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PLOS ONE: La desregulación de MYC en el cáncer gástrico y sus implicaciones clinicopatológicas

2015/12/13


Extracto

Nuestro estudio investigó la relación entre el
MYC
alteraciones y características clínico en cáncer gástrico. Se evaluó el efecto de
MYC
la expresión de ARNm y su inmunorreactividad de proteínas, así como la variación del número de copias, la metilación de ADN promotora, y mutaciones puntuales, en 125 adenocarcinoma gástrico y 67 tejidos no neoplásicos paried. Hemos observado que el 77% de los tumores presentan inmunorreactividad MYC que se asoció significativamente con el aumento de la expresión de ARNm (
p Hotel & lt; 0,05). Estas observaciones se asociaron con la extensión del tumor más profundo y la presencia de metástasis (
p
& lt; 0,05). expresión de la proteína MYC también se observó con mayor frecuencia en los de tipo intestinal que en los tumores de tipo difuso (
p Hotel & lt; 0,001). Además,
MYC
ARNm y la expresión de la proteína se asociaron significativamente con el número de copias (
p Hotel & lt; 0,05). La ganancia de
MYC
copias se asoció con la aparición tardía, de tipo intestinal, estadio tumoral avanzado, y la presencia de metástasis a distancia (
p Hotel & lt; 0,05). Un hypomethylated
se detectó MYC
promotor en el 86,4% de las muestras tumorales.
MYC
hipometilación se asoció con los de tipo difuso, estadio tumoral avanzado, la extensión del tumor más profundo, y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos (
p Hotel & lt; 0,05). Por otra parte, dieciocho muestras de tumores presentan al menos una mutación conocida. La presencia de
MYC
mutaciones se asoció con tumores de tipo difuso (
p Hotel & lt; 0,001). Nuestros resultados mostraron que
MYC
desregulación se asocia principalmente con las características de mal pronóstico y también reforzó la presencia de diferentes vías implicadas en la de tipo intestinal y la carcinogénesis gástrica de tipo difuso. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que
Myc
puede ser un marcador útil para la estratificación clínico y el pronóstico

Visto:. De Souza CRT, Leal MF, Calcagno DQ, Costa Sozinho EK, Borges BDN, Montenegro RC, et al. (2013)
MYC
La desregulación en el cáncer gástrico y sus implicaciones clinicopatológicas. PLoS ONE 8 (5): e64420. doi: 10.1371 /journal.pone.0064420

Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón

Recibido: 30 Enero, 2013; Aceptado: April 12, 2013; Publicado: 22 de mayo 2013

Derechos de Autor © 2013 de Souza et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Los autores Agradecemos al Tecnológico Consejo Nacional de Desarrollo Científico y (CNPq; CRTdS, AKCRdS, SEBdS, RRB y MdACS) y la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo (FAPESP; DQC y MFL) que sustentan este trabajo en forma de subvenciones y becas. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico es el cuarto tipo de cáncer más frecuente y sigue siendo la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [1]. Este tipo de cáncer suele ser diagnosticado en etapas avanzadas y el único tratamiento curativo disponible requiere la resección quirúrgica [2]. Por lo tanto, el cáncer gástrico es un problema grave de salud pública en el mundo. Una mejor comprensión de la biología de esta neoplasia es crítica y puede ser útil para guiar el manejo del paciente, así como el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas.


MYC
es uno de los más estudiados oncogenes derivados de su asociación con un gran número de enfermedades [3]. MYC desempeña un papel en varias funciones fundamentales de la biología celular, incluyendo la regulación del crecimiento celular y la proliferación, el metabolismo, la diferenciación, la apoptosis y la angiogénesis (para revisión ver [4], [5]). Por lo tanto, MYC es un integrador de señales extracelulares e intracelulares, y su fenotipo celular depende de la ubicación del tejido [6], [7]. Como era de esperar, la desregulación de las funciones MYC contribuye al fenotipo tumoral.


MYC
desregulación debido a la amplificación de genes [8], [9], la translocación cromosómica o inserción [10], [11] , mutaciones [12], y las modificaciones epigenéticas [13], [14], se ha informado en diferentes tipos de cáncer, especialmente en el cáncer gástrico. la expresión de MYC está elevada o desregulado en los tumores humanos [4], y parece estar en el cruce de varias vías importantes y procesos implicados en la carcinogénesis [15], que es un evento clave en la carcinogénesis gástrica [9]. Anteriormente, nuestro grupo demostró que
MYC
la expresión del ARNm y de la copia número aumenta durante las etapas secuenciales de tipo intestinal carcinogénesis gástrica en un modelo de primates no humanos [16], lo que sugiere que
MYC
Mayo estar involucrado en la iniciación y progresión del tumor gástrico
.
la comprensión de
MYC
biología es de suma importancia para dilucidar su papel en la patogénesis del cáncer gástrico. Hasta la fecha, no existe ningún estudio que correlaciona
MYC
mutación, amplificación, proteína /niveles de ARNm, y la metilación de esta neoplasia. A continuación, se evaluó la relación entre el
MYC
alteraciones y características clínico en el cáncer gástrico. Además,
MYC
la expresión de ARNm y la inmunorreactividad de la proteína, así como varios mecanismos moleculares previamente relacionados con su desregulación como la variación del número de copias (CNV), mutación, y la metilación del ADN, se analizaron en el mismo conjunto de cáncer gástrico muestras.

Materiales y Métodos

Ética Declaración

Todas las muestras se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito y la aprobación de la Clínica Universitaria (Belém, Pará, Brasil) juntas de revisión ética ( número de protocolo:. 142004)

muestras clínicas

125 adenocarcinoma gástrico y 67 correspondientes tejidos gástricos no neoplásicas (muestras de control) se obtuvieron quirúrgicamente de pacientes del hospital Universitario de João de Barros Barreto en Pará Estado, Brasil. Todos los sujetos no fueron expuestos a quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Los tumores gástricos se clasifican de acuerdo con Lauren [17] y los tumores se clasifican empleando criterios estándar de estadificación TNM [18]. Las características clínico-patológicas se muestran en la tabla 1 y 2.

muestras de tumor y de control disecados se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido hasta la purificación de ácidos nucleicos. Otra parte de los mismos tejidos fue fijado en formalina y embebidos en parafina. Para el fluorescente
In situ
ensayo de hibridación (FISH), la muestra de tumor restante se desglosa como se describe anteriormente [19].

inmunorreactividad MYC

análisis de inmunohistoquímica para la proteína MYC eran realizado en 125 secciones de tumores fijados con formalina, incluidos en parafina. La tinción inmunohistoquímica se realizó de acuerdo a Calcagno
et al.
[10]. secciones de tejido tumoral (3 o 4 mm de espesor) se deparaffinized en xileno y rehidratada en una serie graduada de etanol. Después de recuperación del epítopo inducida por calor, las secciones de tejido se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón primario contra MYC (dilución 1:50; sc-40, Santa Cruz Biotechnology, EE.UU. y Zymed®, EE.UU.). Un kit de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa universal (System LSAB, DakoCytomation, EE.UU.) se utilizó para el sistema de detección. Utilizamos 3,30-diamino-bencidina /H
2O
2 (DakoCytomation, Dinamarca) como cromógeno y hematoxilina como el colorante de contraste. Cualquier mancha nuclear con o sin tinción citoplásmica se considera que es un resultado positivo, con independencia de la intensidad. Un caso MYC-positiva se define como uno que tiene 10% o más células tumorales positivas para esta proteína.

El ácido nucleico extracción

El DNA genómico (gDNA) se extrajo utilizando el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se extrajo con Tri-Reagent® (Life Technologies, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. ADN y ARN concentración y calidad se determinaron utilizando el espectrofotómetro NanoDrop (Kisker, Alemania). La integridad del ARN se determinó por electroforesis en gel (1% geles de agarosa). Todas las muestras fueron almacenadas a -80 ° C hasta su uso.


MYC
la expresión del ARNm

Para cuantificar los niveles de mRNA de
MYC
, el ARN total fue aislado de 49 tejidos normales y tumorales asociados a través de Trizol (Life Technologies, EE.UU.). El ARN se transcribe de forma inversa utilizando el kit cDNA Archivo de gran capacidad de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies, EE.UU.). El ADN complementario se amplificó por PCR en tiempo real utilizando las sondas TaqMan comprados como ensayos-on-demand Productos para la Expresión Génica (Life Technologies, EE.UU.) en un 7500 Fast PCR en tiempo real (Life Technologies, EE.UU.).
GAPDH
gen fue seleccionado como un control interno para la entrada de ARN y la transcripción reversa eficiencia. Todo en tiempo real PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) se realizaron por triplicado para ambos gen diana (
MYC
: Hs00153408_m1) y el control interno (
GAPDH
: NM_002046.3).

cuantificación relativa (RQ) de la expresión de genes se calculó según Livak y Schmittgen [20]. La muestra de control correspondiente se designó como calibrador de cada tumor.


MYC
número de copias

FISH y PCR cuantitativa se utilizaron para evaluar
MYC
número de copias en un subconjunto de 49 tumores, el mismo utilizado en el estudio de la expresión. FISH se realizó de acuerdo con el protocolo de Pinkel
et al.
[21], con modificaciones introducidas por Calcagno
et al.
[22]. Las células se hibridan con
Espectro de Orange
sonda (LSI Vysis /Abbott, Inc., IL) para el
MYC
región del gen (8q24.12-q24.13) y los núcleos se counterstained con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol antifade. La fluorescencia se detecta utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX41 (Olympus, Japón) con filtros de excitación de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (260 nm) y rodamina (570 mn). Para cada caso, a 200 núcleos en interfase se analizaron utilizando un sistema de análisis de imagen ASI (Applied Imaging espectral, Israel). Las señales positivas
MYC
genes aparecieron como manchas rojas en los núcleos y fue evaluado utilizando los criterios de Hopman
et al.
[23]. Para evitar interpretaciones erróneas debido a un error técnico, los núcleos de linfocitos normales y el tejido gástrica normal se utilizaron como control. Los resultados de FISH fueron presentados como el porcentaje de
MYC
amplificación por una célula, en el que se calculó el porcentaje de células que muestran 3 o más señales para la
MYC
sonda por la célula.

qPCR se realizó mediante ensayos TaqMan cuantitativas de la CNV (Life Technologies, EE.UU.) para el
MYC
gen (Hs01764918_cn) y para el control interno
ARNasa P gratis (# 4403326). qPCR reacciones multiplex se realizaron por cuadruplicado con ADNg acuerdo con el protocolo de ciclismo y condiciones del fabricante en 7500 Fast Real-Time PCR (Life Technologies, EE.UU.). El número de copias relativo se calculó para cada muestra usando el software de copia de llamadas V1.0 (Life Technologies, EE.UU.). gDNAs comerciales humanos (G1521 y G1471; Promega, EE.UU.) se utilizaron para la calibración


MYC
metilación

El patrón de metilación y la frecuencia de la
MYC
promotor se evaluaron en 125 tumores y 67 muestras de control emparejados por PCR-metil específica (MSP) como se describe anteriormente [24]. gDNA (2 g) de todas las muestras se modificó por tratamiento con bisulfito, la conversión de citosinas no metiladas a uracilos y dejando cytosins metilados sin cambios [25]. cebadores específicos para el
MYC
promotor fueron los siguientes: F5'-TAGAATTGGATTGGGGTAAA-3 'y R5'-CCAACCAAAAATCAACATGAAT-3' para las reacciones no metilados (tamaño del producto esperado de 291 pb); F5'-TAGAATTGGATCGGGGTAAA-3 'y R5'-CGACCGAAAATCAACGCGAAT-3' para las reacciones metilados (tamaño del producto esperado de 290 pb), como anterior descritos [26].

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con 0,1 mol /L de dNTPs, 2 mol /L de MgCl
2, 0,5 mol de cebadores, 1,25 U de Taq ADN polimerasa, y 100 ng de ADN con bisulfito modificado. Después de la desnaturalización inicial de 5 min a 94 ° C, 40 ciclos a 9 4 ° C durante 45 s, 52,4 ° C durante 45 s, y 72 ° C durante 30 s se llevaron a cabo, seguido de una extensión final de 5 min a 72 DO. Los productos de PCR se cargaron directamente sobre 3% geles de agarosa y electroforesis. El gel se tiñó con SYBR seguro gel de ADN de manchas (Vida Technolgies, EE.UU.) y directamente visualizado bajo iluminación UV. Como control positivo de todas las reacciones MSP, una muestra gDNA estaba completamente metilado usando CpG metilasa (SssI, New England Biolabs, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. . Además, se utilizaron los cebadores para la de tipo salvaje para controlar la conversión completa del ADN obtenido en la reacción de bisulfito

Las muestras fueron estratificados como: 1) hypomethylated muestras cuando el producto de amplificación positiva se detectó sólo en la PCR con cebadores específicos para las secuencias no metiladas; 2) hypermethylated muestras cuando se detectó amplificación positiva sólo en la PCR con cebadores específicos para secuencias metiladas; 3) muestras metilados parciales cuando se detectó amplificación positiva en la PCR con los dos conjuntos de cebadores.


MYC
Genotipado

Los tres exones del
MYC
fueron seleccionados para el análisis de genes mutación en todas las 125 muestras de cáncer gástrico. Los siguientes cebadores fueron diseñados para la amplificación por PCR y secuenciación: exón 1 F5'-TTTATAATGCGAGGGTCTGGA-3 'y R5'-GCATTCGACTCATCTCAGCA-3' (tamaño de producto esperado de 654 pb); exón 2 F5'-CTGCCTCCCGCTTTGTGT-3 'y R5'-TTTGATGAAGGTCTCGTCGT-3' (tamaño de producto esperado de 423 pb), F5'-TGGGAGGAGACATGGTGAA-3 'y R5'-TGCCAATGAAAATGGGAAAG-3' (tamaño de producto esperado de 507 pb); exón 3 F5'-TGTCCAGAGACCTTTCTAACGTAT-3 'y 5'-CCGTAGCTGTTCAAGTTTGTG-3' (tamaño de producto esperado de 663 pb), 5'-TGTCCGTCCAAGCAGAGG-3 'y 5'-TGATGAAAACAAACAGGGATG-3' (tamaño de producto esperado de 639 pb).

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con 0,1 mol /L de dNTPs, 2 mol /L de MgCl
2, 0,5 mol /L de cebadores, 1 U de Taq polimerasa, y 100 ng de ADN. Las condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 10 min, seguido de 35 ciclos de 1 min de desnaturalización a 95 ° C, 1 min de temperatura de hibridación (que van desde 59 hasta 61 ° C), y 1 min de extensión a 72 ° C. Los amplicones fueron separados en un gel de agarosa al 2% teñido con SYBR seguro DNA Gel de manchas (Vida Technolgies, EE.UU.) y directamente visualizado bajo iluminación UV.

amplicones se secuenciaron utilizando el método de Sanger [27]. La secuenciación directa se llevó a cabo utilizando el kit de secuenciación del ciclo de Big Dye® Terminatorv3.1 (Life Technologies, EE.UU.) y analizados en un ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies, EE.UU.) utilizando Pop 7 de polímero. La búsqueda de mutación in silico se ha realizado mediante la Chromas Pro 1.5 (Technelysium Pty Ltd, Australia). La secuencia de referencia era Gene ID: 4609 (NCBI). se informó de variantes con menos de 1% menor frecuencia alelo. Patogenicidad de mutaciones sin sentido se evaluó mediante el análisis in silico usando PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) y SIFT (http://sift.jcvi.org).

El análisis estadístico


MYC
metilación, las probabilidades de inmunorreactividad relación de mutación, o de sus productos (OR) para las características clinicophatological se estimó por regresión logística. La edad a la toma de muestras de tejido gástrico se definió como covariable en el modelo de regresión.

La normalidad de la distribución de las variables cuantitativas se analizó mediante la prueba de la de Shapiro-Wilk. Los datos que no estaban distribuidos normalmente, se transformaron (transformación z-score) en una distribución normal para su análisis. Análisis de
MYC
la expresión de ARNm y número de copia se lleva a cabo por el Modelo Lineal General (GLM) con ajuste por edad, que proporciona el tamaño del efecto y la potencia observada (OP) de cada análisis. El tamaño del efecto para GLM análisis se basó en Eta cuadrado (η
2), en la que 0,15 y por debajo se determinó como un pequeño tamaño del efecto, 0,16 a 0,40 como un tamaño del efecto medio, y por encima de 0,40 como un gran tamaño del efecto.

la correlación entre la expresión de ARNm y el número de copias se analizó mediante la prueba de Pearson, en el que se determinó un valor de su coeficiente de correlación (r) por debajo de 0,30 como una correlación débil, 0,30-0,70 como una correlación medio, y por encima de 0,70 como una fuerte correlación.

En todos los análisis, el intervalo de confianza fue del 95% y
p
los valores inferiores a 0,05 se consideraron significativos.

Resultados


se conoce MYC
amplificación estar relacionada con la expresión de alto valor proteico /ARNm en la carcinogénesis gástrica [28], sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, pocos estudios se han realizado para describir el papel de la metilación y
MYC
mutaciones en este proceso. Para alcanzar este objetivo, se analizaron 125 casos en los cuales el 68% eran varones y el 32% eran mujeres. La edad media de nuestra muestra fue de 62 años (rango de 26-89 años). Una frecuencia ligeramente mayor de tipo intestinal (56,8%) y (58,4%), los tumores no se observaron Cardic (Tabla 1 y 2).

MYC proteína nuclear fue encontrado positivo en el 76,8% (96/125) de los tumores gástricos (Figura 1). expresión de la proteína MYC se observó con mayor frecuencia en los de tipo intestinal que los tumores de tipo difuso (
p Hotel & lt; 0,001, OR = 7,856; IC del 95% = 2,803 a 22,013) (Tabla 1). MYC inmunotinción también se asoció con la aparición tardía (p = 0,026, OR = 3,276; IC del 95% = 1,152-9,315), la extensión del tumor más profunda (
p = 0,045
, OR = 2,975; IC del 95% = 1.027 -8.623), y la presencia de metástasis a distancia (
p Hotel & lt; 0,001, OR = 17,682; IC del 95% = 3,914 a 79,882) (Tabla 1). Futhermore, MYC inmunoreactividad se asoció con un aumento de la expresión del ARNm (
p = 0,003
, η
2 = 0,178, OP = 0,870) y
MYC
número de copias por FISH (
p
= 0,009, η
2 = 0,139, OP = 0,759) y por qPCR (
p = 0,003
, η
2 = 0,177, OP = 0,869) (Tabla 1).

A) cáncer gástrico de tipo intestinal sin MYC inmunoreactividad (400 ×); B) el cáncer gástrico de tipo intestinal que presenta inmunorreactividad MYC (400 ×); cáncer de C) de tipo difuso gástrico sin MYC inmunorreactividad (400 ×); cáncer gástrico D) de tipo difuso presentar MYC inmunoreactividad (400 ×).

El nivel de expresión de
MYC
mRNA fue mayor en todas las muestras tumorales que sus controles emparejados (RQ = 3,39 ± 0,14; intervalo de 1,57 a 5,18). Un aumento de la
MYC
expresión de ARNm se asoció con la extensión del tumor más profunda (
p = 0,006
, η
2 = 0,152, OP = 0,801), la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos (
p = 0,023
, η
2 = 0,107, OP = 0,632), y metástasis a distancia (
p Hotel & lt; 0,001, η
2 = 0,788, OP = 1) (Tabla 2 ). Además, el nivel de ARNm se correlaciona directamente con el
MYC
número de copias (
p Hotel & lt; 0,01; r = 0,716).

Ganancia de
MYC
las copias se encuentran en todas las muestras de adenocarcinoma gástrico por ensayos FISH y qPCR. Por FISH, el porcentaje medio de células presentadoras de
MYC
amplificación fue 72,1% (rango de 50 a 83.5% de células con amplificación) (Figura 2 A y B). La media de
MYC
copias por qPCR fue de 4,5 (intervalo de 3 a 9 copias) (Figura 2 C).

A) que presentan núcleos en interfase
MYC
amplificación (rojo) en el cáncer gástrico de tipo intestinal; B) que presentan núcleos en interfase
MYC
amplificación (rojo) en el cáncer gástrico de tipo difuso; C)
MYC
distibución número de qPCR en el tipo intestinal y difuso tipo de tumores.

FISH y análisis de PCR cuantitativa mostró que el aumento de
MYC
número de copias era asociado con la aparición tardía (
p Hotel & lt; 0,001; η
2 = 0,257, OP = 0,976;
p = 0,025
; η
2 = 0,103, OP = 0,662 , respectivamente), el cáncer de tipo intestinal (
p = 0,037
; η
2 = 0,091, OP = 0,557;
p = 0,009
; η
2 = 0,139, OP = 0,762, respectivamente), y la presencia de metástasis a distancia (
p = 0,001
; η
2 = 0,221, OP = 0,942;
p Hotel & lt; 0,001; η
2 = 0,356, OP = 0,999, respectivamente). Además,
MYC
amplificación por FISH se asoció con etapas avanzadas del tumor (
p = 0,037
; η
2 = 0,091, OP = 0,558), sin embargo, sólo dos tumores tempranos eran analizado en este subconjunto de muestras (Tabla 2).

Todas las muestras de cáncer gástrico presentan amplificación positiva con un conjunto de cebadores no metilado. Curiosamente, el 86,4% de las muestras de cáncer se hypomethylated. Por otra parte, la presencia de secuencias no metiladas en el
se observó MYC
promotor en 28,4% de las muestras de control (muestras metiladas parciales), lo que sugiere la pérdida de metilación en estas muestras (Figura 3). especificidad y MSP resultados de los cebadores fueron confirmados por PCR utilizando el método de secuenciación de bisulfito (BSP) [29] en el que se seleccionaron al azar cinco muestras hypomethylated; cinco muestras hypermethylated y cinco muestras metiladas parciales (datos no mostrados).
MYC
hipometilación se observó con mayor frecuencia en los de tipo difuso, en comparación con el cáncer gástrico de tipo intestinal (
p = 0,007
; OR = 8,554; IC del 95% = 01,798 a 40,695, utilizando de tipo difuso como grupo de referencia). Además,
MYC
hipometilación se asoció con etapas avanzadas del tumor (
p = 0,033
; OR = 6,602; IC del 95% = 1,162 a 37,501), la extensión del tumor más profunda (
p
= 0,022, OR = 4,752; IC del 95% = 1,257 a 17,965), y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos (
p = 0,032
; OR = 5,12; IC del 95% = 1,149 a 22,814) (Tabla 1).

Ejemplo 1 presentó metilación parcial. Las muestras 2, 3 y 4 presentan un promotor hypomethylated. C: blanco; C +: control positivo, la muestra ADNg completamente metilado; U: no metilado; M: metilado: MW: marcador de peso molecular; pb:. pares de bases

En cuanto a la secuenciación de genes, no se detectó ninguna nueva mutación en los tumores gástricos. Trece muestras (10,4%) de tumores presentan al menos una mutación conocida, con variantes en menos de 1% alelo menor frecuencia. En total, se identificaron 18 mutaciones, con 4 muestras que presentan mutaciones concurrentes. En el exón 1, con cinco y cuatro GG con CG en rs117856857; uno con GG en rs73707292; y cuatro con CT en rs4645949. En el exón 2, en relación con mutaciones de sentido erróneo, dos tumores albergaban una mutación en el codón 47 que resulta en un cambio de tirosina a histidina (rs114570780; SIFT predicción = perjudicial; predicción PolyPhen = probablemente perjudicial), y dos en el codón 72 que resulta en un cambio de prolina a serina (rs28933407; SIFT predicción = tolerado; predicción PolyPhen = probablemente dañinos). Todo tumor con una mutación en el exón 2 presenta uno o dos mutación conocida en el exón 1. El exón 2 mutaciones solamente se detectaron en tumores de tipo difuso en etapa avanzada. No se identificó la mutación en el exón 3. La presencia de conocidos
MYC
mutaciones se asoció con tumores de tipo difuso (
p = 0,004
, OR = 21,717; IC del 95% = 2,678 a 176,111; utilizando difusa de tipo como grupo de referencia) y la presencia de metástasis a distancia (
p = 0,032
, OR = 4,492; IC del 95% = 1,141 a 17,679).

Discusión

la proteína MYC tiene un efecto en aproximadamente 15% de los genes en el genoma humano [30]. Por lo tanto, MYC desregulación puede resultar en alteraciones en diferentes vías biológicas que participan en la iniciación y progresión del cáncer [5]. Sin embargo, hasta la fecha, la relación entre el
MYC
alteraciones y parámetros clínico no ha sido bien entendido. Nuestras muestras presentan una relación macho-hembra de 02:01 y la mayoría de los pacientes eran mayores de cincuenta y cinco años. Por otra parte, el cáncer gástrico de tipo intestinal es más frecuente que la de tipo difuso y los tumores fueron más frecuentes en no cardias. Estos datos epidemiológicos están de acuerdo con estudios anteriores [28], [31] - [33].

translocaciones cromosómicas en el
MYC
locus es muy comun en los cánceres hematopoyéticos. Sin embargo, en los tumores humanos sólidos, como el cáncer gástrico,
MYC
alteraciones son comúnmente debido a la amplificación del gen [34]. Por otra parte,
MYC
se reconoce que es el gen codificante de la proteína más frecuentemente amplificada en todos los tipos de cáncer [35]. En el presente estudio, se observó tres o más
MYC
copias del gen en todos los tumores gástricos estudiados, corroborando con estudios previos en tumores gástricos primarios de los individuos de la población [10], [28], [36] - [39], así como de Asia del Este y Europa [40] - [42]. También,
MYC
amplificación se observó en plasma [43] y en líneas celulares de cáncer gástrico establecidos en nuestro grupo [44] - [47]. Además, nuestro grupo había observado que la alta amplificación clonal de
MYC
es menos frecuente en los de tipo difuso que en de tipo intestinal cáncer gástrico primario [10], [22], [28], y esto fue reforzado por este estudio.

sobreexpresión MYC se describe como que van desde 15,6% a 100% en los cánceres gástricos primarios [9].
in vitro
estudios con derribado MYC expresión en líneas celulares de cáncer gástrico demostraron el papel crucial de la expresión de MYC en el crecimiento del tumor gástrico celular, la supervivencia y el mantenimiento de los parámetros de las células del tumor que puede contribuir al potencial maligno [48 ]. Por otra parte, Mehndiratta
et al.
, [49] mostró una disminución significativa (40%) en la expresión de MYC tanto de ARNm y proteínas y de los objetivos utilizando siRNA.

En el presente estudio, 76,8% de los tumores gástricos mostró inmunorreactividad MYC y todos los tumores, tipo intestinal y difuso, presentó aumento de la expresión de ARNm en comparación con sus controles emparejados. Además, se observó que la inmunorreactividad de MYC y el aumento de la expresión de ARNm se asociaron con la extensión del tumor más profundo y la presencia de metástasis. Estos hallazgos sugieren que MYC tiene un papel en la invasividad del tumor, metástasis, agresividad y, por tanto, corroborando un estudio anterior [37]. Aunque algunos análisis presentaron un efecto pequeño tamaño, estos resultados también están de acuerdo con un estudio previo de nuestro grupo en primates no humanos, en el que hemos demostrado un aumento continuo de
MYC
la expresión del ARNm y el número de copias durante el etapas secuenciales de tipo intestinal carcinogénesis gástrica en N-metil-nitrosourea (MNU) tratados con primates no humanos [16]. Por otra parte, no se detectó ninguna asociación entre MYC y el grado histológico, localización del tumor, metástasis de ganglios linfáticos, o estadio patológico en un estudio de cáncer gástrico desarrollado en una población china [50], lo que refuerza que la etnicidad de la población afectada puede dar lugar a biológica y clínicamente subconjuntos de cáncer gástrico [51].

a pesar de que, la amplificación del gen no está necesariamente asociada o requerido para su sobreexpresión, nuestro estudio muestra que la inmunorreactividad MYC,
MYC
niveles de ARNm, y el número de copias se correlaciona directamente.

metilación del ADN es un potente mecanismo de la represión transcripcional. metilación genómica patrones adecuados se vuelven profundamente alterados en las células de cáncer: se han observado tanto las ganancias (hipermetilación) y pérdidas (hipometiladores) de sitios metilados [52], [53]. La hipometilación en promotores específicos puede activar la expresión aberrante de oncogenes y la pérdida de impresión en algunos loci [44]. Hasta ahora, pocos estudios examinaron la relación entre el patrón de metilación de
MYC
y su efecto sobre la expresión de genes y en procesos cancerígenos.
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hipometilación se asoció previamente con la progresión oncogénica y la inducción de metástasis en un modelo de rata de cáncer de hígado [54] y en muestras de cáncer colorrectal humano [55]. Además,
MYC
hipometilación también se asoció con
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de expresión en los tumores gástricos [26], [56] - [58 líneas] y de células [48]. Sin embargo, no hemos podido observar una asociación significativa entre el
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hipometilación y su expresión en nuestras muestras. Entre otros factores, esta falta de asociación puede ser debido a la presencia de
MYC
amplificación en todos los tumores con promotores hypomethylated (86,4% de las muestras) y, por tanto, enmascarando el posible efecto de esta modificación epigenética en
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regulación transcripcional.

Suzuki
et al.
[59] previamente mostraron que un alto nivel de hipometilación era un indicador de mal pronóstico tanto en el cáncer gástrico y de colon, y las alteraciones epigenéticas eran dependientes de la edad, ocurriendo antes de alteraciones genéticas. En el presente estudio, algunos controles ya presentan secuencias no metiladas en el
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promotor. Además, hemos demostrado que
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hipometilación se asoció con un fenotipo más agresivo (la agresividad del tumor, presencia de metástasis de ganglios linfáticos, y los tipos histológicos de cáncer). Estos hallazgos sugieren que
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desmetilación puede ser acumulado durante la progresión tumoral y esto podría ser un evento común en carinogenesis gástrico [60], [61], puesto que este mecanismo se ha observado para otros genes en varios tipos de tumores [ ,,,0],62], [63]. Como ya se ha propuesto para la hipermetilación del ADN [64], la hipometilación promotor puede ser utilizado como una nueva generación de marcadores biológicos y mantiene la promesa de diagnóstico y pronóstico para los médicos.

A lo mejor de nuestro conocimiento,
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exones del gen nunca han sido completamente secuenciados en los tumores gástricos humanos. A continuación, la secuencia de los tres exones de
MYC
: exón 1 es una proteína no codificante, los exones 2 y 3 son de codificación de proteína [de revisión ver (Pelengaris & amp; Khan, 2003)]. No se encontró ninguna nueva mutación, sin embargo, se observó que 4 tumores presentan mutaciones sin sentido (rs114570780 y rs28933407) en el exón 2. Estas mutaciones se encontraban en una secuencia conservada evolutivo de
MYC
: el dominio de transactivación [4] , [sesenta y cinco]. Además, ambas mutaciones identificadas fueron considerados como probablemente dañar de acuerdo con el software PolyPhen. El cambio de prolina a serina en el codón 72 también se había informado anteriormente como una variante patógena en la base de datos NCBI dbSNP (http://omim.org/). Por lo tanto, ambas mutaciones en el exón 2 podrían afectar la actividad MYC en los tumores gástricos. Además, la presencia de
MYC
mutaciones se asoció con metástasis a distancia. Sin embargo, son necesarias nuevas investigaciones para aclarar si
MYC
mutaciones tienen un papel en el proceso metastásico.

De acuerdo con clasificación de Lauren, adenocarcinoma gástrico se clasifica principalmente en tipos intestinales y difusos [17]. cáncer gástrico de tipo intestinal progresa a través de una serie de pasos secuenciales, comenzando con gastritis atrófica seguido de metaplasia intestinal, neoplasia intraepitelial, carcinoma y [66]. Por otro lado, el tipo difuso generalmente no evoluciona a partir de lesiones precancerosas [67], [68]. En el presente estudio, se observó que el tipo intestinal presentó inmunorreactividad MYC más frecuentes, así como un mayor número de
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copias que los tumores de tipo difuso, lo que corrobora con estudios previos de nuestro grupo [10] , [22], [28], [38]. Además,
MYC
mutaciones puntuales hipometiladores y se observaron con mayor frecuencia en el tipo difuso en comparación con los tumores de tipo intestinal.

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