Extracto
Introducción
células asesinas inducidas por citoquinas (células CIK) son una subconjunto heterogéneo de ex-vivo se expandió linfocitos T que se caracterizan con una actividad para destruir tumores MHC-sin restricciones y un fenotipo T-NK mixta. Adoptiva CIK transferencia de células, una de la inmunoterapia adoptiva representa una terapia contra el cáncer no tóxico prometedor. Sin embargo, en estudios clínicos, la actividad terapéutica de adoptiva de transferencia de células CIK no es tan eficiente como se había previsto. Las explicaciones posibles son que la vasculatura del tumor anormal y microambiente del tumor hipóxico podrían impedir la infiltración y la eficacia de los linfocitos. La hipótesis de que la terapia antiangiogénesis podría mejorar la actividad antitumoral de las células CIK por la normalización de la vasculatura del tumor y la modulación de microambiente tumoral hipóxico.
Métodos
Hemos combinado endostatina humana recombinante (rh-endostatina) y las células CIK en el tratamiento de modelos murinos de carcinoma de pulmón. La microscopía intravital, contraste dinámico de mejora de imágenes por resonancia magnética, inmunohistoquímica, citometría de flujo y se utilizaron para investigar la vasculatura del tumor y el microambiente hipóxico, así como la infiltración de células inmunes.
Resultados
Nuestros resultados indican que rh-endostatina sinérgica con células CIK adoptivos traslado al inhibir el crecimiento de carcinoma de pulmón. Se encontró que la vasculatura del tumor normalizado rh-endostatina y redujo el área hipóxica en el microambiente tumoral. La hipoxia inhibió significativamente la proliferación, citotoxicidad y la migración de las células CIK in vitro e impidió el homing de las células CIK en parénquima tumoral ex vivo. Además, hemos encontrado que el tratamiento con rh-endostatina aumentó significativamente el homing de las células CIK y la disminución de la acumulación de células inmunes supresoras en el tejido tumoral. Además, la terapia de combinación produce un mayor nivel de linfocitos de infiltración tumoral en comparación con otros tratamientos.
Conclusiones
Nuestros resultados demuestran que rh-endostatina mejora el efecto terapéutico de la terapia adoptiva de células CIK contra carcinomas de pulmón y desenmascarar los mecanismos de la eficacia antitumoral sinérgico, proporcionando una nueva justificación de la combinación de la terapia antiangiogénesis con la inmunoterapia en el tratamiento del cáncer de pulmón
Visto:. Shi S, R Wang, Chen y, Song Hye, Chen L, Huang G (2013) la combinación de la terapia antiangiogénica con la célula inmunoterapia adoptiva ejerce mejores efectos antitumorales de células no pequeñas de pulmón modelos de cáncer. PLoS ONE 8 (6): e65757. doi: 10.1371 /journal.pone.0065757
Editor: G. Juri Gelovani, Wayne State University, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de diciembre de 2012; Aceptado: April 29, 2013; Publicado: 14 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Shi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant número: 81101739) y la Fundación Internacional de Medicina China (Grant número: CIMF-F-H001-023). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de pulmón es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer [1]. La mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican en estadios avanzados (III o IV) y varios tratamientos han surgido incluyendo quimioterapia, radioterapia, terapia de destino y la inmunoterapia. células CIK son poblaciones heterogéneas de células derivadas de sangre periférica humana o ratones de bazo después de la expansión in vitro con interferón-γ, anticuerpos anti-CD3 de interleucina-2 y [2]. células CIK median la citotoxicidad MHC-sin restricciones potente contra una variedad de células tumorales y pueden reconocer y matar las células tumorales sin exposición previa o cebado. Existen dos subpoblaciones principales se pueden distinguir en el cultivo en masa de células CIK expandidas in vitro, una co-expresión de las moléculas CD3 y CD56 (CD3
+ CD56
+) mientras que el otro presenta una CD3
+ CD56
- fenotipo. La actividad antitumoral de las células CIK se ha informado de que se restringido principalmente a la CD3
+ CD56
+ células [3]. Adoptiva CIK transferencia de células, una de la inmunoterapia adoptiva representa una terapia contra el cáncer no tóxico prometedor en el tratamiento de tumores sólidos refractarios a las terapias convencionales. Sin embargo, en estudios clínicos, la actividad terapéutica de CIK transferencia de células no es tan eficiente como se esperaba [4]. la transferencia celular adoptiva efectiva se enfrenta a numerosos retos como la tolerancia inmune sistémica y el tumor de escape inmune local. El homing de las células inmunitarias al sitio del tumor se reduce y las funciones inmunitarias antitumorales son inhibidas por microambiente tumoral y las propiedades inmunomoduladoras de las poblaciones de células supresoras [5], [6]. Por lo tanto, es urgente encontrar una terapia eficaz para mejorar la eficacia de la transferencia celular adoptiva a fin de mejorar el efecto clínico de pacientes con cáncer.
Se ha propuesto que la eficacia de las inmunoterapias basadas en células podría verse afectada por la integridad de la vasculatura del tumor y el tumor inmunosupresor microambiente [7]. La hipoxia es una característica de ambiente metabólico anormal en los tumores sólidos. Excepto por estar involucrado en la disminución de sensibilidad a la radiación y la resistencia a la quimioterapia, la hipoxia se ha convertido en un factor significativo de la tolerancia inmune en el microentorno del tumor [8], [9], [10]. Varias líneas de evidencia sugieren que antiangiogénesis transitoriamente la vasculatura del tumor normalizado, disminución de la hipoxia intra-tumor y el aumento de la infiltración de linfocitos en el tumor, lo que proporciona un fundamento para la combinación de la terapia antiangiogénesis con la inmunoterapia celular adoptiva [11], [12]. terapia antiangiogénesis se ha informado a aumentar la eficacia antitumoral de la quimioterapia, la radioterapia y la inmunoterapia en ambos modelos animales y en el ser humano [13], [14], [15], [16]. La endostatina es un fragmento de 20 kDa de colágeno tipo XVIII, capaz de reducir la proliferación, la migración y la invasión de las células endoteliales mediante la interacción αvβ1, -αvβ3, y intergrins αvβ5 en la superficie de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) [17]. En la fase I y fase II de ensayos clínicos en los Estados Unidos, endostatina mostró poca respuesta a ninguno antitumoral aunque no se encontraron efectos secundarios adversos. Rh-endostatina utilizado en el presente estudio es una forma modificada de endostatina con una secuencia de ácido nueve aminoácidos adicionales que se formó otra estructura de His y ha sido aprobado para uso clínico por la Food and Drug Administration de Estado en China para el tratamiento de avanzada cáncer de pulmón de células no pequeñas en 2005 [18]. Se ha demostrado que rh-endostatina podría mejorar el progreso libre de la supervivencia de los pacientes en el cáncer no microcítico de pulmón avanzado de células (CPNM) con la combinación de la quimioterapia en los ensayos aleatorios. Hemos demostrado previamente que rh-endostatina podría mejorar la eficacia antitumoral de paclitaxel en el tratamiento de carcinoma de pulmón [19]. Rh-endostatina se ha informado a mejorar la radiorespuesta para el carcinoma humano mejorando el microambiente hipóxico del tumor [8], [20]. Sin embargo, hasta hace poco, hay poca información disponible en la literatura sobre el efecto antitumoral de la combinación de rh-endostatina con la inmunoterapia celular adoptiva. Hemos llevado a cabo esta investigación para determinar si rh-endostatina podría mejorar el efecto antitumoral de la transferencia adoptiva de células CIK y para ilustrar los posibles mecanismos por los cuales rh-endostatina libera todo el potencial de la terapia celular adoptiva. Nuestros resultados mostraron que rh-endostatina podría mejorar los efectos antitumorales de células CIK y sugirieron que la terapia de combinación con rh-endostatina y células CIK celebrado una gran promesa en el tratamiento de pacientes con cáncer avanzado de pulmón en estadio.
Métodos
Declaración de Ética
estudio en animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las directrices para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio del hospital Jinling. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Animal del Hospital Jinling (n. ° 2010062412). Toda la cirugía se realizó bajo pentobarbital de sodio y la anestesia con ketamina y los animales se sacrificaron por sobredosis de anestesia. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. muestras de sangre humana se obtuvieron de donantes informados y el procedimiento se llevó a cabo en estricta conformidad con el procedimiento aprobado por el Comité de Ética del Hospital Jinling. donantes de muestras de sangre han proporcionado sus consentimientos informados por escrito para participar en este estudio.
Líneas Celulares
células de carcinoma de pulmón de Lewis murino, células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 y SPC-A1 se adquirieron de Shanghai Instituto de bioquímica y biología celular (Shanghai, china). HUVECs fueron adquiridos de KeyGen Biotech (Nanjing, China). Murino de Lewis células de carcinoma de pulmón [19] se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (Invitrogen, EE.UU.) complementado con 100 U /ml de penicilina, suero bovino fetal 100 mg /ml de estreptomicina y 10%. células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 [8] y SPC-A1 [21] se mantuvieron en nuestro laboratorio y cultivadas en medio RPMI-1640 (Gibaco, EE.UU.) suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 10% de suero de ternera fetal . HUVECs [22] se cultivaron en F12K (Mediatech) suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 10% de FBS, 0,1 mg /ml de heparina, 0,03 mg /ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales (Sigma Aldrich). Todas las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
Modelos Animales
SPF ratones C57BL /6 y ratones desnudos BALB /C (6-8 semanas de edad) fueron adquiridos de la Academia de Ciencias Médicas Militares (Pekín, china), mantenidos en el Departamento de Medicina comparativa del hospital Jinling y criados bajo condiciones de temperatura y humedad controladas, ya 12 horas de oscuridad, ciclo de 12 horas de luz con comida estéril y agua ad libitum. Hemos establecido tres modelos animales en el presente estudio. Dos modelos de xenoinjertos de adenocarcinoma de pulmón humano se establecieron por inoculación subcutánea de células A549 y células SPC-A1 (1 × 10
6 /l de PBS), respectivamente, en el flanco derecho de ratones desnudos BALB /c. Para el tercer modelo de tumor, C57BL /6 ratones fueron desafiados por vía subcutánea en el flanco derecho con 1 × 10
6 Lewis células de carcinoma de pulmón en 100 l de PBS. volúmenes de los tumores subcutáneos se midieron diariamente por los volúmenes de la pinza y tumorales se calcularon por la fórmula:. volumen del tumor = 0,52 x longitud x anchura
2
Análisis de Generación y Celular fenotipo de células CIK
se generaron las células CIK humanos como se describe anteriormente [23]. Brevemente, las muestras de sangre de donantes que consienten se procesaron utilizando Ficoll-Hypaque centrifugación en gradiente de densidad (Beijing Reactivos químicos Company, China) para separar las células mononucleares de sangre periférica. Después de lavar en el medio, las células se resuspendieron en medio RPMI-1640 (10% de FCS, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina) a una densidad de 2-4 x 10
6 células /ml. Se añadió el 1000 U /ml de interferón-γ (Peprotech, EE.UU.) en el primer día de la cultura. Después de 24 horas, 500 U /ml de interleucina-2 (Peprotech, EE.UU.) y se añadieron 50 ng /ml de anticuerpo anti-CD3 (eBioscience, EE.UU.). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y fueron sub-cultivadas cada 2-3 días con medio completo fresco con 300 U /ml de interleucina-2 (Peprotech, EE.UU.) durante 2 semanas. La generación de células CIK de ratón a partir de células de bazo se hizo funcionar similar a la de las células CIK humanos. Con el fin de caracterizar los fenotipos de las células CIK, las células cultivadas durante 7, 14 y 21 días se recogieron y se tiñeron durante 30 min a 4 ° C con los siguientes anticuerpos monoclonales FITC o PE-conjugado (mAbs): anti-CD3 y anti CD56. Por citometría de flujo, la expresión de marcadores de superficie, CD3, CD56 se examinaron y se registró (Fig. S2). Todos los anticuerpos se obtuvieron a partir de (eBioscience, San Diego, CA) utilizando procedimientos estándar. Un total de 100000 células por muestra fueron adquiridos y analizados en un FACS Calibur-y CellQuest software (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).
Protocolo de Tratamiento
Balb /c ratones desnudos fueron desafiados por vía subcutánea en el flanco derecho con 100 l (1 × 10
7 /ml) células A549. Cuando los volúmenes tumorales fueron de aproximadamente 100 mm
3, los animales fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos (n = 4-5 por cada grupo), y se iniciaron los tratamientos. El día en que se inició el tratamiento fue designada D0. La terapia antiangiogénesis en este estudio fue la inyección subcutánea de 5 mg /kg rh-endostatina por 7 días y la inmunoterapia adoptiva consistió en dos transfusión intravenosa de células CIK en D6 y D9 (2 × 10
7 células por dosis en un total volumen de 100 l). Las agrupaciones detallados fueron los siguientes (Fig S1.): (1) Grupo de NS, se trataron con solución salina normal (NS). (2) Grupo de ES, se trató con rh-endostatina solo. (3) Grupo de CIK, se trató con células CIK solo. (4) Grupo ES + CIK, se trató con rh-endostatina seguido por la transfusión de células CIK. El peso corporal y el volumen tumoral se registraron diariamente. El sinergismo de dos terapias se evaluó de acuerdo con la siguiente fórmula:. Q = E
A + B /[E
A + (1-S
A) E
B] [24]
E
A + B, la tasa de inhibición de la terapia combinada.
E
A, la tasa de inhibición de la terapia antiangiogénica rh-endostatina.
E
B, la tasa de inhibición de células CIK adoptiva inmunoterapia
q. & lt; 0,85 significa que las dos terapias son antagonismo
q & gt;.. 1.15 significa que las dos terapias son sinergismo
0.85≤ q ≤1.15 significa las dos terapias son aditivos.
El experimento se repitió con cuatro grupos de /6 ratones C57B que llevan el carcinoma de pulmón de Lewis y cuatro grupos de ratones desnudos BALB /C que llevan el carcinoma de pulmón SPC-A1.
Cultura Condiciones
hipóxico condiciones de incubación se llevó a cabo en una estación de trabajo anaeróbico incubador humidificado (Bug Box; ALC Internacional, Cologno Monzese, Milán, Italia). Una mezcla de gas de 1% O
2, 5% de CO
2, y 94% N
2 se inyectó continuamente a una velocidad de flujo de 25 L /min en la incubadora estación de trabajo anaeróbico. Para la condición de normoxia, las células se cultivaron a 37 ° C en un incubador humidificado que consiste en 20% O
2, 5% de CO
2, y 75% N
2. Todos los reactivos incluidos los materiales de media y plásticos utilizados para los tratamientos de hipoxia se equilibraron en la cámara anaeróbica para minimizar la contaminación con el aire.
diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) Etiquetado
El etiquetado de las células CIK con CFSE se llevó a cabo como se informó anteriormente [25]. Brevemente, las células CIK humanos fueron marcadas con CFSE (Molecular Probes Biotec., Concentración final de 5 mol /L en PBS) y se incubaron en 37 ° C durante 6 minutos. La reacción de marcado se interrumpió mediante la adición de frío RPMI-1640 con 10% de FCS, y las células se lavaron dos veces con PBS con 2% de FCS para eliminar el exceso CFSE.
represión de Ensayo de proliferación de
CIK las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (10% de FCS, 100 u /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina) en placas de 96 pocillos bajo normoxia o hipoxia. El anticuerpo anti-CD3 y la interleucina-2 se añadieron en los medios de comunicación a fin de estimular la división de las células CIK. Cuarenta y ocho horas después, las células se contaron por CIK hemocitometría bajo microscopio de luz.
in vitro Ensayo de citotoxicidad
Los citotoxicidad de las células CIK contra células diana en condiciones de normoxia e hipoxia se analizaron mediante el uso de CytoTox 96 ® ensayo de liberación de deshidrogenasa no radiactivo ensayo de citotoxicidad lactato (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Brevemente, se colocaron células A549 en dos placas de 96 pocillos a 1 x 10
5 células /pocillo y se incubaron durante 48 h con células CIK en 20:01, 40:1 efector a diana (E-a-T ) proporciones. Un volumen de 30 l sobrenadante de cultivo celular se transfirió a placas de 96 pocillos de fondo plano transparente, seguido de la adición de 30 l de sustrato. Después de incubar durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente, la reacción se detuvo mediante la adición de solución de parada 30 l. A partir de entonces, la absorbancia se midió a 490 nm. La liberación máxima de LDH se realizó por completo de lisis células diana. Las células diana o células efectoras solo se utilizaron como controles negativos (liberación espontánea). La tasa de destrucción se determinó según la fórmula: matar tasa (%) = [(recuentos experimentales - recuentos de control efectoras -target recuentos espontáneos) /(apuntar los valores máximos - diana recuentos espontáneos)] x 100
La transmigración
. ensayo
ensayo de transmigración se llevó a cabo con inserciones Transwell ™ (Costa, EE.UU.) que contienen la cultura HUVEC. HUVECs se añadieron a la cámara superior y se incubaron en condiciones de normoxia o condición hipóxica durante 24 h, respectivamente. Un total de 1 × 10
a continuación, se añadieron 6 CIK células en 200 l de medio RPMI-1640 sobre la capa de HUVECs con sobrenadante de las células A549 de cultivo añadido en la cámara inferior y luego se incubaron en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia durante 48 h, respectivamente . células CIK que migraron a la cámara inferior se cosecharon y se contaron por hemocitometría.
inmunocitoquímica
Después de la incubación en condiciones de cultivo hipóxicas o normoxia durante 48 h, las HUVEC se fijaron con etanol al 70% durante 10 min y se permeabilizaron por 0,1% Triton X-100 durante 5 min. 5% de BSA en PBS se utilizó para bloquear la unión no específica de anticuerpos. Anti-ICAM-1 de anticuerpos (Abcam, Cambridge, MA) y anti-VCAM-1 anticuerpo (Abcam, Cambridge, MA) se utilizaron para detectar la expresión de la adhesión celular intercelular molécula-1 de adhesión celular endotelial (ICAM-1) y vascular molécula-1 (VCAM-1) por HUVECs. Las imágenes fueron adquiridas mediante el uso de Olympus BX-60 microscopio a 400 × magnificación.
Las células CIK adherencia a las células endoteliales in vitro
Subconfluent monocapas de HUVEC en placas de 6 pocillos se preincubaron en normoxia o hipoxia condiciones de cultivo durante 48 h. Después de la preincubación, las células CIK (2 × 10
6 células /pocillo) se transfirieron a los cultivos de HUVEC y se incubaron durante 24 h en las mismas condiciones de cultivo como el HUVECs. células desprendidas se eliminaron mediante dos lavados cuidadosamente utilizando PBS y las células restantes se tiñeron con anticuerpos de conejo anti-ratón CD3 (Abcam, Cambridge, MA) para detectar las células CIK. Imágenes de células adherentes fueron adquiridas mediante el uso de Olympus BX-60 microscopio a 200 × magnificación.
Tumor hipoxia Medición
El hypoxyprobe ™ -1 Kit (Pharmacia Natural Internacional, Inc, Burlington, MA, EE.UU., constituida por 100 mg pimonidazole sólida HCl (hypoxyprobe ™ -1) y el anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón 1,0 ml (mAb1)) se utilizaron para estudiar más a fondo el efecto de rh-endostatina en la hipoxia tumoral. La base de esta medición es que pimonidazole se activa por reducción cuando el tejido pO
2 está por debajo de 10 mmHg y las formas intermedias activados aductos covalentes estables con los grupos tiol en las proteínas, péptidos y aminoácidos. Estos aductos pueden ser detectados por medios inmunoquímicos cuando se combinan con el mAb1 reactivo de anticuerpo. Para la detección de la hipoxia tumoral, los ratones cargados de carcinoma de pulmón A549 se les dio 60 mg /kg de peso pimonidazole HCl (hypoxyprobe ™ -1) por vía intraperitoneal 4 h antes de ser sacrificado en tres puntos de tiempo diferentes (días 3, 6, 9). Los tumores se diseccionaron y se fijaron en formalina al 10%, embebidos en parafina y después se tiñeron con un ratón IgG
1 anticuerpo. Las imágenes de las secciones fueron adquiridas mediante el uso de Olympus BX-60 microscopio a 100 × magnificación zonas hipóxicas y se analizaron usando el software de análisis de imágenes digitales imagen J (NIH, Maryland, EE.UU.).
En vivo Seguimiento de las células CIK
Siete días después de la administración de rh-endostatina, los ratones portadores de tumores A549 se transfunden con células CIK CFSE marcado con (2 × 10
7 células en un volumen total de 100 ul). La solución salina normal fue utilizado como control negativo (n = 4 animales por grupo). Veinticuatro horas después de la transfusión CIK células, los ratones fueron sacrificados y suspensiones de células individuales de bazo y el tumor de tejido se prepararon a partir de dos grupos. Análisis del porcentaje de células CIK marcadas con CFSE se realizó en un FACS Calibur-(BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Diez miles GaTeD se recogieron eventos y analizados mediante el software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).
Citometría de Flujo
Siete días después del tratamiento de rh-endostatina, portadores de tumores se sacrificaron los ratones C57BL /6. Los tumores y los bazos se recogieron y se prepararon suspensiones de células individuales. Los eritrocitos se eliminaron después de la incubación en tampón erylysis [155 mmol /L NH4Cl, 10 mmol /L KHCO3, y 0,1 mmol /L EDTA (pH 7,4)] a temperatura ambiente durante 10 min. Las células se tiñeron durante 30 min a 4 ° C con los siguientes anticuerpos monoclonales FITC o PE-conjugado (mAbs) anti-CD11b y Gr-1 para las células supresoras de origen mieloide (MDSCs), anti-F4 /80 y MHC /II para los macrófagos asociados al tumor (TAM). Todos los anticuerpos se obtuvieron a partir de (eBioscience, San Diego, CA) utilizando procedimientos estándar. Un total de 100000 células por muestra fueron adquiridos y analizados en un FACS Calibur-y CellQuest software (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).
Microscopia intravital y permeabilidad vascular Ensayo
A549 ratones portadores de tumores se trataron con rh-endostatina (5 mg /kg, sc) para consecutivos 7 días con solución salina normal como control. En los días 3, 6 y 9, los ratones fueron anestesiados por administración intraperitoneal de pentobarbital sódico (40 mg /kg de peso corporal) y ketamina (20 mg /kg de peso corporal). En pocas palabras, los ratones se mantuvieron calientes usando almohadillas de calor durante todo el procedimiento quirúrgico. Una capa de la piel (12 mm) alrededor del tumor se extirpó quirúrgicamente para crear una ventana de observación. Después de la adición de PBS estéril, una lente de contacto estéril delgada se utiliza para cubrir el sitio quirúrgico y proporcionar acceso visual a la red vascular del tumor (Fig. S3A). Después de la cirugía, el ratón se fijó bajo microscopio de fluorescencia y se observó la vasculatura interesado. Después de la administración i.v. inyección de 20 mg /kg de tinte azul de Evans (Sigma-Aldrich, EE.UU.), se registró el supuesto de distribución de azul de Evans durante unos 10 minutos. La extravasación de azul de Evans se analizó en el vídeo grabado. Los datos fueron confirmados por el ensayo de extracción azul de Evans después de la terminación del examen de microscopía intravital.
subcutáneamente inmunohistoquímica
C57BL /6 ratones fueron desafiados en el flanco derecho con células de carcinoma de pulmón de Lewis. Cuando los volúmenes tumorales fueron de aproximadamente 100 mm
3, los animales se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de acuerdo con el protocolo de tratamiento, y los tratamientos se iniciaron el día 0. En el día 14, los tumores de todos los grupos experimentales fueron retirados y las muestras de tumor se fijaron en 4% de formalina e incluidos en parafina para estudios de inmunohistoquímica. Adyacentes secciones de 3 micras se hicieron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). Los anticuerpos de conejo anti-CD3 de ratón (Abcam, Cambridge, MA) se utilizaron para detectar linfocitos T. Imágenes de las secciones fueron adquiridas mediante el uso de Olympus BX-60 microscopio a 200 × 400 × y ampliación. Se obtuvo el número de CD3
+ linfocitos T contando las células teñidas CD3-positivas. Se evaluaron al menos diez campos al azar para cada sección independientemente por dos observadores. se utilizaron los resultados de consenso para los números finales de los linfocitos T.
inmunofluorescencia
muestras de tumores A549 fueron fijadas en formol al 4%, se incluyeron en parafina y se hicieron secciones adyacentes de 3 m para los estudios de inmunofluorescencia. Las láminas fueron deparaffined en xileno y rehidratada en etanoles graduales y se aclararon en DH
2O. Los portaobjetos se hirvió durante 2 minutos en tampón de citrato (Zymed), se enfrió durante 15 minutos y después se lavó en PBS durante 5 minutos. Las muestras se incubaron durante 1 hora en una solución de bloqueo, y después se incubaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche. Rat anticuerpos anti-CD31 de ratón (1:50; Abcam, Cambridge, MA) fueron utilizados para teñir las células endoteliales vasculares, conejo anti-ratón alfa actina de músculo liso (α-SMA) anticuerpos (1:200; Abcam, Cambridge, MA) se utilizaron para teñir los pericitos. Los tejidos tumorales fueron doble teñidas con anticuerpos anti-CD31 y anticuerpos anti-α-SMA. Los portaobjetos se aclararon en PBS y se incubaron en anticuerpos secundarios durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Los anticuerpos secundarios fueron de cabra FITC-conjugado anti-rata y anticuerpos TRITC anti-conejo de cabra. Las láminas fueron lavadas en PBS. Se capturaron imágenes de las secciones. la densidad microvascular (MVD) se evaluó como se ha descrito previamente por dos observadores independientemente [26]. En resumen, las secciones se proyectarán en menores aumentos (× 100) para identificar las diez áreas que contienen el mayor número de capilares y vénulas pequeñas. Dentro del área seleccionada, células endoteliales teñidas CD31-positivo (MVD) y CD31 /α-SMA buques de doble-manchado se contaron con un aumento de 400 ×.
Dynamic Contrast mejorada de imagen de resonancia magnética (RM-RT)
ratones portadores de tumores A549 fueron tratados con rh-endostatina (5 mg /kg, sc) para consecutivos 7 días con solución salina normal como control. En los días 3, 6 y 9, los ratones fueron anestesiados y RM-RT se llevó a cabo. DCE-MRI se realizó utilizando un 3 tesla de todo el cuerpo MR-escáner (Siemens Symphony) en combinación con una bobina de pequeños animales para la excitación y recepción de la señal. MR-morfológica de imágenes se realizó mediante una secuencia potenciada en T2 transversal turbo-spin eco (tiempo de repetición, TR 650 ms, tiempo de eco, TE 24 ms, campo de visión, FOV de 70 × 70 mm2, grosor de corte de 2 mm). Se obtuvo un mapa T1 de la sección del tumor con 3 ángulos Flip (5 grados, 15 grados y 30 grados), y los valores de T1 se calcula estimación de la curva. Cinética de la del agente de contraste en los tumores se registraron utilizando una secuencia ponderada en T1 inversión-recuperación FLASH (TR 5 ms, TE 2 ms, grosor de corte 5 mm, FOV 55 × 70 mm2). Después de iniciar la medición DCE-MRI, 0,1 ml (0,1 mmol /kg) de ácido penta-acético gadolinio dietilen-triamina agente de contraste paramagnético (Gd-DTPA) (Bayer-Schering Pharma) se inyectó manualmente dentro de los 5 s en la vena de la cola , 70 exploraciones dinámicas fueron adquiridas de una sección. Los datos se analizaron utilizando el modelo farmacocinético como se informó anteriormente y las imágenes paramétricas de K
trans (la constante de transferencia de volumen del agente de contraste) fueron producidos por análisis farmacocinético de la serie DCE-MRI [27].
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± error estándar (sE). Las diferencias entre los cuatro grupos se compararon mediante ANOVA, LSD y se aplicó para comparaciones múltiples medios. Las comparaciones de una sola medición entre dos grupos fueron evaluados mediante pruebas t no apareados. Se utilizó el análisis de correlación de Pearson para probar la correlación entre la hipoxia intra-tumoral y la acumulación de MDSC. Los valores de p & lt; 0,05 se tomaron como significativos. El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 16.0 (Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
Morfología Celular Observación y fenotipo de las células CIK
bajo microscopio, las células CIK mostró clúster de crecimiento similar. Las masas de células CIK multiplican de manera gradual y se hicieron más grandes después de 4 días de incubación. Existen dos subpoblaciones principales de células CIK, uno que expresan tanto las moléculas CD56 (CD3
+ CD56
+) y CD3 y el otro presenta una CD3
+ CD56
- fenotipo. Después de incubación durante 7, 14 y 21 días, se detectaron fenotipos de células CIK. Los porcentajes de células CD3
+ CD56
+ células CIK fueron 8,93%, 23,66% y 17,17% en el día 7, 14 y 21, respectivamente (Fig. S2).
Combinación de rh-endostatina las células CIK con adoptiva de transferencia significativamente inhibe el crecimiento de carcinoma de pulmón in vivo
Para determinar si la adición de rh-endostatina tiene ningún efecto sinérgico sobre la eficacia antitumoral de las células CIK, se establecieron tres modelos de tumores representativos. En A549 modelo de carcinoma de pulmón, se encontró que rh-endostatina el crecimiento del tumor poco limitado en comparación con el control de NS, pero no alcanzó significación estadística (929,46 ± 471,70 vs 1251,8 ± 531,75; p = 0,324). CIK células terapia adoptiva sí sola no tiene actividad antitumoral en comparación con el control NS (1192,1 ± 1251,8 ± 621,68 frente a 531,75, p = 0,852). Por el contrario, significativa (p & lt; 0,05) la actividad antitumoral fue visto después de la terapia de combinación en comparación con la monoterapia o el control NS (Fig 1A.). E
A = 1,35, E
B = 1,05, E
AB = 2.08 y q = 2,71, lo que confirma la evaluación del sinergismo. Se observaron resultados similares en modelos de carcinoma de pulmón de Lewis establecidos y SPC-A1. En SPC-A1 modelo de cáncer de pulmón, en comparación con el control NS, rh-endostatina (1152,8 ± 181,4 vs 1284,7 ± 229,2, p = 0,527) y CIK (1204,1 ± 536,2 vs 1284,7 ± 229,2, p = 0,698) en monoterapia no mostraron ninguna significativa efecto antitumoral. Sin embargo, significativo efecto antitumoral se logró en la terapia de combinación (p & lt; 0,05) (Fig 1B.). En el carcinoma de pulmón de Lewis, ni rh-endostatina (3394,7 ± 668,4 vs 3866,5 ± 490.62, p = 0,176) ni la terapia de células CIK (3429,6 ± 579,12 vs 3866,5 ± 490.62, p = 0,208) solo exhibió una inhibición obvio en el crecimiento del tumor en comparación con el NS controlar. Sin embargo, se demostró significativo efecto antitumoral sinérgico cuando se añadió rh-endostatina a la terapia CIK (2037,0 ± 294,6 3866,5 ± vs 490.62, p = 0,000) (Fig. 1C). En experimentos in vivo se repitieron dos veces. Y resultados similares se obtuvieron en tres diferentes modelos de carcinoma de pulmón todos los cuales sugieren que los efectos antitumorales sinérgicos se obtuvieron mediante la combinación de la terapia antiangiogénica-rh endostatina y las células CIK terapia adoptiva.
ratones desnudos BALB /c se inyectaron s.c. con células de cáncer de pulmón A549 y cuando el volumen de tumor alcanzó 100 mm
3, los ratones se dividieron en cuatro grupos al azar y recibieron protocolos respectivos de acuerdo con el esquema de tratamiento. SPC-A1 y pulmonares xenoinjertos de carcinoma de Lewis se establecieron y se les da tratamientos similares. A, efecto anti-tumor sinérgico se muestra cuando rh-endostatina se combinó con terapia adoptiva CIK en la supresión del crecimiento del tumor A549 (p & lt; 0,05). Rh-endostatina o terapia CIK solo no suprimió significativamente el crecimiento del tumor. B, rh-endostatina mostró un efecto antitumoral sustancial cuando se administra en combinación con células CIK en la inhibición de carcinoma de pulmón de SPC-A1 (p & lt; 0,05). C, se mostró efecto anti-tumor sinérgico cuando rh-endostatina se combinó con terapia adoptiva CIK en la supresión de Lewis crecimiento de carcinoma de pulmón (p & lt; 0,05). Puntos, medio de los volúmenes tumorales de ratones por grupo; Bares, SE. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
Rh-endostatina Disminuye la densidad microvascular y promueve la normalización del tumor Embarcación
En nuestro estudio anterior, encontramos que la densidad microvascular y se redujo la cobertura de colágeno se aumentó en rh-endostatina en el carcinoma de pulmón de Lewis murino teniendo ratones C57BL /6 [19]. En el presente estudio, se evaluó la densidad microvascular (MVD) en ratones portadores de tumores A549. En el día 3, 6 y 9, los ratones de cada grupo fueron sacrificados y las muestras de tumores se prepararon para la tinción de inmunofluorescencia. 3A.