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PLOS ONE: La cuantificación de células tumorales circulantes en raras células no pequeñas de cáncer de pulmón por PCR


Extracto

Antecedentes

La cuantificación Targeted-ligando de las células tumorales circulantes (CTC) es valiosa para la evaluación de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). La sensibilidad de los métodos actuales limita su uso para detectar CTC raras en etapa temprana. Aquí se evalúa un nuevo método, la reacción en cadena de la polimerasa ligando-dirigida (LT-PCR), que puede detectar las CTC raras en pacientes con CPNM.

Métodos

CTC fueron enriquecidos por la depleción inmunomagnética de los leucocitos y a continuación, marcado por un conjugado de un ligando específico del tumor y un oligonucleótido. Después de lavar conjugados libres, los conjugados unidos se eliminan de los CTC y luego analizados por qPCR. Para evaluar la utilidad clínica, las muestras de sangre se obtuvieron de 72 pacientes con CPNM (33 diagnosticado inicialmente y 39 de la quimioterapia), 20 pacientes benignos, y 24 donantes sanos.

Resultados

Los experimentos con sangre sana pinchos con células tumorales indicó el LT-PCR permite la detección específica de CTC. El estudio clínico demostró que los pacientes inicialmente diagnosticados tienen un promedio de 20,8 unidades de CTC con enfermedades metastásicas, 11,8 unidades de CTC con enfermedades localizadas, y 6,0 unidades de CTC con enfermedades benignas. Con el umbral de 8,5 unidades de CTC, el ensayo puede detectar el 80% de fase I /II, el 67% de fase III, y el 93% de los cánceres en etapa IV. Con los pacientes benignos y donantes sanos como grupo de control, el método puede detectar el cáncer con una sensibilidad del 81,8% y una especificidad del 93,2%.

Conclusión

El LT-PCR permitiría la cuantificación de CTC en pacientes con CPNM en un nivel más sensible, proporcionando una herramienta potencial para la estratificación de las enfermedades pulmonares malignas, especialmente en las primeras etapas

Visto:. Lou J, Ben S, Yang G, X Liang, Wang X, Ni S , et al. (2013) La cuantificación de células tumorales circulantes raras en células no pequeñas de cáncer de pulmón mediante PCR Targeted-ligando. PLoS ONE 8 (12): e80458. doi: 10.1371 /journal.pone.0080458

Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América

Recibido: 17 Julio, 2013; Aceptado: 2 Octubre de 2013; Publicado: 6 de diciembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Lou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto llave de la Comisión de Ciencia y Tecnología de Shanghai (Grand No: 10411950600). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Los autores declaran que Dr.Guohua Yang es empleado por Genosaber Biotech. Al mismo tiempo, se lleva a cabo opciones de menor importancia Stock (& ​​lt; 5%). Durante el período de investigación, el Dr. Yang sólo proporciona apoyo técnico a nosotros para completar la investigación clínica. Esta asistencia técnica incluye el análisis de datos y la descripción técnica del método en el manuscrito. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.

Introducción

Las células tumorales circulantes (CTC), conocidos como "biopsia líquida", es una facilidad marcador accesible para la progresión del cáncer de monitoreo, la respuesta al tratamiento y la recurrencia de enfermedades malignas. Especialmente, CTC se hace aún más importante cuando biopsia de tejido no es adecuado para cierta población de pacientes. Significado clínico de la CTC en el CPNM se ha informado ampliamente en estudios recientes. se informó de un alto número de CTC detectado asociar con mal pronóstico en el cáncer de pulmón metastásico [1] - [5]. Detección de determinados mRNA o de múltiples genes en CTC se puede utilizar para el pronóstico de los resultados de la cirugía citorreductora y radioterapia en pacientes con CPNM [6] - [10]. Más recientemente, la caracterización molecular de CTC en NCSLC se ha demostrado que potencialmente guiar la terapia [1], [11]

Para avanzar en la detección de CTC al siguiente nivel, surgieron varias tecnologías prometedoras para el enriquecimiento de CTC: 1). CTC fue positivamente, immunomagnetically capturado por anti-EpCAM perlas magnéticas (molécula de adhesión celular epitelial) recubiertas de anticuerpo [7], [12], 2) CTC fue enriquecido por agotamiento inmunomagnética de leucocitos con perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo anti-CD45 [5], [13]. 3) CTC se enriqueció con dispositivos de filtración basado en tamaño [14], 4) CTC se enriqueció con un dispositivo basado en chip con la firma microestructura [15], y 5) CTC se enriqueció con el agotamiento simultáneo de eritrocitos y leucocitos mediante centrifugación en gradiente de densidad [16], [17]. Para el análisis posterior, cuantitativa de CTC, la fracción enriquecida usando los métodos antes mencionados se immunofluorescently etiquetado y luego examinada microscópicamente o por medio de citometría de flujo [12], [18] - [21]. Aunque los métodos basados ​​en inmunofluorescencia mostraron alta especificidad, la sensibilidad puede no ser suficiente para detectar células raras en la etapa temprana del cáncer [4], [12], [22]. reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) también se utilizó para el recuento de CTC con alta sensibilidad [8], [23], [24]. Sin embargo, la regulación post-transcripcional que desregula la expresión de genes se encuentra en numerosas células del cáncer [25] - [27]. Esta regulación altera la expresión génica a través de modificaciones de la estabilidad del ARNm y /o la eficiencia de la transcripción, y hace que el contenido de proteína se correlaciona con el nivel de mRNA. LT-PCR, desarrollado por GenoSaber Biotech, mostró promesa en la detección de CTC a través de proteínas de la superficie. Aquí tenemos la intención de evaluar la capacidad de la LT-PCR para examinar CTC en pacientes con CPNM. En este método, CTC se marcó con un conjugado de un ácido fólico ligando específico de tumor, unido selectivamente a células de cáncer de pulmón de células no pequeñas de sobre-expresión de receptor de folato [28] - [31], y un oligonucleótido sintetizado (Figura 1) . El conjugado sirve como una molécula de adaptador para convertir un CTC en detector de moléculas "oligonucleótidos" que pueden ser amplificados para el análisis cuantitativo. Se propone este estudio para evaluar el valor clínico de la detección de receptor de folato CTC positivo en pacientes con CPNM.

Después del enriquecimiento negativa inmunomagnética por el agotamiento de leucocitos, CTC fueron etiquetados con un conjugado de un ligando específico del tumor y un oligonucleótido. Los CTC marcadas se lavaron a fondo para eliminar los conjugados libres. A continuación, los conjugados unidos se eliminan de CTC y analizados por qPCR.

Materiales y Métodos

Los reactivos

El kit de células de cáncer de pulmón que circula CytoploRare® fue proporcionada por GenoSaber Biotech Co. Ltd. (Shanghai, china). El kit comprende dos componentes: uno es para CTC enriquecimiento y el otro es para la detección y cuantificación CTC. El componente de enriquecimiento incluye tampón de lisis de glóbulos rojos, tampón de incubación, las perlas magnéticas anti-CD45 de agotamiento de leucocitos, tampón de lavado, tampón de etiquetado, tampón y tampón de neutralización de extracción. El componente de detección y cuantificación incluye tampón de PCR reacción, los cebadores, agua desionizada, controles de células positivas y negativas, los controles de PCR y las normas. El primer secuencias se enumeran de la siguiente manera. cebador RT, 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTTCTAA-3 '; cebador directo, 5'-TATGATTATGAGGCATGA-3 '; cebador inverso, 5'-GGTGTCGTGGAGTCG-3 '; Sonda TaqMan, 5'-FAM-CAGTTGAGGGTTC-MGB-3 '.

Siguiendo el manual de instrucciones del fabricante, CTC se enriqueció con la lisis de los eritrocitos y el agotamiento de leucocitos de inmunomagnética 3 muestra de sangre ml. El CTC enriquecido se marcó con un conjugado de un ácido fólico ligando específico del tumor y un oligonucleótido sintetizado. Después del etiquetado, la CTC enriquecido se lavó a fondo para eliminar los conjugados no unidos. A continuación, los conjugados unidos se eliminan específicamente de la superficie CTC y se recogieron para el análisis de PCR cuantitativa (Figura 1). Antes de la amplificación, el conjugado recocida primera y extendió sobre la imprimación RT. Después de que el conjugado extendido se amplificó y se analizó usando una sonda Taqman método de PCR cuantitativa basada. En el método anterior, se identificaron las células tumorales circulantes como células positivas al receptor de folato como los marcados por oligonucleótidos de folato-linked.

Línea celular

Se utilizó la línea celular de cáncer de nasofaringe humana KB, que expresa folato receptor 1 (FR) en la superficie celular, para evaluar la relación de recuperación en el ensayo de células de pinchos. Las células se cultivaron en KB por déficit de folatos medio RPMI-1640 (Life Technologies) con suero bovino fetal al 10% (Life Technologies) a 37 ° C en atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2.

Los pacientes

Setenta y dos pacientes con CPNM, 20 con enfermedades pulmonares benignas y 24 del género y donantes sanos de la misma edad se inscribieron en el estudio. En los pacientes con CPNM, 33 pacientes fueron diagnosticados inicialmente, y 39 pacientes estaban en la quimioterapia. características de los pacientes con cáncer están presentes en la Tabla 1. Las características de la cohorte de pacientes de enfermedades benignas se enumeran en la Tabla S1 S1 en el archivo. Tres mililitros de sangre periférica fueron retiradas en tubos anticoagulantes que contienen EDTA de sujetos participantes este estudio. Todos los pacientes voluntarios sanos y se incluyen en este estudio consentimiento informado por escrito firmado antes de donar sangre. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital del Hospital del Tórax Shanghai y Comité de Ética del Hospital Afiliado de la Universidad de Nantong.

Preparación de la muestra

Para preparar las muestras de sangre para análisis de PCR, eran CTC enriquecida por la lisis de eritrocitos y la posterior agotamiento de leucocitos se hace referencia al protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras de sangre entera anticoagulantes se lisaron primero por tampón de lisis de glóbulos rojos (v:v, 1:04) durante 15 min en hielo. Las células se trataron a continuación con 200 l anti-CD45 perlas magnéticas recubiertas durante 30 min para agotar los leucocitos. Después de eso, CTC se incubó con tampón de etiquetado 10 l (oligonucleótido folato ligada) durante 40 min a temperatura ambiente. Después, las células se lavaron 3 veces con 1 ml de tampón de lavado a 500 g. Finalmente, las células se trataron con 120 l de tampón de decapante para eliminar los conjugados de ligando-oligonucleótido. El sobrenadante se recogió por centrifugación y se neutralizó por 24 l de tampón de neutralización para análisis PCR.

análisis PCR

reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando el kit de células de cáncer de pulmón que circula en CytoploRare® ABI sistema StepOne ™ (Life Technologies). Dos y medio microlitros de las muestras preparadas se añadieron en un sistema de reacción de 25 l PCR siguiente manual de instrucciones del fabricante. Las condiciones de reacción PCR fueron las siguientes: desnaturalización a 95 ° C durante 2 min, hibridación a 40 ° C durante 30 s, extensión a 72 ° C durante 30 s, a continuación, enfriamiento a 8 ° C durante 5 min; 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 10 s, hibridación a 35 ° C durante 30 s, y extensión a 72 ° C durante 10 s. Una serie de normas que contienen oligonucleótidos (10
-14-10
-9 M, que corresponde a 2-2 × 10
5 unidades de CTC /3 ml de sangre) se utilizan para CTC cuantificación. Todas las muestras de los pacientes se ensayaron en duplicados con 6 normas y 3 controles de calidad. Por el protocolo del fabricante, la varianza intra-ensayo de media (la diferencia máxima entre duplicados) debe ser & lt; ciclo de 0,5 umbral para los estándares y controles de calidad, y & lt;. Ciclo 1 umbral para las muestras analizadas

Recuperación, linealidad y límite de cuantificación de los estudios

para establecer un sistema legítimo para evaluar la exactitud y linealidad de este ensayo, las muestras de sangre de donantes sanos se agruparon y se alicuota en 3 mL las muestras, que fueron sobrecargadas con 5, 10, 20 , 40 y 200 células KB cultivadas. El, la sangre no enriquecida combinada sirvió como control negativo (NC). Doscientos mil células KB cultivadas sirven como una referencia positiva (PR). Los experimentos anteriores se repitieron 3 veces. Los recuentos de células observadas fueron calculados por la siguiente ecuación:. La tasa de recuperación se determinó dividiendo la cantidad de la célula observada por la cantidad de las células de pinchos

Para determinar la linealidad del ensayo, se ha analizado la observado y claveteado CTC cuenta a través de todos los puntos de datos por regresión lineal. Hemos eliminado la variable de confusión del porcentaje de recuperación utilizando el valor observado de la muestra original dividido por los factores de dilución para determinar los valores esperados para la serie de dilución para cada muestra analizada.

La inmunotinción de CTC enriquecido

Tres muestras de sangre de dos mililitros no pequeñas pacientes con metástasis de cáncer de pulmón de células se enriquecieron mediante el protocolo antes mencionado. Las muestras de CTC enriquecidos y células KB cultivadas se fijaron con metanol durante 10 min a -20 ° C. A continuación, las células se marcaron con un anticuerpo monoclonal pan-citoqueratina conjugado con ficoeritrina (sc-8018PE, Santa Cruz, diluido a 1:100) y unos conjugados fluorescentes de ácido fólico [19] (Wuxi AppTec, China, 10 nM) para 1 hora. Después de eso, la muestra se lavó tres veces con PBS, seguido de montaje con 4 '6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) que contiene el montaje de medios (tecnologías de la vida), y posteriormente se sometió a análisis de imagen usando una microscopía confocal (Leica Microsystems, Alemania).

las evaluaciones clínicas

Para evaluar la utilidad clínica, hemos llevado a cabo un estudio doble ciego de dos centros en los pacientes con enfermedades pulmonares benignas y malignas. Con el fin de evaluar la diferencia entre los grupos de prueba, se utilizó la prueba t de estudiante con la corrección de Welch para varianzas desiguales con intervalo de confianza del 95%. Para determinar el umbral, la especificidad y sensibilidad del método, los datos de los pacientes con NSCLC diagnosticado inicialmente se sometieron al análisis de funcionamiento del receptor característico (ROC) por Prism (GraphPad software). El criterio para determinar el valor de corte óptimo en el análisis ROC es maximizar el valor total de especificidad y sensibilidad.

Resultados

Calibración de PCR y la unidad de CTC

Como externa curva de calibración, se utilizaron seis estándares que contienen una serie de concentraciones de los oligonucleótidos conjugados para calcular la cantidad de receptores de folato en CTC (Figura S1). Para extrapolar la cantidad de CTC de la cantidad de receptores de folato, utilizamos una unidad definida arbitrariamente, llamada unidad de CTC. Según lo determinado por la curva de calibración, la cantidad de número de receptores de folato en 1 × 10
5 células KB es de 7,5 × 10
-14 mol, que se define como 1 × 10
5 unidades de CTC. El rango detectable del ensayo es de 2-2 × 10
5 unidad de CTC. Para los controles de calidad, la intra-ensayo coeficiente de variabilidad (CV) es del 2,6% al 3,8%, y el CV inter-ensayo es de 3,3% a 5,3% (Tabla S1 S2 en archivos).

Validación de el método PCR ligando-blanco de CTC cuantificación

la célula KB clavar estudio mostró que & gt; 80% de las células de púas se pudo recuperar en cada concentración (5, 10, 20, 40 y 200) (Figura 2A ). El coeficiente medio de recuperación de CTC fue del 81% a los 5 células enriquecidas en 3 ml de sangre, e incluso mayor en las muestras se trataron con mayor concentración de células. Con los resultados del estudio de remate, hemos realizado los mínimos cuadrados para la comparación de la cantidad observada y de púas a través de todas las series de dilución (Figura 2B). La ecuación de regresión fue y = 0,9455 x -0.831 con R
2 = 0,9946. El estudio indicó que más de la concentración CTC probado la recuperación media, como se deriva de un análisis de regresión, es del 94,6%.

Una tasa de recuperación) del ensayo de células de pinchos. B) Curva de regresión lineal de ensayo de células de pinchos. C) Ensayo de especificidad del ensayo. células KB con púas fueron tratados con (
compitieron
) o sin (
Control
) 10 M de ácido fólico antes de su etiquetado. muestras de sangre D) saludable de los donantes sobrecargadas con 20 KB células
(20 celdas)
o sin células tumorales KB
(control)
se marcaron en un 10 nM folato-oligonucleótido conjugado
(conjugado )
o no conjugados oligonucleótido-
(oligonucleótido)
después del mismo. Los datos se muestran con la Media ± SD de tres ensayos independientes.

Para evaluar la variación intra-ensayo (intraserial imprecisión), se analizó una muestra de 100 células KB en 3 ml de sangre de la misma ejecutar por triplicado siguiendo el protocolo anterior. A continuación, se evaluó la variación inter-ensayo (imprecisión entre-run) mediante el análisis de una misma muestra por triplicado en 6 ensayos separados en 6 días diferentes. El CV intra-ensayo es de 11,2%, y el CV inter-ensayo es del 14,2% (Tabla S3 en Archivo S1).

Para determinar la especificidad de este método se realizó un estudio de la competencia utilizando 10 mM de ácido fólico como ligando de competición a oligonucleótido folato-vinculado. Los resultados del experimento mostraron que el ácido fólico 10 micras puede bloquear el conjugado de la unión a las células KB (Figura 2C). El bloqueo proporciona la prueba de la especificidad del oligonucleótido ligado folato unido al receptor de folato en células KB con púas.

Debe tenerse en cuenta que hay señales "de fondo" para las muestras de sangre de donantes sanos. Para investigar el origen de la señal de "fondo", etiquetamos muestras de sangre de donantes sanos 'se disparó con 20 células KB o sin células tumorales KB utilizando conjugado de 10 nM folato-oligonucleótido o -oligonucleotide no conjugado (Figura 2D). Las muestras de sangre enriquecida con células tumorales no se unen a folato oligonucleótido ligado o no conjugados oligonucleótidos indiscriminatively, según lo determinado por qPCR. En contraste, las muestras enriquecidas con células tumorales pueden ser obviamente etiquetados por oligonucleótido folato conjugado en lugar del oligonucleótido no conjugada. El resultado sugiere que las señales "de fondo" fueron causados ​​por la unión de los oligonucleótidos a las células de la sangre residual en las muestras enriquecidas. Más importante aún, la señal de "fondo" causado por "efecto vinculante oligo-" no comprometería la detección específica de rara CTC como se demuestra a continuación.

A fin de evaluar la especificidad de la expresión de FR en la CTC en el CPNM, tres mililitro muestras de sangre de dos pacientes metastásicos que llevan FR CTC positivas fueron enriquecidas mediante el protocolo antes mencionado. A continuación, las muestras enriquecidas de CTC y células KB cultivadas fueron fijadas con metanol, y se marcaron por conjugados fluorescentes de ácido fólico, el anticuerpo monoclonal para citoqueratinas y reactivo de tinción nuclear DAPI,. Como se muestra en la Figura 3, las células KB y de las células tumorales circulantes se marcaron específicamente por los conjugados fluorescentes de folato (verde) y anticuerpo citoqueratinas (rojo). Por el contrario, los pequeños leucocitos no pueden ser etiquetados por los conjugados fluorescentes de folato y de anticuerpos citoqueratina (Figura 3H y 3L). Además, bajo la observación al microscopio, la CTC y las células KB cultivadas mostraron un nivel similar de la expresión del receptor de folato (Figura 3).

células KB (A-D) y CTC enriquecidos de dos pacientes con CPNM metastásico (CTC sample1 : e-H; CTC muestra 2: I-L) han sido fijadas por metanol, y se tiñeron para citoqueratina (a, e e I) y el receptor de folato (FR) (B, F y J). El núcleo de la célula se marcó mediante DAPI (C, G y K). Las imágenes fusionadas mostraron citoqueratina y receptor de folato se expresan sólo en CTC (H y L) y células KB (D), no en las células hematológicas.

CTC prevalencia en muestras clínicas

como se muestra en la Tabla 1, un total de 72 pacientes con CPNM se inscribieron en el estudio. A medida que los grupos de control, se obtuvo sangre periférica de 20 pacientes con enfermedades pulmonares benignas y 24 donantes sanos.

En primer lugar, se compararon los niveles de CTC en pacientes con cáncer al momento del diagnóstico inicial, los pacientes con enfermedades benignas, y sujetos sanos. Como se muestra en la Figura 4A, los niveles de CTC en la sangre de pacientes con localizada (estadio I, II y III, con una media de 11,9 unidad de CTC; rango 3,8 a 25,7 unidad de CTC;
p = 0,0011
) o metastásico (estadio IV , con una media de 20,9 unidad de CTC; rango 6,8 a 75,0 unidad de CTC;
p = 0.0055)
enfermedades es significativamente más alto que los voluntarios sanos (media 6,7; intervalo de 3,0 a 11,4 unidad CTC) y pacientes con enfermedades pulmonares benignas (media 6,0; 01.06 a 08.07 variar unidad CTC). Los pacientes con metástasis tienen más de CTC que los pacientes localizados (
p = 0,045
). Los anteriores resultados indican que los pacientes localizadas y metastásicos tienen distintos niveles de CTC. En un análisis más avanzado, queremos investigar la sensibilidad del método hacia los diferentes subtipos histológicos de NSCLC. Para los 16 pacientes con adenocarcinoma, los niveles de CTC (media 18,1, rango de 3,8 a 75,0) no muestran diferencias significativas entre los 11 carcinomas de células escamosas (SCC) de los pacientes (media 12,4, rango de 4,3 a 20,8) y otros subtipos histológicos (media 15,1, rango de 10,1 a 25,7) (Figura 4B). Este resultado sugiere la expresión del receptor de folato podría ser similar en todos los subtipos histológicos en pacientes con CPNM.

A) los niveles de CTC en la enfermedad localizada y metastásico maligno de pulmón, enfermedad pulmonar benigno y donantes sanos. B) Distribución de los niveles de CTC en diferentes subtipos histológicos. ADC, adenocarcinoma; SCC, carcinoma de células escamosas. C) de funcionamiento del receptor) análisis de las características (ROC entre el grupo de enfermedades pulmonares malignos y benignos como grupo sano.

A fin de analizar la sensibilidad y especificidad del ensayo para las diferentes etapas patológicas y subtipos histológicos en CPNM, primero tenemos que establecer el umbral de corte mediante análisis ROC. Figura 4C mostró que el umbral de corte entre el grupo de control (pacientes y voluntarios sanos benignos) y el grupo de cáncer diagnosticado inicialmente era de 8,5 unidad de CTC, la sensibilidad es del 81,8% y una especificidad del 93,2%. Obviamente, se detectaron CTC en muestras de sangre de 82% (27 de 32) de los pacientes con CPNM inicialmente diagnosticados, mientras que los falsos positivos en 20 pacientes benignos de la enfermedad (5%, 1 de 20) y 24 voluntarios normales fueron insignificantes (8%, 2 de 24 ). Como se muestra en la Tabla 2, 80% (8 de 10) de la etapa I-II, 67% (6 de 9) de la etapa III, y 93% (13 de 14) de pacientes en etapa IV se encontró que tenían más de 8,5 CTC unidad. En subtipos histológicos, el 69% (11 de 16) de los pacientes con adenocarcinoma eran CTC positivas, y el 91% (10 de 11) de los pacientes con SCC fueron positivos CTC.

Los estudios publicados indican que la quimioterapia puede comprometer la presencia de CTC en la circulación [1], [4], [5]. Se realizó un estudio preliminar para comparar el número de CTC en pacientes con CPNM en el diagnóstico inicial y la quimioterapia. Como se muestra en la Figura 5, 16 pacientes localizados en la quimioterapia (media 5,8, rango de 0,7 a 11,5) tienen significativamente más bajos niveles de CTC que los pacientes inicialmente diagnosticados (
p = 0,0006
); mientras que la diferencia en los niveles de CTC en pacientes metastásicos con o sin terapia no fue tan significativo como los pacientes localizados. Aunque el nivel medio del CTC en pacientes con metástasis al momento del diagnóstico inicial fue de 20,9 unidad de CTC en comparación con el 13,5 unidad de CTC en pacientes sometidos a quimioterapia, el t-test no comprobó que la diferencia fue significativa a un
p
valor de 0,05 . El análisis estadístico sugiere que los pacientes con CPNM localizadas pueden tener mejor pronóstico en comparación con los pacientes metastásicos cuando se ponen en la quimioterapia


w /o quimioterapia, los pacientes con CPNM
inicialmente diagnosticados.;
con quimio
, los pacientes con CPNM en la quimioterapia.

Discusión

Hemos evaluado la técnica LT-PCR para cuantificar CTC en muestras de sangre periférica de pacientes con CPNM. La tecnología se basa en el agotamiento negativo de leucocitos seguido de etiquetado de CTC con el oligonucleótido de folato-ligado y la posterior cuantificación con qPCR. Los estudios con muestras de sangre sanos se trataron con células tumorales demuestran que el ensayo es específico, cuantitativa y lineal de una gama de 5-200 células por 3 ml de sangre analizadas. La evaluación de las muestras de sangre de pacientes demuestra que el método es lo suficientemente sensible para estratificar a los pacientes con diferente estado de la enfermedad (benigna, localizado y metastásico).

Las ventajas potenciales de LT-PCR a los oncólogos pueden incluir 1 evaluación) no invasiva de la carga tumoral en la sangre periférica, 2) análisis ultrasensible que permite la estratificación avanzado de enfermedades pulmonares, 3) de tan sólo 3 volumen de muestreo ml que no haría más que agravar la anemia de los pacientes causados ​​por los efectos secundarios citotóxicos, 4) en tiempo real de seguimiento longitudinal de estado de la enfermedad y respuesta al tratamiento, y 5) la plataforma estandarizada que elimina el sesgo de análisis artificial.

La mayoría
in vitro
análisis de sangre para diagnosticar el cáncer de NSCLC sufren de posibles resultados negativos y /o positivos falsos. El uso de perlas magnéticas recubiertas anti-EpCAM se intentó para el enriquecimiento de CTC en muestras de sangre de NSCLC. Sin embargo, los estudios clínicos mostraron que la baja sensibilidad del enriquecimiento EpCAM basada en la detección de CTC para pacientes con NSCLC [12], [22]. Los estudios publicados indican también que la no EpCAM célula que expresa puede comprender la mayoría de CTC en sangre periférica CPNM, y por lo tanto EpCAM enriquecimiento basado puede no detectar CTC rara [22]. Se detectó la expresión del receptor de folato en EpCAM CTC positivas y negativas en pacientes con CPNM. perlas magnéticas recubiertas anti-EpCAM se utilizaron para separar la fracción EpCAM-positivas y negativas-EpCAM de los CTC. Encontramos el número FR positivo CTC fue mucho mayor en la fracción EpCAM-negativo que en la fracción EpCAM-positivas en los tres pacientes con CPNM (Figura S2). Los resultados indicaron que la captura basado EpCAM puede perder gran parte de las CTC en el cáncer de pulmón. El antígeno carcinoembrionario (CEA), una glicoproteína implicada en el desarrollo del cáncer de pulmón, también se encuentra en las células enfermas normales o benignos liberados en la circulación [32]. La aplicabilidad de CYFRA21-1, que es una citoqueratina 19 fragmentos liberados en la sangre, ha sido investigado en los estudios en el diagnóstico de NSCLC [33] - [35]. Aunque CYFRA21-1 puede ser el marcador tumoral más sensible en NSCLC avanzado, la sensibilidad de la CYFRA21-1 sigue siendo baja para enfermedad en estadio temprano [33], [35].

Los datos publicados a partir de biopsia de tejido han demostrado 72% -83% del cáncer de pulmón sobre-expresar la FR en la superficie celular [28] - [31]. Los informes recientes mostraron que la CTC FR positivos se encontraron en los cánceres de ovario [19]. Hasta el momento, no se han reportado estudios de la prevalencia de FR CTC positivo en el CPNM. En este estudio, hemos investigado el valor clínico de receptor de folato CTC positivo en el CPNM. Los resultados indicaron la FR es un marcador de superficie potencial en la identificación de pacientes con CPNM CTC, aún en etapa temprana. Estudios recientes mostraron que, en la masa del tumor primario, la expresión de FR es mucho menor en SCC que en adenocarcinoma en el cáncer metastásico [29]. Sin embargo, encontramos la expresión FR en el CTC es similar en todos los subtipos histológicos. Este hallazgo contradictorio se explica por diferente distribución de los estadios patológicos para los subtipos histológicos individuales. Iwakiri
et al.
Informó que la menor expresión de receptor de folato se encuentra en la etapa avanzada en comparación con las primeras etapas de NSCLC [36]. En los pacientes que participaron en nuestro estudio, el 48% tienen adenocarcinomas (etapa IV, 44%), 33% tienen carcinomas de células escamosas (estadio IV, el 27%) y el 18% tiene cáncer de pulmón no especificado. La positividad FR menor en los adenocarcinomas de nuestro estudio podría explicarse por el alto porcentaje de pacientes en etapas avanzadas inscrito en comparación con el grupo de SCC. Además, existe otra posibilidad de que CTC puede expresar FR diferente de las masas tumorales primarias. La literatura anterior indica la expresión génica diferencial entre el tumor primario y CTC de la muestra [37]. A gran escala, se necesita un estudio clínico bien diseñado para hacer frente a la preocupación anteriormente.

A pesar de receptor de folato se ha identificado en los tejidos normales, como el riñón, el bazo y el pulmón, etc [28]. Sin embargo, no hay células que expresan receptores de folato en el sistema circulatorio, excepto CTC o monocitos activados [19], [38]. Los estudios preliminares encontraron que esta subpoblación de monocitos activados es apenas detectable en las muestras de sangre de donantes sanos o pacientes benignos [19], [39]. En el 9% de los casos en los que "CTC" se puede detectar en muestras sanas, podrían existir posibilidad de expresión ilegítima de los monocitos. Sin embargo, la hipótesis debe ser verificado en un estudio adicional. la expresión del receptor de folato se encuentra también en los macrófagos activados tumorales [40]. Con el fin de examinar el efecto macrófagos en este sistema de detección en pacientes con CPNM, perlas magnéticas recubiertas anti-CD14 se utilizó para agotar los macrófagos activados en la muestra de sangre de los pacientes de NSCLC [41], después de la depleción de leucocitos CD45-positivo. Encontramos los recuentos de CTC fueron apenas cambiaron en el marco del tratamiento "extra-CD14" en pacientes con CPNM (Figura S3). Este resultado sugirió que el mecanismo de agotamiento usando perlas magnéticas anti-CD45 es suficiente para eliminar el impacto de los macrófagos asociados a tumores en cuenta CTC.

En este estudio, se encontró un bajo nivel de fondo "CTC" en los sujetos sanos y los pacientes con enfermedad benigna. Como se ha demostrado a partir del estudio de especificidad, la señal de fondo puede ser el resultado de la unión de oligonucleótido a las células de la sangre residual. Aunque la literatura anterior describe varios mecanismos para la unión del oligonucleótido a las células de mamífero [42], no hay consenso para este proceso biológico. Sin embargo, todos estos estudios demostraron que la cantidad de unión del oligonucleótido es significativamente menor en comparación con nuestros conjugados. Estamos seguros de que el "fondo CTC" no va a interferir con la detección de la verdadera "CTC" en pacientes con cáncer de pulmón
.
Por último, porque se reportaron un mayor número de CTC para asociarse con mal pronóstico en cáncer metastásico [ ,,,0],2], [4], [43], LT-PCR sería potencialmente identificar el subgrupo de pacientes con mal pronóstico en la etapa temprana de la enfermedad y por lo tanto los oncólogos de ayuda para prescribir terapias más eficaces. En un análisis más avanzado, el fenotipo de CTC proporcionaría evidencia directa para los oncólogos para determinar el régimen de tratamiento óptimo. Con ligando de afinidad apropiada (por ejemplo, anticuerpos, péptidos, pequeñas moléculas químicas, etc.), el LT-PCR se pueden explorar aún más para el fenotipo de rara CTC en un múltiplex, forma de alto rendimiento.

Apoyo a la Información
Figura S1. curva de calibración de los parámetros
qPCR y linealidad
doi:. 10.1371 /journal.pone.0080458.s001 gratis (TIF)
figura S2. la expresión del receptor de folato en
EpCAM CTC positivas y negativas en pacientes con CPNM. CTC muestras fueron enriquecidas de 3 ml de sangre de tres pacientes con CPNM FR positivos por lisis de los eritrocitos y el agotamiento inmunomagnética de los leucocitos. A continuación, las muestras enriquecidas CTC se incubaron con perlas anti-EpCAM magnéticos (tecnologías de la vida, Cat No. 16203) durante 30 min. Después del aislamiento inmunomagnética de 10 min, las células EpCAM positivas fueron capturados por las perlas magnéticas. Se recogieron las células negativas EpCAM a partir del sobrenadante por centrifugación a 600 g durante 15 min. Después de eso, las dos fracciones de muestra de CTC se marcaron y se detectaron como el protocolo anteriormente mencionado. Los datos se muestran con la Media ± SD de tres ensayos independientes qPCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0080458.s002 gratis (TIF)
Figura S3. Francia El impacto de los macrófagos asociados a tumores en pacientes con CPNM positivos FR. CTC muestras fueron enriquecidas de 3 ml de sangre de tres pacientes con CPNM FR positivos por lisis de los eritrocitos y el agotamiento inmunomagnética de leucocitos CD45-positivo. Tabla S1. Tabla S2. Tabla S3.

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