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PLOS ONE: La cirugía guiada por fluorescencia en combinación con la irradiación con UVC Curas metastásica del cáncer pancreático humano en ratón ortotópico Models

2014/10/24


Extracto

El objetivo de este estudio es determinar si la luz ultravioleta (UVC) irradiación en combinación con fluorescencia cirugía guiada por (FGS) puede erradicar el cáncer de páncreas metastásico humano en modelos ortotópico nude-ratón. Dos semanas después de la implantación ortotópica de MiaPaCa-2 células de cáncer de páncreas humanos, que expresan la proteína verde fluorescente (GFP), en ratones desnudos, la cirugía a la luz brillante (BLS) se realizó en todos los ratones portadores de tumores (n = 24). Después de BLS, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en 3 grupos de tratamiento; BLS-solamente (n = 8) o FGS (n = 8) o FGS-UVC (n = 8). Los tumores residuales fueron resecados utilizando un sistema de imágenes de mano portátil de navegación bajo la fluorescencia en los ratones tratados con FGS y FGS-UVC. El lecho de resección quirúrgica se irradió con 2,700 J /m
2 UVC (254 nm) en los ratones tratados con FGS-UVC. El área del tumor residual media después de FGS (n = 16) fue significativamente menor que después de BLS solamente (n = 24) (0,135 ± 0,137 mm
2 y 3.338 ± 2.929 mm
2, respectivamente;
p
= 0,007). El BLS ratones tratados habían reducido significativamente la supervivencia en comparación con los ratones tratados con FGS-UVC FGS- y tanto para la supervivencia libre de recaída (RFS) (
p Hotel & lt; 0,001 y
p Hotel & lt; 0,001 , respectivamente) y supervivencia global (OS) (
p Hotel & lt; 0,001 y
p Hotel & lt; 0,001, respectivamente). los ratones tratados con FGS-UVC había aumentado SSR y la SG en comparación con los ratones tratados sólo FGS-(
p = 0,008
y
p = 0,025
, respectivamente); con RFS duradera se curaron al menos 150 días que indican los animales. Los resultados del presente estudio sugieren que la irradiación con UVC en combinación con FGS tiene potencial clínico para aumentar la supervivencia

Visto:. Y Hiroshima, Maawy A, Zhang Y, Sato S, T Murakami, Yamamoto M, et al. La cirugía en combinación con la irradiación con UVC Curas metastásica del cáncer pancreático humano en modelos de ratón ortotópico (2014) guiada por fluorescencia. PLoS ONE 9 (6): e99977. doi: 10.1371 /journal.pone.0099977

Editor: G. Juri Gelovani, Wayne State University, Estados Unidos de América

Recibido: Enero 16, 2014; Aceptado: 20-may de 2014; Publicado: 12 Junio ​​2014

Derechos de Autor © 2014 Hiroshima y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Instituto Nacional del cáncer CA132971 subvención CA y CA142669 y subvenciones-en-Ayudas del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología para la Investigación fundamental (C) (# 23592018 japonesa a IE y#24592009 de KT ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes: los Yukihiko Hiroshima, Zhang Yong, Mako Yamamoto, Fuminari Uehara, Shinji Miwa, y Shuya Yano son filiales de AntiCancer Inc. Masashi Momiyama y Takashi Chishima eran ex afiliados de AntiCancer Inc. Robert M. Hoffman es un afiliado no asalariado de AntiCancer Inc. AntiCancer Inc. comercializa modelos animales de cáncer. No hay otros intereses en competencia. No hay patentes, productos en desarrollo, o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.

Introducción

La resección completa del tumor puede mejorar la supervivencia global de pacientes con cáncer de páncreas [1], que es actualmente 5% a los cinco años. recidiva metastásica a menudo se produce después de intentar la resección curativa del tumor primario, ya que todas las células cancerosas no se eliminan por el cirujano debido a la incapacidad para verlos. Haciendo tumores fluorescencia ofrece grandes ventajas para la detección de tumores durante la cirugía para lograr la resección completa [2]. Hemos demostrado previamente que la cirugía guiada por fluorescencia (FGS) para el cáncer de páncreas se redujo la carga tumoral residual y mejoró la supervivencia global y libre de enfermedad en los modelos de ratón [3] - [5]. Sin embargo, es difícil de eliminar toda la enfermedad microscópica incluso con FGS [5].

ultravioleta (UV) de irradiación de luz ha demostrado eficacia en diversos modelos de ratón en nuestro laboratorio in vitro e in vivo en las células cancerosas que expresan proteínas fluorescentes [6] - [10]. Hemos informado anteriormente de muerte de células cancerosas inducida por UV se encontró que era de longitud de onda y dependiente de la dosis, así como la línea celular dependiente, con UVC ser más eficaz [9]. In vitro, tan poco como 25 J /m
2 UVC irradiación mató aproximadamente el 70% de las células de osteosarcoma humano 143B que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) y proteína fluorescente roja (RFP). La muerte celular se inició aproximadamente a las 4 h después de la irradiación y continuó hasta las 10 h después de la irradiación. exposición UVC también suprimió el crecimiento de células de cáncer en ratones desnudos en un modelo de cáncer residual mínima (MRC) [7], [9]. También demostramos que murinos carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) y las células U87 glioma humano, que expresan GFP en el núcleo y RFP en el citoplasma, eran más sensibles a la luz UVC de LLC y U87 células no coloreadas, lo que sugiere que la expresión de proteínas fluorescentes en el cáncer de células pueden aumentar el efecto fotodinámico de UVC en las células cancerosas.

en el presente estudio, hemos demostrado que la irradiación con UVC utiliza para irradicate MRC después FGS es más eficaz para el cáncer de páncreas humano en modelos de ratón ortotópico de FGS solos y los resultados en las curaciones aparentes.

Materiales y Métodos

Establecimiento de green Fluorescent Protein Etiquetada línea celular de cáncer

Para la proteína fluorescente verde (GFP) transducción génica de las células cancerosas, 70% de confluencia células de cáncer de páncreas humano [11] 2-MiaPaCa, [12] se utilizaron. En resumen, las células se incubaron con una mezcla de precipitado 1:01 de los sobrenadantes retrovirales de células PT67-GFP que expresan el gen GFP unido al gen de resistencia a G418 y medio RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contiene 10% de bovino fetal suero (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT) durante 72 h. medio fresco fue repuesto en este momento. Las células se recogieron con tripsina /EDTA 72 h después de la transducción y se subcultivaron en una relación de 1:15 en el medio, que contenía 200 g /ml de G418 agente selectivo. El nivel de G418 se aumentó por etapas hasta 800 g /ml [11], [13] - [15].

Cell Cultura y
MiaPaCa-2-GFP y BxPC-3 [16 ] células de cáncer pancreático humanas se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. Las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en el aire. Las células se recogieron después de tripsinización y se tiñeron con azul de tripano (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Sólo las células viables que excluían azul de tripano se contaron con un hemocitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA).

Animales

atímicos
nu /nu
ratones desnudos (AntiCancer Inc. , San Diego, CA), de 4-6 semanas de edad, fueron utilizados en este estudio. Los ratones se mantuvieron en una instalación aislada en virtud de filtración HEPA. Los ratones se alimentaron con dieta para roedores de laboratorio tratada en autoclave. Todos los procedimientos quirúrgicos de ratón y de formación de imágenes se llevaron a cabo con los animales anestesiados por inyección intramuscular de una solución de 50% de ketamina, xilazina 38%, y 12% de maleato de acepromazina 0,02 ml. Se llevaron a cabo todos los estudios en animales con un Comité de Cuidado de Animales y el empleo AntiCancer Institucional (IACUC) de protocolo aprobado específicamente para este estudio y de acuerdo con los principios y procedimientos descritos en el Instituto Nacional de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales con el número de Aseguramiento A3873-1.

tumor subcutáneo de la célula Implantación
células
MiaPaCa-2-GFP se recogieron por tripsinización y se lavaron dos veces con medio libre de suero. Las células (2 × 10
6 en 100 l de suero libre de medio) se inyectaron por vía subcutánea a los 30 minutos de la vendimia, sobre la derecha y los flancos en ratones desnudos masculinos fueron. tumores subcutáneos se dejaron crecer durante 2-4 semanas hasta que lo suficientemente grande como para abastecer tumoral y la cosecha para la implantación posterior ortotópico.

tumor ortotópico Implantación

Una pequeña de 6 a 10 mm incisión transversal se hizo en el flanco izquierdo del ratón a través de la piel y el peritoneo. La cola del páncreas se expuso a través de esta incisión, y un fragmento de tumor individual (3-mm
3) a partir de tumores subcutáneos se suturó a la cola del páncreas usando 8-0 nylon suturas quirúrgicas (Ethilon; Ethicon Inc., NJ, EE.UU.). Al finalizar, la cola del páncreas se devolvió al abdomen y la incisión se cerró en una capa de nylon 6-0 usando suturas quirúrgicas (Ethilon) [17] - [19].

imagen de fluorescencia

el sistema Olympus Imaging OV100 de Pequeños Animales (Olympus Corp.), que contiene una fuente de luz MT-20 (Olympus Biosystems, Planegg, Alemania) y la cámara CCD DP70 (Olympus Corp., Tokio, Japón) [20] y la sistema de Dino-Lite imágenes (AM4113T-GFBW Dino-Lite Premier; AnMo Electronics Corporation, Taiwán) [21] y el microscopio MVX10-de trabajo de larga distancia (Olympus Corp.) [22], los ratones fueron utilizados para imágenes en directo. Todas las imágenes se analizaron con ImageJ v1.440 (National Institutes of Health).

resección del tumor y la irradiación con UVC

Dos semanas después de la implantación ortotópico de cáncer de páncreas MiaPaCa-2-GFP, de luz brillante se llevó a cabo la cirugía (BLS) a todos los ratones portadores de tumor (n = 24). El tumor de páncreas expuesta Se obtuvieron imágenes antes de la operación con el OV100 a un aumento de 0.14x. La resección del tumor pancreático primario se realizó bajo de campo brillante estándar utilizando el microscopio MVX10. Después de la operación, la cama de la resección quirúrgica fue fotografiada con la OV100 a un aumento de 0.56x para detectar tumor residual. Los ratones que se sometieron a BLS se asignaron al azar en 3 grupos de tratamiento: BLS-solamente (n = 8), FGS (n = 8), o FGS-UVC (n = 8) (Fig. 1). Los tumores residuales de los grupos o FGS FGS-UVC de ratones fueron resecados utilizando el sistema de imágenes de Dino-Lite en virtud de navegación de fluorescencia. Después de la terminación de FGS, la cama de la resección quirúrgica fue fotografiada con la OV100 a un aumento de 0.89x para detectar el cáncer microscópico mínima residual (MRC) [23]. La cama de la resección quirúrgica del grupo FGS-UVC de los ratones se irradió con 2.700 J /m
2 UVC (pico de emisión 254 nm) de la parte inferior de la cámara usando un transiluminador Benchtop 3UV (UVP, LLC, Upland, CA) . La incisión se cerró en una capa usando suturas quirúrgicas 6-0 de nylon. Después del tratamiento, los ratones se les permitió recuperarse en sus jaulas.

Dos semanas después de la implantación ortotópico de cáncer de páncreas MiaPaCa-2-GFP, la cirugía de luz brillante (BLS) se realizó en todos los ratones portadores de tumores (n = 24). Después de la operación, la cama de la resección quirúrgica fue fotografiada con la OV100 a un aumento de 0.56x para detectar tumor residual. Los ratones que se sometieron a BLS se asignaron al azar en 3 grupos de tratamiento: BLS-solamente (n = 8), FGS (n = 8), o FGS-UVC (n = 8). tumores residuales en ratones en los grupos de FGS y FGS-UVC fueron resecados utilizando el sistema de imágenes de Dino-Lite en virtud de navegación de fluorescencia. Después de la terminación de FGS, la cama de la resección quirúrgica fue fotografiada con la OV100 a un aumento de 0.89x para detectar el cáncer residual mínima micoscopic (MRC). La cama de la resección quirúrgica en los ratones en el grupo de FGS-UVC se irradió con 2.700 J /m
2 UVC (pico de emisión, 254 nm) de la parte inferior de la cámara usando un transiluminador Benchtop 3UV (UVP, LLC, Upland, CA).

imágenes no invasivas de recurrencia y progresión tumoral

para evaluar la recidiva y seguir la progresión del tumor después de la operación, no invasiva de imágenes semanal de todo el cuerpo de los ratones se realizó con la OV100 a un aumento de 0.14x, hasta el final del experimento.

anticuerpo monoclonal

los anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno carcinoembrionario (CEA) se adquirieron de RayBiotech, Inc. (Norcross, GA ). Los anticuerpos se conjugaron con el Kit de proteínas de etiquetado DYLITE 488 (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) según los fabricantes.

sensibilidad de las células no coloreado o fluorescente cáncer pancreático a la irradiación con UVC in vitro

Para comparar la eficacia de la irradiación con UVC en las células de cáncer de páncreas no coloreadas BxPC-3 o fluorescentes, BxPC-3 células fueron marcadas con anticuerpo anti CEA conjugado con DYLITE 488 (BxPC-3-Ab488) o GFP (BxPC-3 GFP). BxPC-3-GFP o BxPC-3-Ab488 o BxPC-3 células no coloreadas (10
3) se sembraron en medio de cultivo celular 100 l por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se irradiaron con UVC a diversas dosis (0, 25, 50 y 100 J /m
2) de un transiluminador Benchtop 3UV (UVP, LLC, Upland, CA). Veinte horas después de la irradiación UVC, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces. El número de células se determinó con un microscopio de fluorescencia IX71 (Olympus, Tokio, Japón).

Análisis estadístico

PASWStatistics 18.0 (SPSS, Inc) fue utilizado para los análisis estadísticos. área del tumor residual se expresan como media ± desviación estándar. de Student de dos colas
t-test
se utilizó para comparar las variables continuas entre los 2 grupos. Kaplan-Meier de supervivencia se utilizaron para la estimación de la supervivencia. Los resultados de supervivencia se compararon mediante pruebas de rangos logarítmicos. Un
p
valor. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo para todas las comparaciones

Resultados

FGS reduce significativamente el volumen del tumor, pero no erradica todas las células cancerosas residuales

BLS se realizó en todos los ratones portadores de tumor (n = 24). El tumor de páncreas expuesta Se obtuvieron imágenes antes de la operación con el OV100 a un aumento de 0.14x (Fig. 2A). Después de la operación, la cama de la resección quirúrgica fue fotografiada con la OV100 a un aumento de 0.56x (Fig. 2B) para detectar tumor resecado. Los ratones que experimentó BLS se asignaron al azar en 3 grupos de tratamiento; BLS-solamente (n = 8), FGS (n = 8), o FGS-UVC (n = 8) (Fig. 1).

Los paneles superiores son de campo claro (BF), y los paneles inferiores mostrar fluorescencia tumor. El tumor residual después de BLS se detectó claramente tanto con la OV100 a un aumento de 0.56x (B) y el Dino-Lite con un aumento de 30x (E). El tumor residual después de la FGS se detectó marginalmente ya sea con el OV100 a un aumento de 0.56x (C) o el Dino-Lite con un aumento de 30x (F). El OV100 a un aumento de 0.89x detecta claramente el tumor residual mínima después de FGS (D). (G) El área del tumor residual después de FGS fue significativamente menor que después de BLS. Todas las imágenes se realizaron mediciones de las zonas tumorales residuales utilizando ImageJ. **
p
. & Lt; 0,01

imágenes se realizó en los 24 animales después de BLS y antes de cualquier otro tratamiento. El área del tumor residual media de cada grupo fue de 3,46 ± 3,45 mm
2 (BLS), 3,26 ± 2,69 mm
2 (FGS) o de 3,30 ± 2,99 mm
2 (FGS-UVC). La extensión de la enfermedad residual fue estadísticamente equivalente.

En FGS, se utilizó el sistema de imágenes de mano portátil Dino-Lite (Video S1). Después de la terminación de FGS, la cama de la resección quirúrgica fue fotografiada con la OV100 a un aumento de 0.89x (Fig. 2D) para detectar microscópico MRC. MRC después BLS-sólo se detectó claramente tanto con la OV100 a un aumento de 0.56x (Fig. 2B) y el Dino-Lite con un aumento de 30x (Fig. 2E). MRC después de FGS se detectó marginalmente, ya sea con la OV100 a un aumento de 0.56x (Fig. 2C) o el Dino-Lite con un aumento de 30x (Fig. 2F). El OV100 a gran aumento (0.89x) podría detectar fácilmente microscópica MRC después FGS (Fig. 2D). El área del tumor residual media después de FGS (n = 16) fue significativamente menor que BLS-solamente (n = 24) (0,135 ± 0,137 mm
2 y 3.338 ± 2.929 mm
2, respectivamente;
p
= 0,007). Estos resultados sugieren que el FGS redujo significativamente el volumen del tumor residual después de sólo BLS, pero microscópica MRC permaneció en el lecho quirúrgico, incluso después de FGS.

UVC irradiación en combinación con FGS Curas metastásica del cáncer pancreático humano

los tumores recurrentes fueron detectados con formación de imágenes de todo el cuerpo no invasiva en las semanas 3 a 11 en los ratones tratados sólo BLS-y en las semanas 11 a 20 en los ratones FGS de sólo tratados (Fig. 3A y 4). La recurrencia se detectó en los 8 ratones (100%) en el grupo de sólo BLS y 5 ratones (62,5%) en el grupo de FGS (Fig. 4). Todos los tumores recurrentes progresaron rápidamente y metástasis regional y distante y mataron a los ratones entre los días 30 a 156 en los ratones tratados con BLS-solamente y entre días 134-195 en los ratones tratados con FGS (Fig. 3B-3F y 4B). Por el contrario, no se detectó recurrencia o muerte en los ratones tratados con FGS-UVC (Fig. 3G-3J y 4B), lo que sugiere que la irradiación con UVC erradicada microscópica MRC después de FGS.

La recurrencia se detectó inicialmente por no no invasiva de imágenes de todo el cuerpo mediante el OV100 a un aumento de 0.14x en la semana 11 después de la FGS (a; punta de flecha blanca). El tumor recurrente progresó rápidamente (B-D) y mató a los ratones por la semana 22 después de FGS (D). metástasis axilar izquierda ganglios linfáticos (E; punta de flecha blanca), gran tumor recurrente local y muchos nódulos tumorales difusión (F) fueron detectados en los ratones en el momento de la muerte. En contraste, no se detectó la recurrencia en el grupo de FGS-UVC (G-J). Las barras de escala: 10 mm.

Supervivencia Impacto de UVC irradiación en combinación con FGS

supervivencia libre de recaída (RFS) y la supervivencia global (SG) se estimaron en el 3 grupos experimentales de ratones. Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, 3-meses RFS en ratones después de BLS-solamente, FGS y FGS-UVC fue del 0%, 50% y 100%, respectivamente; y 5-meses OS fue 10%, 90% y 100%, respectivamente. RFS medianas en los ratones tratados con BLS-solamente, y FGS FGS-UVC fueron 28 días, 103 días y 138 días, respectivamente, y la mediana de SG fue de 57,5 ​​días, 188,5 días, y 195 días, respectivamente (Tabla 1). Los ratones tratados con la supervivencia BLS-sólo mostró reduce significativamente en comparación con los ratones tratados con FGS y FGS-UVC tanto para RFS (
p
& lt; 0,001 y
p
& lt; 0,001, respectivamente) y OS (
p Hotel & lt; 0,001 y
p Hotel & lt; 0,001, respectivamente). FGS-UVC ratones tratados mostraron una supervivencia significativamente mayor en comparación con los ratones tratados con FGS tanto para SSR y la SG (
p = 0,008
y
p = 0,025
, respectivamente) (Fig. 4 y en la Tabla 1 ), lo que sugiere que la irradiación con UVC en combinación con FGS erradicada microscópica MRC.

la eficacia de la irradiación con UVC en células de cáncer pancreático Etiquetada con anti-CEA anticuerpo conjugado con DYLITE 488
in vitro o
GFP comparación con las células no marcadas

La eficacia de la irradiación con UVC en 3 BxPC células de cáncer de páncreas marcada con anticuerpo anti CEA conjugado con DYLITE 488 (BxPC-3-Ab488), BxPC-3-GFP y sin etiqueta BxPC-3 se comparó (Fig. 5A). UVC se irradió a diversas dosis (0, 25, 50 y 100 J /m
2). En comparación con las células no coloreadas BxPC-3, el número de BxPC-3-Ab488 y BxPC-3-GFP células disminuyó significativamente debido a la irradiación UVC con 25 J /m
2 (p = 0,016 y p = 0,01, respectivamente ) y 50 J /m
2 (p = 0,001 y p & gt; 0,001, respectivamente). células GFP-BxPC-3 BxPC-3-Ab488 y fueron igualmente más sensibles a la luz UVC que las células no coloreadas BxPC-3.

(A) Imágenes representativas de no coloreado BxPC-3, BxPC-3 -Ab488 y BxPC-3-GFP in vitro. Las células se observaron con el microscopio confocal FV1000 (Olympus, Tokio, Japón). Barras de escala: 50 m. (B) UVC se irradió a diversas dosis (0, 25, 50 y 100 J /m
2). En comparación con BxPC-3 células no coloreadas, el número de células GFP-BxPC-3 BxPC-3-Ab488 y disminuyó significativamente debido a la irradiación UVC con 25 y 50 J /m
2. Los datos experimentales se expresan como la media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0,01

Discusión

El modelo de ratón ortotópico implantación quirúrgica (SOI) que se utiliza en el presente estudio se ha comparado directamente con la evolución clínica de la donantes de pacientes en un estudio previo de los nuestros. muestras quirúrgicas frescas procedentes de pacientes con cáncer de estómago avanzado se trasplantaron ortotópicamente en ratones desnudos usando SOI. Se encontraron correlaciones estadísticamente significativas (p & lt; 0,01). Tanto para las metástasis hepáticas y afectación peritoneal entre los pacientes y ratones [24]

En otro estudio previo de la nuestra, muestras de páncreas el cáncer se trasplantaron al desnudo-ratón páncreas usando SOI [25]. Los modelos resultantes representados cáncer de páncreas clínica, incluyendo: la extensión del crecimiento local del cáncer pancreático humano con el estómago desnudo-ratón y el duodeno; metástasis en el hígado y los ganglios linfáticos regionales; y metástasis a distancia a la glándula suprarrenal, el diafragma y los ganglios linfáticos del mediastino. Los tumores pancreáticos humanos trasplantados mostraron un patrón similar de expresión de la glicoproteína asociada a tumor humano 72 y el antígeno carcinoembrionario.

Hemos demostrado anteriormente que SOI de tejido de cáncer de estómago humano intacto dio lugar a la formación de metástasis en 100% de los ratones con crecimiento extensivo primaria en los ganglios linfáticos regionales, hígado y pulmón. En contraste, la implantación ortotópica de suspensiones de células de la misma cáncer de estómago humano en el mismo sitio, metástasis produjo en sólo el 6,7% de los ratones con la formación de tumor local. Estos resultados enfatizan la importancia de utilizar SOI para permitir la plena expresión del potencial metastásico [26].

También comparado previamente la tasa de metástasis de carcinoma de células renales SN12C humana cuando se trasplantan por implantación o SOI ortotópico de las suspensiones celulares en el riñón. las tasas de metástasis en los órganos afectados (pulmón, hígado y ganglios mediastínicos) fueron de 2-3 veces más alta con SOI en comparación con la implantación ortotópica celular. La mediana de supervivencia en el modelo SOI fue de 40 días, lo cual fue significativamente más corto que el de la implantación celular ortotópico (68 días) [27].

En otro de nuestros estudios anteriores, se comparó el trasplante ortotópico SOI para celular de cáncer de vejiga. Después de SOI del tumor de vejiga RT-10, las metástasis se produjo en los ganglios regional y distante linfáticos, el hígado, el páncreas, el bazo, y el tejido adyacente a la glándula adrenal y el uréter, así como los pulmones. Cuando se inyectaron células desagregadas RT-10 transuretral, no hay metástasis formaron [28], [29].

En cuanto a la fidelidad de la respuesta a los fármacos, en otro estudio previo de la nuestra, cisplatino (CDDP) tuvo una eficacia significativa en cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) que crece de forma ortotópica en el pulmón y mitomicina C (MMC) no lo hizo, lo que refleja la situación clínica. Por el contrario, cuando el SCLC estaba creciendo subcutáneamente, los tumores respondieron a MMC y no a CDDP. Estos resultados indican que los tumores de crecimiento ortotópicamente reflejan los efectos clínicos de las drogas en SCLC humana más estrechamente que los tumores de crecimiento por vía subcutánea [30]. Por lo tanto, el modelo de SOI no debe afectar a la sensibilidad de UV de las células pancreáticas, ya que están creciendo en su órgano ortotópico natural.

Un problema importante en la oncología quirúrgica es evidente MRC después de la resección del tumor curativa [23]. Hemos demostrado anteriormente la visualización mejorada y la resección del cáncer primario y metastásico por FGS con el uso de adenovirus telomerasa-dependiente (OBP-401) que expresa la
gfp
gen sólo en las células cancerosas que expresan la enzima telomerasa [ ,,,0],31] - [33]

FGS estudios también se han llevado a cabo previamente en nuestro laboratorio mediante el etiquetado de los tumores con anticuerpos fluorescentes específicos de tumores que tienen aplicabilidad clínica directa [3] -. [5], [34] - [36]

se utilizó un anticuerpo fluoróforo conjugado a CEA para evaluar FGS de los tumores pancreáticos en modelos SOI ratón de cáncer de páncreas humano BxPC-3.. Después de la inyección intravenosa de anti-CEA-Alexa Fluor 488, la resección completa se logró en 92% de los ratones en el grupo de FGS en comparación con 45,5% en el grupo BLS. Las tasas de curación con FGS en comparación con BLS mejoraron de 4,5% a 40%, respectivamente, y 1 año de las tasas de supervivencia postoperatorias aumentó de 0% con BLS al 28% con FGS. La mediana de DFS aumentó de 5 semanas con BLS a 11 semanas con FGS. La mediana de SG aumentó de 13,5 semanas con BLS a 22 semanas con FGS [37].

Los resultados de estos estudios previos demuestran el gran potencial de FGS. Sin embargo, los problemas técnicos permanecen para eliminar MRC después de FGS. En el presente estudio, hemos demostrado que el MRC permaneció en el lecho quirúrgico, incluso después de FGS (Fig. 2D), que progresó rápidamente y podría matar a los animales (Fig. 3B-3F). Sin embargo, la irradiación con UVC en combinación con FGS completamente impedido recurrencia (Fig. 3G-3J y 4B), mostrando un incremento significativamente la supervivencia en comparación con FGS solos, tanto para SSR y la SG (
p = 0,008
y
p
= 0,025, respectivamente) (Fig. 4 y en la Tabla 1). Estos resultados sugieren que la irradiación con UVC podría erradicar microscópica MRC que queda después de FGS.

Hemos demostrado anteriormente que la radiación UVC es capaz de penetrar hasta el 40 micras de histocultivo tridimensional mediante el uso de Gelfoam y en un
ex vivo modelo de tumor
, así como eliminar las células cancerosas superficiales hasta una profundidad de 40 m
in vivo
sin daño de tejidos profundos [7]. En el presente estudio, se visualizó MRC, pero sólo con gran aumento, después de FGS (Fig. 2D). UVC era capaz de erradicar el MRC sin efectos secundarios aparentes y se elimina la repetición (Fig. 3G-3J y 4B). Estos resultados sugieren que una profundidad de 40 micras es de profundidad suficiente para erradicar microscópico MRC después de FGS. Por lo tanto la irradiación con UVC puede esterilizar el lecho de resección quirúrgica de las células cancerosas después de FGS.

Por otra parte, hemos demostrado en este estudio que las células BxPC-3-Ab488 eran más sensibles a la luz UVC que las células no coloreadas BxPC-3 y equivalente en la sensibilidad a la BxPC-3-GFP células (Fig. 5B). Estos resultados sugieren que la irradiación con UVC podría erradicar microscópica MRC, marcado con un fluoróforo exógeno, después de FGS y que la tecnología descrita en el presente informe es aplicable en la práctica clínica.

Apoyo a la Información
vídeo S1.
resección del tumor residual después de BLS de fluorescencia navigation.
doi:10.1371/journal.pone.0099977.s001
(MP4)

Acknowledgments

Dedication: Este trabajo está dedicado a la memoria de A. R. Moossa, M. D.

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