Extracto
El fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) -mammalian diana de la rapamicina (mTOR), el eje de señalización ha surgido como un nuevo objetivo para la terapia del cáncer. Los agentes que inhiben PI3K, mTOR, o ambos están actualmente en desarrollo. El inhibidor de mTOR alostérico, RAD001, y el inhibidor de quinasa dual PI3K /mTOR, BEZ235, son ejemplos de estos agentes. Estábamos interesados en el desarrollo de estrategias para mejorar la terapia Caner-mTOR objetivo. En este estudio, se encontró que BEZ235 solo inhibe eficazmente el crecimiento de células de cáncer de rapamicina-resistente. Curiosamente, la combinación de concentraciones subóptimas de RAD001 y BEZ235 ejerce inhibición sinérgica del crecimiento de células de cáncer de pulmón humano, junto con la inducción de la apoptosis y la detención en G1. Además, la combinación también fue más eficaz que cualquier agente solo en la inhibición del crecimiento de xenoinjertos de cáncer de pulmón en ratones. La combinación mostró efectos mejorados en la inhibición de la señalización de mTOR y la reducción de la expresión de c-Myc y ciclina D1. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que la combinación de RAD001 y BEZ235 es una nueva estrategia para la terapia del cáncer
Visto:. Xu C-X, Li Y, Yue P, Owonikoko los conocimientos tradicionales, Ramalingam SS, Khuri FR, et al. (2011) La combinación de RAD001 y NVP-BEZ235 Ejerce sinérgica contra el cáncer La actividad frente a células no pequeñas de cáncer de pulmón
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 6 (6): e20899. doi: 10.1371 /journal.pone.0020899
Editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 31, 2011; Aceptado: 12-may de 2011; Publicado: 14 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el premio del cáncer Académico Georgia Cancer Coalition Distinguido, NIH R01 CA118450 y CA116676 P01 (Proyecto 1), Departamento de Defensa IMPACTO (Imágenes y marcadores moleculares para pacientes con cáncer de pulmón: Enfoques con dianas moleculares, Tratamientos complementarios /innovadores, y terapéutico modalidades) para conceder basadas en biomarcadores W81XWH-05-0.027 (Proyecto 5), BATALLA (enfoques de terapia dirigida para el cáncer de pulmón Eliminación) premio W81XWH-06-1-0303 (Proyecto 4) y BESCT (Biología, Educación, Presentación, y quimioprevención terapia) premio DAMD17-01-1-0689 (Proyecto 2). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
K-Ras, receptor de LKB1 y factor de crecimiento epidérmico (EGFR) son frecuentemente mutado en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Estas mutaciones dan lugar a la activación aberrante de la fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) /Akt /objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) vía de señalización [1], [2], [3]. Por lo tanto, la vía de señalización de PI3K /Akt /mTOR se ha convertido en un objetivo terapéutico prometedor para NSCLC.
RAD001 (everolimus) es un derivado de rapamicina y es funcionalmente similar a la rapamicina como un inhibidor alostérico de la mTOR. En pacientes con cáncer de células renales avanzado tratados previamente con agentes de VEGF específica, RAD001 mejora la supervivencia libre de progresión y, por tanto, ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos para esta indicación [4]. También se ha encontrado que mejora la supervivencia libre de progresión en pacientes con cánceres neuroendcorine del páncreas. En muchos otros tumores malignos sólidos de órganos, el RAD001 y otros análogos de rapamicina (rapálogos) los rapálogos ejercen modestos efectos contra el cáncer, que, aunque prometedores, no son suficientes para justificar la monoterapia con estos agentes [5].
Los recientes esfuerzos para mejorar la eficacia de los rapálogos se han centrado en el desarrollo de nuevas estrategias de combinación. NVP-BEZ235 (BEZ235) es una novela y administrado por vía oral PI3K doble y el inhibidor de quinasa mTOR. Este compuesto es un inhibidor potente, reversible tanto de clase I actividad catalítica de PI3K y mTOR quinasa por competición en su sitio de unión a ATP [6]. BEZ235 se encuentra actualmente en proceso de evaluación en fase I /II de ensayos clínicos. En estudios preclínicos, BEZ235 induce sorprendentes efectos antiproliferativos tanto en ratones transgénicos con NSCLC-Ras oncogénico K-inducida y en líneas celulares de NSCLC que expresan el oncogén K-Ras. Por otra parte, se sensibiliza con eficacia líneas celulares de NSCLC que expresan el oncogén K-Ras a los efectos pro-apoptóticos de las radiaciones ionizantes, tanto
in vitro
y
in vivo
[7]. Cuando BEZ235 se combinó con un inhibidor de MEK, marcada sinergia se logró en la reducción de K-ras mutante de cáncer de pulmón murino [8].
Al igual que la rapamicina, RAD001 provoca la activación de Akt en células cancerosas humanas, incluyendo células de NSCLC, mientras que la inhibición de la mTOR señalización [9]. Recientemente hemos informado sobre la eficacia mejorada de la combinación de RAD001 con un inhibidor de PI3K en el crecimiento de células de NSCLC tanto
in vitro
y
in vivo
[9]. Curiosamente, BEZ235 podría superar la resistencia rapamicina ya que efectivamente inhibe el crecimiento de células de NSCLC con rapamicina o RAD001-resistente. Por lo tanto se evaluaron los efectos de la combinación de RAD001 y BEZ235 sobre el crecimiento de células de NSCLC y se encontró que la combinación fue más eficaz que cualquier agente solo en la inhibición del crecimiento de células de NSCLC tanto
vitro
en y
in vivo. Este informe será principalmente documentar nuestros hallazgos de la investigación en este sentido.
Materiales y Métodos
Reactivo
RAD001 y BEZ235 fueron suministrados por Novartis Pharmaceuticals Corporation (East Hanover, NJ), disuelto en DMSO y se almacena a -80 ° C. anticuerpo policlonal de conejo anti-actina se adquirió de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Los anticuerpos contra Akt, p-Akt (S473), p-S6 (S235 /S236), S6, p-4EBP1 (S65) p-4EBP1 (Thr37 /46), 4EBP1, eIF4G, eIF4E, y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), respectivamente, se adquirieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Cabra policlonal mTOR (FRAP; N-19) y c-Myc monoclonal de ratón (9E10) anticuerpos se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), respectivamente. Rictor anticuerpo policlonal de conejo (BL2178) se adquirió de Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, TX). anticuerpo monoclonal de ratón ciclina D1 fue adquirido de Dako (Carpinteria, CA).
Líneas celulares y cultivo celular
El CPNM líneas celulares humanas A549, H460 y H157 se describió anteriormente [10]. HCC827 se adquirió de la American Type Culture Collection ATCC (Manassas, VA). La rapamicina resistentes línea celular A549 (A549-RR) se estableció anteriormente [9]. Estas líneas celulares se hicieron crecer en cultivo en monocapa en medio RPMI 1640 suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que consiste en 5% de CO
2 y 95% de aire.
Crecimiento Ensayo de inhibición de
las células se cultivaron en placas de cultivo celular de 96 pocillos y se trataron al día siguiente con los agentes indicados. número de células viables se estimó utilizando el ensayo de sulforodamina B (SRB), como se describe anteriormente [10]. índice de combinación (IC) para la interacción fármaco (por ejemplo, la sinergia) se calculó utilizando el software CompuSyn (ComboSyn, Inc .; Paramus, Nueva Jersey).
Formación de Colonias Ensayo
Los efectos de la propuesta fármacos sobre la formación de colonias en las placas se midieron como se describe anteriormente [11].
detección de apoptosis
La apoptosis se evaluó mediante tinción con anexina V usando Anexina V-PE kit de detección de apoptosis adquirido de BD Biosciences ( San Jose, CA) según las instrucciones del fabricante.
análisis Western blot
Preparación de lisados de células de proteínas y Western blot fueron descritas anteriormente [12], [13].
m
7GTP tubo de salida deslizable para el Análisis de eIF4F Formación de complejos
eIF4F complejo en extractos de células se detectó utilizando cromatografía de afinidad m
7GTP-Sepharose como se describe anteriormente [14].
la detección de complejos de mTOR (mTORCs)
mTORCs incluyendo mTORC1 y mTORC2 se inmunoprecipitaron con anticuerpo policlonal de cabra mTOR (FRAP; N-19) de anticuerpos y siguió con Western Blot para detectar mTOR, rapaz y Rictor, respectivamente, como se describe anteriormente [9].
cáncer de pulmón los xenoinjertos y Tratamientos
los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Emory. El número de protocolo es 222-2008. atímicos hembra (nu /nu) de edad de cinco a 6 semanas recibieron la orden de Taconic (Hudson, Nueva York) y se alojaron en condiciones libres de patógenos en jaulas microisolator con pienso de laboratorio y agua
ad libitum
. Las células A549 en 5 × 10 por vía subcutánea
6 en medio libre de suero fueron inyectados en la región del flanco de ratones desnudos. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 100 mm
3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos (n = 6 /grupo) de acuerdo con los volúmenes tumorales y los pesos corporales de los siguientes tratamientos: control del vehículo, BEZ235 (20 mg /kg /día, og), RAD001 (3 mg /kg /día; og), y su combinación. Los volúmenes tumorales se midieron utilizando mediciones de la pinza una vez cada dos días y se calculan con la fórmula
V = π
(longitud x anchura
2) /6.
Análisis Estadístico
La significación estadística de las diferencias entre los dos grupos o entre varios grupos se analizó con las dos caras de Student no pareada
t
pruebas (para varianzas iguales) o con corregido
t
prueba de Welch (varianzas desiguales) o de un solo sentido el análisis de varianza (ANOVA) mediante el uso de software de GraphPad INSTAT 3. Los resultados se consideraron estadísticamente significativas a
P
. & Lt; 0,05
Resultados
BEZ235 inhibe eficazmente el crecimiento de la rapamicina resistentes a las células NSCLC
un estudio previo, se estableció una línea celular rapamicina resistente (es decir, A549-RR). Esta línea celular es también resistente a RAD001 [9]. Tenemos previsto que esta línea celular sería, al menos en parte, resistentes a BEZ235 ya que es un inhibidor dual de PI3K y mTOR. Inesperadamente, BEZ235 demostrado una potente inhibición del crecimiento de las células A549-RR (Fig. 1A). Por otra parte, BEZ235 también indujo apoptosis en las células A549-RR (Fig. 1B). De hecho, la inducción de la apoptosis y la inhibición de crecimiento con BEZ235 fue ligeramente más eficaz en células A549-RR que en las células A549 matriz (Fig. 1). Así, las células de rapamicina resistentes no muestran resistencia cruzada a BEZ235.
A
, las líneas celulares indicadas se sembraron en placas de 96 pocillos y después se trataron con diferentes concentraciones de BEZ235 como se indica en el segundo día. Después de 3 días, el número de células se estimaron usando el ensayo de SRB. Puntos, los medios de cuatro determinaciones repetidas; bares, ± SD.
B Opiniones, Las líneas celulares indicadas se sembraron en placas de 6 pocillos y después se trató día siguiente con diferentes concentraciones de BEZ235 como se indica. Después de 24 y 72 h, las células se recogieron y se sometieron a la detección de la apoptosis mediante tinción con anexina V. Columnas, medios de determinaciones por duplicado; bares, ± SD.
La combinación de RAD001 y BEZ235 sinérgicamente inhibe el crecimiento de células de NSCLC junto con la inducción de la apoptosis y la detención en G1
previamente demostrado que la combinación de rapamicina o RAD001 con el inhibidor de PI3K LY294002 resultó en efectos inhibidores de crecimiento mejoradas contra células de NSCLC tanto
in vitro
y
in vivo
[9], [15]. Ahora hemos estudiado si la combinación de BEZ235 y RAD001 ejerce aumentada actividad anti-cáncer en células de NSCLC. Inesperadamente, se encontró que la combinación de bajas concentraciones de BEZ235 y RAD001 era mucho más potente que cada agente sencillo en la inhibición del crecimiento de varias líneas celulares de NSCLC (por ejemplo, A549, H460, H157 y HCC827). Los IC para la mayoría de las combinaciones eran & lt; 1 (Fig. 2A, paneles de la derecha), lo que indica efectos sinérgicos en la inhibición del crecimiento de células de NSCLC. De acuerdo, la combinación de BEZ235 y RAD001 fue significativamente más potente que cada agente solo en la inducción de apoptosis (figura 2B.) Y la detención en G1 (Fig 2C.) (
P
& lt; 0,001). Por lo tanto, el aumento de la inducción de la apoptosis tanto y detención del ciclo celular contribuye a los efectos inhibidores del crecimiento aumentada inducida por la combinación.
Un
, las líneas celulares indicadas fueron sembradas en placas de 96 pocillos y luego tratada día siguiente con diferentes concentraciones de BEZ235 (BEZ), RAD001 (RAD) y sus respectivas combinaciones como se indica. Después de 3 días, el número de células se estimaron utilizando el ensayo SRB y los IC se calcularon con el software CompuSyn (paneles de la derecha). Puntos, los medios de cuatro determinaciones repetidas; bares, ± SD.
B Opiniones y
C
, Las líneas celulares indicadas fueron sembradas en placas de 6 pocillos y después se trató con 10 nM BEZ235 solo, 2 nM RAD001 solo, y su combinación. Después de 48 h, se recogieron las células para la detección de apoptosis mediante tinción con anexina V (
A
) y para el análisis del ciclo celular con una citometría de flujo (
C
). Columnas, medios de determinaciones por duplicado; Bares, ± SD. *,
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***,
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el control de DMSO; ###,
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con RAD001 o BEZ235 sola
La combinación de RAD001 y BEZ235 inhibe eficazmente la formación y crecimiento de colonias de células de NSCLC
determinamos aún más los efectos a largo plazo de la combinación de RAD001 y BEZ235 sobre el crecimiento de células de NSCLC en un ensayo de formación de colonias. Este ensayo nos permite repetir los tratamientos por un largo tiempo (por ejemplo, 12 días). RAD001 a una dosis de 1 nM y BEZ235 a 5 nM solo tuvo un efecto mínimo en la supresión de la formación de colonias de las células de NSCLC; sin embargo, la combinación ya sea eliminó la formación de colonias (por ejemplo, A549) o drásticamente redujo el número de colonias (por ejemplo, H460 y H157) (Fig. 3). Por lo tanto, es evidente que la combinación es mucho más eficaz que cualquiera de los agentes solo en la inhibición de la formación de colonias y el crecimiento de células de NSCLC (
P
& lt; 0,001). También comparó el efecto de la secuencia de administración de los dos agentes en la formación de colonias de células de NSCLC. En las mismas condiciones experimentales descritas anteriormente, los tratamientos secuenciales con RAD001 primero seguido por el tratamiento BEZ235 (RAD001 → BEZ235) o BEZ235 primero seguido por el tratamiento RAD001 (BEZ235 → RAD001) efectos comparables a cada uno solo con supresión mínima del crecimiento de colonias de células de NSCLC mostró . La combinación simultánea de RAD001 y BEZ235 era mucho más potente que cualquiera de los tratamientos secuencial en la inhibición de la formación y crecimiento de las colonias de NSCLC (
P
& lt; 0,001) (Fig. 2). Por lo tanto, la administración concomitante de RAD001 y BEZ235 es claramente superior a los tratamientos secuenciales en la inhibición del crecimiento de colonias de células NSCLC.
Las líneas celulares indicadas a una densidad de aproximadamente 200 células /pocillo fueron sembradas en placas de 24 pocillos. En el segundo día, las células fueron tratadas con 1 nM RAD001 (RAD), 5 nM BEZ235 (BEZ) o sus combinaciones simultáneas (RAD + BEZ). Las células también se trataron con 1 nM RAD001 durante 6 días seguidos con 5 nM BEZ235 por otros 6 días (RAD → BEZ) o con 5 nM BEZ durante 6 días seguido con 1 nM RAD001 por otros 6 días (BEZ → RAD). Después de 12 días, las placas se tiñeron para la formación de colonias de células con el colorante cristal violeta. La imagen de las colonias a continuación fue tomada con una cámara digital (
Un
) y el número de colonias se contaron (
B Opiniones). ***,
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el control de DMSO; ###,
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con todos los otros tratamientos
Asimismo, comparó los efectos de la combinación de RAD001 y LY294002 con tratamientos secuenciales en la formación de colonias de células de NSCLC. . En consonancia, el tratamiento de combinación concurrente, pero no el tratamiento secuencial ya sea con RAD001 primero seguido de LY294002 o con LY294002 seguido de RAD001, generado efectos aumentados en la inhibición de la formación de colonias de células de NSCLC (Fig. S1).
El combinación de RAD001 y BEZ235 Ejerce Aumentada Actividad contra el crecimiento de xenoinjertos de NSCLC en ratones desnudos
Debido a los efectos inhibidores del crecimiento prometedores de la combinación de RAD001 y BEZ235 en las células NSCLC
in vitro
, nos entonces validado la eficacia de la combinación contra el crecimiento de tumores de NSCLC en los ratones. Tanto RAD001 y BEZ235 parcialmente, pero significativamente, inhibieron el crecimiento de los xenoinjertos A549 (
P
& lt; 0,01); sin embargo, la combinación de RAD001 y BEZ235 fue significativamente más potente que cada agente sencillo en la inhibición del crecimiento de los xenoinjertos, medido por ambos tamaños y pesos de los tumores (
P
& lt; 0,01) (Figs. 4A y 4B). Estos
in vivo
datos demuestran además que la combinación de RAD001 y BEZ235 muestra aumentada actividad anticancerígena. Se observó un mayor grado de pérdida de peso en ratones tratados con la combinación (hasta 19% de los ratones de control), especialmente durante el período de tratamiento temprano. La diferencia de peso al final del experimento mejoró a sólo el 13% del control (Fig. 4C), lo que sugiere la posible adaptación y una mejor tolerancia del tratamiento de combinación, España
xenoinjertos A549 fueron tratados (una vez al día) con vehículo control, RAD001 (3 mg /kg, og), BEZ235 (20 mg /kg, og) y su combinación (BEZ + RAD) a partir de la misma días después de agrupar. el tamaño del tumor (
Un
) y el peso corporal (
C
) se midieron una vez cada dos días. Después de 14 días, los ratones se sacrificaron y los tumores se retiraron y se pesaron (
B
). Cada medida es una media ± SD (n = 6). Los números en
C
representan la pérdida de peso corporal en el grupo de combinación en comparación con el grupo de control. *
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control del vehículo; **
P
& lt; 0,01 en comparación con el control del vehículo; ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el control del vehículo;
##
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con RAD001 o con BEZ235
La combinación de RAD001 y BEZ235 ejerce efectos sobre la represión de la señalización de mTOR y la regulación a la baja de C aumentó. myc y ciclina D1
Para profundizar en los mecanismos por los que ejercen la combinación de una mayor actividad anticancerígena RAD001 y BEZ235, se analizaron los efectos de la combinación de la señalización de mTOR y en la expresión de sus proteínas reguladas en comparación con cualquier agente solo. A las dosis ensayadas, BEZ235 tuvo un efecto mínimo en los niveles de p-S6 reducidos, pero ningún efecto sobre los niveles de p-4EBP1 (tanto S65 y T37 /46), c-Myc y ciclina D1. De hecho, se observó niveles de 4EBP1 (T37 /46) aumentó (tanto en A549 y H157) y c-Myc (por ejemplo, en H157). RAD001 a 2 nm inhibió S6 y 4EBP1 fosforilación (S65), pero no redujo los niveles de p-4EBP1 (T37 /46), c-myc y ciclina D1. Al igual que en BEZ235, RAD001 también aumentó los niveles de p-4EBP1 (T37 /46) y c-Myc en las células A549 y H157. Sin embargo, la combinación de RAD001 y BEZ235 ya sea abrogó el aumento de p-4EBP1 (T37 /46) (por ejemplo, en células A549) inducida por el agente único o mayor efecto ejercido en la reducción de (46 T37 /) los niveles de p-4EBP1 (por ejemplo, en células H157). Es importante destacar que la combinación de RAD001 y BEZ235 había aumentado efectos en la disminución de los niveles de c-Myc y ciclina D1 en ambas células A549 y H157 en comparación con cada agente solo solo (Fig. 5).
Un
, las líneas celulares indicadas se sembraron en 10 placas de cultivo celular cm de diámetro y se trató día siguiente con las concentraciones indicadas de Bez-235 en ausencia y presencia de RAD001 durante 24 h. Las células se recogieron a continuación para la preparación de lisados de células enteras de proteínas y análisis de transferencia Western después de la detección de las proteínas indicadas.
B Opiniones, Las líneas celulares indicadas fueron tratados con 2 nM de RAD001, 10 nM BEZ235 o su combinación. Después de 24 h, se recogieron las células para la preparación de células enteras lisados de proteínas y la posterior m
7GTP desplegable de ensayo siguió con Western blot para detectar las proteínas dadas.
RAD001 aumentó Akt la fosforilación en ambas líneas celulares A549 y H157 como se informó anteriormente [9]. Curiosamente, a dosis bajas, BEZ235 también aumentó los niveles de P-Akt. La presencia de BEZ235 a la dosis probada oscila ya sea débilmente reduce los niveles de p-Akt inducidos por RAD001 (por ejemplo, en células A549) o no afecta aumento RAD001 inducida en p-Akt (por ejemplo, en células H157) (Fig. 5). Por lo tanto, parece que la combinación de RAD001 y BEZ235 puede mostrar efectos mejorados en la supresión de la señalización de mTOR y la expresión de sus proteínas reguladas con poco o ningún efecto inhibitorio sobre la fosforilación de Akt.
La combinación de RAD001 y BEZ235 Ejerce mejorada efectos sobre la supresión de la Asamblea eIF4F
Desde la señalización mTOR es conocido para regular positivamente iniciación de la traducción dependiente de la cubierta, que además analiza los efectos de RAD001 y BEZ235 combinación de la tapa de unión de eIF4E y eIF4G (por ejemplo, el montaje eIF4F) con el m
7GTP-Sepharose desplegable ensayo. Tal como se presenta en la Fig. 5B, RAD0001 y BEZ235 solo reducen las cantidades de eIF4G que se comunicaron con eIF4E. Sin embargo, la combinación de RAD001 y BEZ235 era mucho más eficaz que cualquier agente solo en la disminución de las cantidades de eIF4G de unión a eIF4E. Dichos resultados indican claramente que la combinación de RAD001 y BEZ235 ejerce efectos sobre la supresión de la tapa de la unión de eIF4E y eIF4G o eIF4F montaje mejorado.
La combinación de RAD001 y BEZ235 no exhibe efectos mejorados en la inhibición de la Asamblea de mTORCs
se sabe que la reunión o asociación de la mTOR con sus socios (por ejemplo, aves rapaces y Rictor) es esencial para la actividad de las enzimas distintas y funciones biológicas. RAD001, al igual que la rapamicina, inhibe la señalización de mTOR mediante la inhibición de la asamblea de los mTORCs [16]. Por lo tanto, determina además si la combinación de RAD001 y BEZ235 ejercía efectos inhibitorios mejorada sobre el conjunto de los mTORCs incluyendo mTORC1 (mTOR /raptor) y mTORC2 (mTOR /Rictor). Con este fin, hicimos inmunoprecipitación (IP) con anticuerpo anti-mTOR para tirar hacia abajo tanto mTORC1 y mTORC2 y luego seguimos con Western Blot para detectar raptor y Rictor en los inmunoprecipitados. Tal como se presenta en la Fig. 6, BEZ235 tuvo efectos mínimos en la reducción de los niveles de rapaces y Rictor en los inmunoprecipitados, mientras que RAD001 reduce sustancialmente los niveles tanto de rapaces y Rictor derribado por el anticuerpo mTOR. La combinación de RAD001 y BEZ235 tuvo una potencia similar a RAD001 sola en la reducción de los niveles de rapaces y Rictor en los inmunoprecipitados, lo que indica que la combinación no presenta efectos mejorados en la inhibición de la asamblea de mTORC1 y mTORC2.
A549 las células fueron tratadas con 2 nM RAD001, 10 nM BEZ235 o su combinación. Después de 24 h, se recogieron las células para la preparación de lisados de células enteras de proteínas y la posterior transferencia de IP-occidental.
Discusión
El desarrollo de resistencia rapamicina es un tema crítico en el tratamiento de cáncer con rapamicina y sus análogos [17]. BEZ235 es un inhibidor de PI3K y mTOR quinasa dual [6]. Nuestro estudio demostró que BEZ235 inhibió el crecimiento de células de rapamicina resistentes a la apoptosis inducida y tan eficazmente como lo hizo en las células parentales emparejados. De hecho, las células de rapamicina resistentes fueron ligeramente más sensible que sus células parentales a BEZ235 (Fig. 1). Estos datos sugieren que las células de rapamicina resistentes no son resistencia cruzada a BEZ235. Dado que esta línea celular se ha demostrado que es totalmente resistente a RAD001, nuestros resultados sugieren que BEZ235 inhibe el crecimiento de las células cancerosas a través de diferentes mecanismos de los que median las acciones de los rapálogos. Será interesante saber si BEZ235 poseen mecanismo adicional más allá de la doble inhibición de PI3K y BEZ235. Al lado, nuestros datos también implican que BEZ235 puede utilizarse para superar la resistencia a la rapamicina
.
Aunque BEZ235 inhibe tanto PI3K y mTOR, en combinación con RAD001, ejerce efectos sinérgicos en la inhibición del crecimiento de un panel de células de NSCLC como demostrado en un cultivo en monocapa de 3 días (con el ensayo de SRB) y en un ensayo de 12 días la formación de colonias a largo plazo (. Figs 2 y 3). Esta sinergia es probablemente debido a efectos mejorados sobre la inducción de la detención del ciclo celular G1 y la apoptosis (Fig. 2). De acuerdo, la combinación de RAD001 y BEZ235 fue significativamente más eficaz que cualquiera de los agentes para inhibir el crecimiento de xenoinjertos de NSCLC en los ratones desnudos (Fig. 4). En el estudio en animales, se observó que la combinación inicialmente causó una pérdida significativa de peso corporal (hasta un 19% de control); sin embargo, al final del experimento, los ratones que recibieron el tratamiento de combinación parecían recuperar algo de la pérdida de peso (13% de control). Esto sugiere que los ratones pueden adaptarse y eventualmente tolerar el tratamiento con la combinación de RAD001 y BEZ235. No obstante, debemos potencial conscientes aumentaron los efectos adversos causados por la combinación mientras que la combinación sinérgica muestra actividad contra el cáncer prometedor.
Los programas de tratamiento pueden afectar el resultado final de la terapia combinatoria dado. En este estudio, se encontró que los tratamientos secuenciales con RAD001 seguido de BEZ235 o con BEZ235 seguidos por RAD001 mínimamente inhibió el crecimiento de colonias de NSCLC; En contraste, el tratamiento simultáneo de RAD001 y BEZ235 inhibe sustancialmente el crecimiento de las colonias de NSCLC o se elimina la formación de colonias (Fig. 3). Esto también es válido para la combinación de rapamicina y LY294002 (Fig. S1). Nuestros datos sugieren que la combinación simultánea de RAD001 y BEZ235 puede ser óptimo para un mayor desarrollo de esta combinación.
Los IC
50 (concentración de inhibición del crecimiento celular del 50%) de BEZ235 en las células NSCLC humanos van desde 10 nM a 100 nM (nuestros datos no publicados). En nuestros experimentos de combinación, generalmente utilizamos intervalos de dosis bajas de BEZ235 (por ejemplo, 1-10 nM). A estas dosis, BEZ235 tenía un efecto inhibidor débil sobre la fosforilación de p-S6 pero no modulan la fosforilación de p-4EBP1 o los niveles de c-Myc y ciclina D1. A una dosis de 2 nM, RAD001 inhibe eficazmente la fosforilación de S6 y 4EBP1 (S65), pero no suprimió la fosforilación 4EBP1 expresión D1 (T37 /46) y c-Myc y ciclina. Sin embargo, la combinación de RAD001 y BEZ235 inhibe eficazmente la fosforilación de p-4EBP1 (en T37 /46) y redujo los niveles de c-Myc y ciclina D1 (Fig. 5A). Por otra parte, hemos demostrado que la combinación de RAD001 y BEZ235 era mucho más potente que cualquiera de los agentes solo en la inhibición de la tapa de la unión de eIF4E y eIF4E o montaje eIF4F (Fig. 5B), lo que implica que la combinación ejerce mejorado efecto inhibidor de la iniciación de la tapa que dependen . Como se sabe que c-Myc y ciclina D1 a ser regulada por la señalización a través de la traducción de proteínas dependiente de la cubierta [18] mTOR, nuestros datos indican que la combinación de RAD001 y BEZ235 ejerce mayor efecto en la inhibición de la señalización de mTOR y la expresión de su regulada proteínas oncogénicas (por ejemplo, c-Myc y ciclina D1). Este efecto puede contribuir a la actividad sinérgica contra el crecimiento de células de NSCLC
in vitro
y
in vivo fotos: por la combinación de RAD001 y BEZ235.
En este estudio, RAD001 aumento de la fosforilación de Akt en tanto en células A549 y H157; esto está de acuerdo con nuestros informes anteriores [9]. A las concentraciones ensayadas (por ejemplo, 1 a 10 nM), BEZ235 aumentó los niveles de P-Akt también. Esta observación es consistente con un informe anterior, en el que se muestra BEZ235 para aumentar la fosforilación de Akt en dosis bajas (por ejemplo, 10 nM) [19]. Se había demostrado previamente que las concentraciones más altas de BEZ235 son necesarios (por ejemplo, & gt; 100 nM) para inhibir Akt en comparación con la (por ejemplo, & gt; 10 nM) necesaria para la inhibición de la fosforilación de S6 [19]. Por lo tanto, parece que BEZ235 posee principalmente la actividad de mTOR-inhibidor a los rangos de concentraciones bajas. En consecuencia, es comprensible que BEZ235 en rangos de baja concentración aumenta la fosforilación de Akt como se esperaría de un rapálogo [9], [15]. Curiosamente, la combinación de RAD001 y BEZ235 no redujo los niveles de P-Akt, que eran tan altos como los de las células tratadas con RAD001 o BEZ235 sola (Fig. 5). Teniendo en cuenta que la combinación de RAD001 y BEZ235 inhibe eficazmente el crecimiento de células de NSCLC como se discutió anteriormente, parece que la combinación de RAD001 y BEZ235 puede ejercer actividad anticancerosa mejorada con niveles elevados de p-Akt.
mTOR ejerce su papeles críticos en la promoción de la progresión del ciclo celular y la proliferación celular principalmente a través de interacciones con otras proteínas tales como raptor (formando mTORC1) y Rictor (formando mTORC2) [18], [20]. mTORC2 se piensa generalmente para ser insensible a rapálogos [18]. Sin embargo, el tratamiento prolongado con estos inhibidores de mTOR interrumpe el montaje de la mTORC2 como se demuestra por nosotros [9] y otros [21]. En este estudio, después de un tratamiento de 24 h, RAD001, pero no BEZ235, inhibir de forma eficaz el conjunto o la actividad de ambos mTORC1 y mTORC2. La combinación de RAD001 y BEZ235 no redujo aún más los niveles de rapaces y Rictor en los inmunoprecipitados (Fig. 6), lo que demuestra que la combinación no muestra efectos mejorados sobre la inhibición de la asamblea de mTORCs. Basándose en estas observaciones, se especula que los efectos mejorados en la supresión de la señalización mTOR por la combinación es probablemente debido a sus efectos distintivos en la inhibición de la Asamblea mTORC y actividad de la quinasa mTOR. En general, se cree que una sinergia se consigue a través de una corporación de dos fármacos que funcionan a través de mecanismos distintos. Desde BEZ235 inhibe eficazmente el crecimiento de las células de rapamicina resistente, también es posible que la sinergia entre RAD001 y BEZ235 contra el crecimiento de células de cáncer de pulmón se produce a través de un mecanismo desconocido de BEZ235, que necesita más investigación.
en resumen, el presente estudio ha demostrado que la combinación de RAD001 y la BEZ235 inhibidor de PI3K /mTOR exhibe inhibición sinérgica del crecimiento de células de NSCLC
in vitro
y
in vivo
y por lo tanto representa una estrategia novedosa para mejorar la eficacia de la terapia del cáncer de mTOR-dirigida. Nuestros resultados proporcionan el fundamento para evaluar esta combinación en ensayos clínicos para los pacientes con tumores malignos rapálogo-sensibles y refractarios.
Apoyo a la Información
Figura S1.
combinación concurrente de rapamicina y LY294002 es más eficaz que los tratamientos secuenciales en la inhibición de la formación y el crecimiento de las colonias de NSCLC. Las líneas celulares indicadas a una densidad de aproximadamente 200 células /pocillo fueron sembradas en placas de 24 pocillos. En el segundo día, las células se trataron con 1 rapamicina nM (Rap) solo, 5 nM LY294002 (LY) sola, la combinación simultánea de rapamicina y LY294002 (Rap + LY), rapamicina durante 3 días y luego se cambiaron a tratamiento LY294002 (Rap → LY), LY294002 durante 3 días y después se cambiaron a un tratamiento rapamicina (LY → Rap). Los mismos ciclos de los tratamientos se repitieron cada 3 días. Después de 12 días, las placas se tiñeron para la formación de colonias de células con el colorante cristal violeta. La imagen de las colonias a continuación fue tomada con una cámara digital (A) y se contaron las colonias (
B Opiniones)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0020899.s001 gratis (PDF)
Reconocimientos
TKO, SSR, FRK y S-Y.S.