáncer de pulmón A549 se infectaron con un lentivirus de codificación EphA3 de tipo salvaje o el mutante G518L y ZsGreen solo o junto con una codificación de lentivirus mCherry-ephrin-A3; control de las células fueron infectadas con lentivirus codificación ZsGreen y mCherry. El histograma muestra la unión de células de ephrin-A3 AP (un experimento) y ephrin-A5 AP (2 experimentos), confirmando que ephrin-A3 coexpresión impide la unión de proteínas ephrin AP al mutante EphA3 G518L. se muestran medias normalizadas de 3 experimentos (cada uno con duplicados de las muestras) ± SE. *** P & lt; 0,001 por ANOVA de una vía y la prueba post-hoc de Tukey para la comparación de las células que coexpresan EphA3 y ephrin-A3 con las células que expresan únicamente EphA3 y para la comparación de las células que coexpresan EphA3 G518L y ephrin-A3 con las células que expresan únicamente EphA3 G518L. La inmunotransferencia de los lisados ​​celulares muestra la expresión de EphA3, ephrin-A3, y β-tubulina como control de carga.

coexpresión Efrina-B2 en células de cáncer no sólo atenúa EphB4 sino también la activación por ligando y EphA3 capacidad de unión en trans


Cis
interacciones entre la fibronectina tipo III dominios y Ef efrinas podrían haber selectividad distintiva en comparación con
trans
interacciones que implican el dominio y la unión ligando-Ef ephrin GH bucle [23]. Para investigar esto, se utilizó ephrin-B2, que no se une con alta afinidad al dominio de unión a ligando EphA3 [25]. Estamos infectados células de cáncer de pulmón A549 y células de cáncer de mama MCF7 con un lentivirus codificación ephrin-B2 fundido a EGFP y la primera examinado los efectos sobre EphB4 endógena, que se une al ligando ephrin-B2 en
trans
. Al igual que EphA2, EphB4 se expresa ampliamente en células de cáncer [1,30] y su capacidad para ser regulada por efrinas en
cis
no fue examinado anteriormente. Hemos encontrado que la expresión de ephrin-B2 inhibe la unión de AP ephrin-B2 a la superficie celular (Figura 5A) y la fosforilación de tirosina de EphB4 inducida en
trans
por ephrin-B2 Fc (Figura 5B). Por lo tanto,
cis
interacción con coexpressed ephrin-B2 inhibe la unión de
trans
y la activación de las células cancerosas ligando EphB4. Para examinar si EphA3 también puede ser regulada por
cis
interacción con ephrin-B2, se infectaron células de cáncer de pulmón A549 que expresan EphA3 con lentivirus que codifican EGFP-ephrin-B2 o solamente EGFP como control. Curiosamente, la co-expresión ephrin-B2 atenúa la activación EphA3 por ephrin-A3 Fc (Figura 5C) y se inhibe la capacidad de EphA3 de obligar ephrin-A5 AP sin disminuir los niveles de EphA3 generales (Figura 5D). expresión EphA3 sólo ligeramente aumentó la unión del dominio extracelular de AP ephrin-B2 a las células (Figura 5D), confirmando que ephrin-B2 no se une de manera eficiente a EphA3 en
trans
[25]. Estos resultados sugieren que aunque ephrin-B2 no es un ligando activador para EphA3, puede afectar a la función a través de EphA3
cis
interacción. Esto implica que las especificidades de unión que rigen
cis
y
trans
Ef interacciones receptor-ephrin no son lo mismo.

(A) El histograma muestra la unión de AP ephrin-B2 a las células A549 infectadas con lentivirus que codifica EGFP-ephrin-B2 o EGFP, revelando que la coexpresión ephrin-B2 inhibe ephrin-B2 AP unión a EphB4. se muestran medias normalizadas de 3 experimentos (cada una con tres muestras) ± SE. *** P & lt; 0,001 por la prueba t no pareada para la comparación de las células que expresan ephrin-B2 con células que no expresan ephrin-B2. La inmunotransferencia de los lisados ​​celulares muestra la expresión de EphB4, ephrin-B2 y β-tubulina como control de carga. (B) células de cáncer de pulmón A549 y células de cáncer de mama MCF7 fueron infectadas con lentivirus que codifica EGFP-ephrin-B2 o EGFP. inmunoprecipitados EphB4 se probaron por inmunotransferencia para fosfotirosina (PTyr) y se volvió a sondear para EphB4. Los lisados ​​celulares se probaron para ephrin-B2 con un anticuerpo anti-EGFP y para β-tubulina como control de carga. Los histogramas muestran medias normalizadas ± SE cuantificó a partir de 2 inmunotransferencias para cada línea celular. * P & lt; 0,05 por uno prueba de la t de la muestra para la comparación de las células Fc tratados ephrin-B2 que expresan ephrin-B2 con células que no expresan ephrin-B2. células A549 (C) se infectaron con un EphA3 lentivirus codificación y ZsGreen junto con una codificación de lentivirus EGFP-ephrin-B2 o solamente EGFP. Las células de control fueron infectadas con lentivirus codificación ZsGreen y EGFP. inmunoprecipitados EphA3 se probaron por inmunotransferencia para fosfotirosina (PTyr) y se volvió a sondear para EphA3. Los lisados ​​se probaron para ephrin-B2 con un anticuerpo anti-EGFP, así como para EphA3 y para β-tubulina como control de carga. El histograma muestra medias normalizadas ± SE cuantificó a partir de 2 inmunotransferencias. * P & lt; 0,05 por uno prueba de la t de la muestra para la comparación de las células-A3 ephrin Fc tratada que expresan ephrin-B2 con células que no expresan ephrin-B2. (D) Ephrin-A5 AP unión a EphA3 superficie celular es inhibida por la coexpresión ephrin-B2. El histograma muestra la media ± SE de 3 experimentos (cada uno con muestras por triplicado) para la unión de ephrin-A5 AP o AP ephrin-B2 a las células A549 utilizadas para el experimento en C. Para la unión ephrin-A5, ** P & lt; 0,01 por ANOVA de una vía y prueba post-hoc de Dunnett para la comparación con las células que expresan EGFP y EphA3; para AP ephrin-B2 de unión, ** p & lt; 0,01 mediante la prueba de t no pareada para la comparación de las células que expresan o no expresan EphA3. La inmunotransferencia de los lisados ​​celulares muestra la expresión de ephrin-B2, EphA3 y β-tubulina como control de carga, la verificación de que la coexpresión ephrin-B2 no redujo los niveles de EphA3. De nota, el doblete correspondiente a sobreexpresa ephrin-B2 no es debido a diferentes grados de glicosilación ligada a N debido a la eliminación de oligosacáridos ligados a N con la PNGasa-F endoglicosidasa de manera similar aumenta la movilidad SDS-PAGE de las dos bandas (no se muestra). Ya sea que la banda superior puede representar un formulario con oligosacáridos O-ligados [51] u otra modificación postraduccional que queda por determinar.

endógenos ephrin-Como atenuar la activación de EphA2 coexpresan en células de cáncer

Para investigar si efrinas endógenamente expresadas en las células cancerosas también pueden participar en
cis
interacciones que inhiben la activación de los receptores Eph endógenas expresadas simultáneamente, se optó por las líneas celulares de cáncer de mama SKBR3 y MCF7. Estas líneas expresan altos niveles de ligandos ephrin-A junto con EphA2 [11] (broadinstitute.org/ccle), aunque el receptor se expresa a niveles relativamente bajos, consistente con la expresión complementaria de receptores y efrinas Ef observado en muchas líneas celulares de cáncer [1]. Dado que tanto SKBR3 y MCF7 células expresan múltiples ligandos ephrin-A, que son ancladas a GPI, se utilizó la enzima específica de fosfatidilinositol fosfolipasa C (PI-PLC) para eliminar todos los ephrin-A partir de la superficie celular. En ambas líneas celulares, la eliminación de endógenas ephrin-A partir de la superficie celular dio lugar a la activación de EphA2 reforzada por ephrin-A1 Fc in
trans
en comparación con las células no tratadas (Figura 6 A, B). En contraste, el tratamiento con PI-PLC de las células Fc tratados de control de disminución de la activación de bajo EphA2 basal, lo que sugiere que endógeno ephrin-Como puede inducir algunos de activación EphA2. Desde ephrin-A1 se ha informado de que se escindió de la superficie de las células cancerosas por metaloproteasas de la matriz, también trataron células SKBR3 con el amplio espectro inhibidor de metaloproteasa de matriz GM-6001 [4,6,31]. El tratamiento con el inhibidor durante 24 horas aumentado aún más de la superficie celular asociada ephrin-A1. Sin embargo, no afectó sustancialmente la fosforilación de la tirosina de EphA2 inducida por ephrin-A1 Fc vinculante en
trans
, posiblemente debido a la ya elevada
cis
inhibición por los altos niveles de ephrin-A1 presente incluso en la ausencia de GM-6001. Por lo tanto, en el cáncer de células
cis
interacción con ligandos endógenos ephrin-A puede atenuar la activación de EphA2 por ephrin-A medida que se presentan en
trans
, apoyando el significado de
cis
interacciones en la patogénesis del cáncer.

(a) SKBR3 y (B) células de cáncer de mama MCF7 se trataron con PI-PLC para 4 horas y después se estimularon con ephrin-A1 Fc. inmunoprecipitados EphA2 se probaron por inmunotransferencia para fosfotirosina (PTyr) y se volvió a sondear para EphA2. Los lisados ​​sondeadas con anticuerpo anti-A1-ephrin verificar la eliminación de ephrin-Como por PI-PLC; β-tubulina verifica la igualdad de carga de los carriles. El sistema Odyssey LI-COR se utilizó para la detección y las imágenes en color se convierte a escala de grises con Photoshop. Los histogramas muestran los datos normalizados a partir de 3 experimentos diferentes * P & lt; 0,05 y *** p & lt; 0,001 por una muestra prueba de la t para la comparación de las células ephrin-A1 Fc estimuladas tratadas o no con PI-PLC. las células (C) SKBR3 se trataron con PI-PLC como en A o con el amplio espectro inhibidor de metaloproteasa de matriz GM-6001 durante 24 horas. Inmunoprecipitados de lisados ​​y se probaron como se indica.

Discusión

Las diferentes familias de receptores y ligandos asociadas a la superficie de células que median señales juntas juxtacrine interactuando en
trans
través uniones célula-célula pueden también, cuando se coexpresan en la misma superficie celular, interactuar lateralmente en
cis
[32]. Estos
cis
interacciones, las cuales han sido estudiados principalmente en el sistema nervioso y el sistema inmunológico, por lo general se atenúan las señales desencadenadas por los
trans
interacciones a través de mecanismos que en muchos casos no se comprenden bien [ ,,,0],32-34]. Estudios recientes han descubierto los roles funcionales clave para inhibitorios
cis
interacciones entre los receptores Eph y ligandos ephrin expresadas simultáneamente en las neuronas [17-21].

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