Extracto
La desregulación de la familia miR-29 y 3A ADN metiltransferasa (DNMT3A) se asocia con el cáncer gástrico (GC). Al tiempo que aumenta la evidencia indica miR-29b /c podría regular la metilación del ADN por la orientación DNMT3A, actualmente se desconoce si el silenciamiento epigenético de miR-29b /c mediante la hipermetilación del promotor en GC es causada por la expresión anormal de DNMT3A. Por lo tanto, el objetivo fue evaluar si existe una reglamentación diafonía entre miR-29b /cy DNMT3A y si se asocia con un fenotipo maligno en GC. En primer lugar, la cicatrización de heridas y ensayos Transwell revelaron que el miR-29b /c suprime la metástasis tumoral en GC. Un ensayo indicador de luciferasa demostró que DNMT3A es un objetivo directo de miR-29b /c. Se utilizó la secuenciación genómica de bisulfito para analizar el estado de metilación del ADN de miR-29b /c. El porcentaje de CpG metilados se redujo significativamente en las células DNMT3A-agotado en comparación con los controles. Además, la participación de DNMT3A en la migración celular GC promoción se asoció con la represión mediada por la metilación del promotor de CDH1. En 50 muestras de tejido GC clínicos emparejados, disminución de miR-29b /c se correlacionó significativamente con el grado de diferenciación y la invasión de las células y se correlacionó negativamente con la expresión DNMT3A. En conjunto, nuestros resultados preliminares sugieren que el siguiente proceso puede estar implicada en la tumorigénesis GC. miR-29b /c suprime la DNMT3A gen aguas abajo, ya su vez, el miR-29b /c es suprimida por DNMT3A de una manera dependiente de la metilación del ADN. La desregulación de los dos miR-29b /cy DNMT3A conduce al silenciamiento epigenético de CDH1 y contribuye al fenotipo metástasis en GC. Este hallazgo revela que el ADN silenciamiento metilación asociada de miR-29b /c es crítico para el desarrollo GC y por tanto, puede ser una diana terapéutica
Visto:. Cui H, Wang L, Gong P, Zhao C, Zhang S , Zhang K, et al. (2015) La desregulación entre miR-29b /cy DNMT3A se asocia con epigenética El silenciamiento del gen CDH1, inciden en la migración celular y la invasión en el cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10.1371 /journal.pone.0123926
Editor Académico: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos |
Recibido: Septiembre 4, 2014; Aceptado: 9 Marzo 2015; Publicado: 15 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Cui et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81171915, Nº 91229107 y Nº 81472548), http: //www .nsfc.gov.cn /. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el segundo cáncer más mortal en todo el mundo. Da cuenta de un total de aproximadamente 1 millón de casos nuevos y 0,7 millones de muertes al año, más del 70% de los cuales se producen en países en desarrollo, particularmente en los países de Asia oriental [1]. Aunque curable si se detecta a tiempo, la mayoría de los pacientes con cáncer gástrico son diagnosticados con la enfermedad en etapa tardía. Para los pacientes con enfermedad operable, quimioterapias convencionales de cirugía y de la combinación se indican. Sin embargo, la tasa de supervivencia global a 5 años de los pacientes con GC es inferior al 30% [1, 2]. En particular, GC suele ir acompañada de diseminación peritoneal y metástasis a los ganglios linfáticos regionales y órganos distantes a través de los vasos linfáticos y venosos [3]. Por lo tanto, la identificación de aberraciones moleculares de GC puede mejorar nuestra comprensión de la carcinogénesis gástrica y ayudarnos a subdividir los pacientes en subgrupos relevantes biológica y clínicamente, así como desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.
Los microARN (miRNA) son una clase de endógeno, pequeña, no codificante ARN reguladoras de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos que regulan negativamente la expresión de genes mediante la inhibición de la traducción o la inducción de la degradación del ARNm a través de apareamiento de bases con la región no traducida 3 '(3'UTR) del ARN mensajero objetivo (mRNAs) [4]. La alteración de los niveles de expresión de miRNAs se han reportado en muchos tipos de cáncer y como resultado la expresión aberrante de genes diana que influyen en el comportamiento maligno, tales como la proliferación, la resistencia a la apoptosis y la metástasis [5-7]. aumento de la evidencia muestra que los miRNAs desregulados (por ejemplo, el miR-17, miR-129, miR-148a, y miR-378) contribuyen a la carcinogénesis gástrica [8-10], que indican que los miRNAs podrían ser utilizados como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico en GC .
La familia de miR-29 (miR-29) es una familia conservada de miRNAs que incluye el miR-29a /b /c. Disminución de la expresión de miR-29 se ha descrito en múltiples tipos de cáncer, incluyendo GC [11-14]. Estudios previos demuestran que el miR-29 desempeñan un papel dominante en la proliferación celular GC, la progresión del ciclo celular, la apoptosis y la motilidad celular [14, 15]. Los objetivos potenciales de miR-29 que contribuyen al fenotipo maligno GC incluyen Cdc42, CCND2, y la MMP-2 [14, 15]. Además, algunos estudios han identificado miR-29 como contribuyentes en la regulación de la metilación del ADN por la orientación DNMT3s en el cáncer de pulmón [13]. Además, también se ha informado de varios genes diana, tales como TCL-1, CDK6, laminina-1, y MCL-1, en otro tipo de cáncer [16]. Cabe destacar que, a pesar de la evidencia que demuestra miARN-29 puede funcionar como genes supresores de tumores, una cuestión clave en relación con la expresión de los genes miARN-29 aún permanecen sin resolver parcialmente. ¿Cuáles son los mecanismos de control de la expresión de los genes miARN-29 en las células de GC? Se ha informado de que c-Myc está implicado en miR-29a /b represión [17]. La identificación de mecanismos de supresión adicionales es de interés.
Se sabe que el silenciamiento transcripcional de genes supresores de tumores (ETG) por la isla CpG hipermetilación es una característica común de la carcinogénesis. Curiosamente, similar a ETG codificantes de proteínas, un número sustancial de miRNAs están regulados por la metilación del promotor [18-20]. De hecho, ha habido un creciente número de estudios que muestran que los miRNAs supresores de tumores, como miR-34b, miR-129 y miR-124, son frecuentemente silenciados por la metilación del ADN en GC [21-23]. Con base en el análisis de programas CpG Island Buscador, nuestra predicción demostró que los genes miARN-29b /c contiene islas CpG en sus regiones promotoras putativas. Sin embargo, todavía no está claro si las cuentas de la hipermetilación aberrante del ADN para la desregulación de miR-29b /c. Además, se desconoce si existe una regulación por retroalimentación entre miR-29b /cy DNMT3s. De hecho, ningún estudio previo ha examinado el estado de metilación de miR-29b /c en las células de GC, y ninguno ha explorado la relación entre la metilación de miR-29b /c y los niveles de expresión de DNMT3s. En este estudio, encontramos que el miR-29b /c suprimió la expresión de DNMT3A apuntando a su 3'UTR, lo que contribuyó a la inhibición de la migración celular y la invasión GC. Por otro lado, DNMT3A el regulado miR-29b /c a través de la hipermetilación aberrante del promotor. Por lo tanto, existe un bucle de retroalimentación entre el potencial de miR-29b /cy DNMT3A, en el que la baja regulación de miR-29b /c suprime la supresión de DNMT3A. Mientras tanto, la sobre regulación de DNMT3A afecta a la expresión de miR-29b /c por la metilación del promotor. Estos hallazgos sugieren una estrecha relación entre el miR-29b /cy DNMT3A. Su desequilibrio y la desregulación es la causa por un mecanismo epigenético que puede estar involucrado en las características de la migración y la invasión de células GC.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
GC líneas celulares, incluyendo AGS y BGC-823, se obtuvieron del Banco de células de la Academia china de Ciencias y mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) en un incubador humidificado con un 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C.
Las muestras de tejido
50 pares de tejidos de Ginebra y sus adyacentes muestras de tejidos no cancerosos fueron recogidos entre 2011 y 2013 en el hospital de Nanjing Jiangning. La información clínica de los pacientes con GC se muestra en la Tabla S1. El estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Ética de la Investigación en el Hospital de Nanjing Jiangning en China, y los pacientes firmaron el consentimiento informado. Todas las muestras de tejido se obtuvieron a partir de pacientes con GC. Ellos se recogieron durante la cirugía e inmediatamente se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido hasta el ARN y la proteína de extracción.
Invertir reacción de transcripción y cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR)
El ARN total se extrajo de las células y tejidos recogieron usando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante.
para detectar la expresión de los genes miARN, un tallo-bucle RT-PCR se realizó como se describe anteriormente [24], y U6 pequeños ARN se utilizado como un control interno. qPCR se realizó utilizando SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, Dalian, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La expresión relativa se evaluó por el método CT comparativa. El primer secuencias de cada gen se muestran en la Tabla S2.
Western blot
Se realizaron transferencias Western utilizando anticuerpos anti-DNMT3A (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-vimentina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) y anti-
β-actina
anticuerpos (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA), y la detección se realizó con sustrato de quimioluminiscencia super señal (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
la transfección
miR-29b /imita c /inhibidores y moléculas de control negativo (control de mezcla aleatoria mímica y el inhibidor) fueron sintetizados y purificados por la Compañía GenePharma (Shanghai, China). Las secuencias se muestran en la Tabla S2. Ellos se transfectaron en las células a una concentración final de 50 nM usando Lipofectamine-2000 reactivo de transfección (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El medio se cambió después de 6 horas. Las células se cultivaron durante 48 horas y se recogieron para su análisis. El porcentaje de eficacia de transfección se determinó mediante una evaluación de los niveles de expresión de miR-29b /c o una caída después de transfecciones (S1A y S1B FIG). El protocolo para el establecimiento de la DNMT3A desmontables células estables se ha descrito en nuestro trabajo previo [25]. La expresión de DNMT3A disminuyó dramáticamente en las células BGC-shDNTM3A y AGS-shDNTM3A (Fig S1C) en comparación con las células control.
Ensayos
cicatrización de heridas, migración e invasión
la movilidad de las células se someten a la curación de la herida análisis de ensayo como se describió anteriormente [26]. Una herida cero se generó usando una punta de pipeta de 200 l en las monocapas de células confluentes en placas de seis pocillos. Después, las células se lavaron con medio fresco para eliminar las células flotantes, y se observó la propagación de la cierre de la herida después de 48 horas y se fotografiaron con un microscopio. El potencial de la migración y la invasión de las células transfectadas se evaluaron mediante un ensayo Transwell. Las células fueron cultivadas a 70% de confluencia y se transfectaron durante 24 horas con los imitadores /c miR-29b o imita de control, y miR-29b /inhibidor de c o control inhibidor. En el ensayo de migración, las células se cultivaron en 200 ml de medio con suero bovino fetal al 1% en la cámara superior de un inserto no recubierto transwell. En la cámara inferior, se usó 600 ml de medio con suero bovino fetal al 10% como un quimioatrayente para estimular la migración celular. En el ensayo de invasión, la cámara superior de los insertos transwell se recubrieron con 50 ml de 1,0 mg /ml de Matrigel, y las células se sembraron en la cámara superior del inserto Transwell recubierto con Matrigel (Millipore, EE.UU.). Después de 24 horas de incubación, las células no invasor no migra o se retiraron suavemente con un bastoncillo de algodón. Todas las células se tiñeron utilizando 0,1% de tinción de cristal violeta y se contó en 5 campos bajo un microscopio invertido. Los experimentos independientes se repitieron tres veces.
secuenciación genómica de bisulfito (BGS)
ADN genómico fue extraído de las células utilizando el método de fenol-cloroformo. tratamiento con bisulfito se realizó por el CpGenome universal DNA Modificación Kit (Millipore, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. productos de la PCR para la secuenciación de bisulfito se purificaron en gel y se subclonó en un sistema de vector pMD19-T (Takara, Dalian, China). Al menos diez colonias se secuenciaron para evaluar el grado de metilación en cada sitio CpG. Los primers se enumeran en la Tabla S2.
reportero de luciferasa ensayo
El protocolo para el ensayo indicador de luciferasa se ha descrito anteriormente [14]. El 3'UTR de DNMT3A humana se amplificó por PCR y se clonó en los sitios no entre I y Xba I PGL-3 (Promega, EE.UU.). Las células BGC-823 se sembraron a una densidad de 5 × 10
5 por pocillo en una placa de 12 pocillos antes de las transfecciones. Las células fueron transfectadas con pGL-3 reporteros luciferasa de luciérnaga (1 g por pocillo), pRL-TK (50 ng por pocillo) y miR-29 imita /inhibidor (50 nM) o imita de control /inhibidores negativos (50 nM) utilizando Lipofectamine- 2000 reactivo de transfección (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La actividad de luciferasa se ensayó 48 horas después de la transfección usando la actividad de sistema de ensayo Dual-Luciferase (Promega, EE.UU.). Todos los experimentos se realizaron como tres repeticiones independientes.
El análisis estadístico
El Student independiente
t-test
se utilizó para comparar los resultados, que se expresan como media ± Dakota del Sur entre dos grupos preseleccionados. Para determinar las correlaciones entre las variables,
Pearson
's coeficiente de correlación se calculó. Un
P
-valor inferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
miR-29b /c es necesaria y suficiente para la migración celular GC
estudios anteriores implican que el miR-29b /c es crítico para la invasión de células GC. A fin de evaluar si el miR-29b /c es responsable de la migración de células GC, un
in vitro se realizaron
cero herida ensayo de curación y el ensayo Transwell. Después de transfección transitoria de los miR-29b imita /c o control negativo en las células BGC-823, la herida ensayo de curación mostró que las células con la expresión forzada de miR-29b /c muestran una recuperación notablemente más lento en comparación con las células de control (Fig 1A). Del mismo modo, el ensayo de migración Transwell mostró que la sobreexpresión de miR-29b /c se asoció significativamente con menos migración que los controles (
P
& lt; 0,05, Fig 1B). Por otra parte, de acuerdo con otros datos en MGC-803 células GC HGC-207 y [14], las células miR-29b /c sobreexpresión también reveló una reducción significativa en la capacidad invasiva en el ensayo de invasión de Matrigel (
P & lt
; 0,05, Fig 1C). Estos resultados sugieren que miR-29b /c no sólo es importante para la invasión de células GC, sino también para la migración celular. Para confirmar aún más los efectos supresores de miR-29b /c en la migración celular y la invasión GC, las células BGC-823 se transfectaron transitoriamente con los inhibidores de miR-29b /c o un control negativo. La supresión de miR-29b /C aumentó significativamente las capacidades migratorias e invasivas de las células de GC, que fue evaluado por la curación de heridas (Figura 1D) y un ensayo Transwell (
P Hotel & lt; 0,05, Figura 1E y la figura 1F). En conjunto, estos resultados indican que miR-29b /c suprimió eficazmente la migración celular y la invasión GC, que por lo tanto, ha contribuido a las primeras etapas de la progresión maligna de GC.
(A) de la herida ensayos de las capas confluentes de curación imita control negativo o miR-29b /c imita-transfectaron células BGC-823. Las imágenes fueron adquiridas a las 0 y 48 horas después de la herida. (B y C) Imágenes representativas (superior) y gráficos de barras (abajo) que representan la migración (B) y la capacidad de invasión (C) de las células BGC-823 después de la transfección de 48 horas de imitadores de control negativo o imita el miR-29b /c (*
P Hotel & lt; 0,05). (D) Herida ensayos sobre las capas confluentes de inhibidores de control negativo o miR-29b /c curación de los inhibidores de las células transfectadas con BGC-823. Las imágenes fueron adquiridas a las 0 y 48 horas después de la herida. (E y F) Imágenes representativas (superior) y gráficos de barras (abajo) que representan la migración (E) y la capacidad de invasión (F) de las células BGC-823 después de la transfección de 48 horas de los inhibidores de control negativo o inhibidores de miR-29b /c (*
P Hotel & lt; 0,05). Número de células que migraron o invadieron se contó en cinco campos. La tasa de migración y la invasión se representan como el número de células por campo.
DNMT3A es un objetivo directo transcripcional de miR-29b /c en GC
Para comprender el mecanismo subyacente a los efectos de miR-29b /c en la migración celular y la invasión, que investigó los objetivos de miR-29b /c. DNMT3A 3'UTR es complementario a miR-29b /cy es un gen diana directa de miR-29b /c, por tanto, se realizó un ensayo de informador en células BGC-823. El DNMT3A mRNA 3'UTR se insertó en la región aguas abajo de un gen informador de la luciferasa a partir del vector pGL-3 (es decir, DNMT3A 3'UTR-Luc). Las construcciones fueron entonces cotransfectaron con los imitadores de control negativo en las células BGC-823 PRL-TK y los imitadores de miR-29b /c o. Como se muestra en la figura 2A, la actividad de luciferasa relativa se redujo significativamente en los pGL-3 vectores con la DNMT3A 3'UTR (
P
& lt; 0,05). Sin embargo, las construcciones de cotransfectadas con el inhibidor de miR-29b /c no afectaron a la actividad de luciferasa de los pGL-3 vectores con la DNMT3A 3'UTR en comparación con las construcciones cotransfectadas con el inhibidor de control negativo (Fig 2B). A fin de validar esta interacción miARN-objetivo, RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) y transferencias Western se llevaron a cabo para confirmar la regulación de DNMT3A por miR-29b /c. Estamos transfectadas transitoriamente los miR-29b /c imita o imita control negativo en las células BGC-823. El aumento de miR-29b /c redujo la expresión DNMT3A en el ARNm (figura 2C) y los niveles de proteína (Figura 2E, lane1-3). Por el contrario, el miR-29b /c regulación a la baja de su inhibidor aumentó la expresión DNMT3A en el ARNm (figura 2D) y los niveles de proteína (Figura 2E, lane4-6). En conjunto, estos hallazgos indican que DNMT3A es un objetivo directo transcripcional de miR-29b /c y se asocia negativamente con la expresión de miR-29b /c en las células de GC.
(A y B) Efectos de miR-29b /c en la actividad transcripcional de DNMT3A detectado por el ensayo de luciferasa. El 3'UTR de DNMT3A se clonó en el vector indicador de luciferasa pGL3-basic (DNMT3A 3'UTR-Luc), que fue co-transfectadas con imita miR-29b /c o imita de control negativo (A), o miR-29b /c inhibidores o inhibidores de control negativo (B) en células BGC-823 y se ensayaron para actividad de luciferasa. Los valores de luciferasa de luciérnaga se normalizaron a la actividad de luciferasa de Renilla derivado de PRL-TK y se representan en la actividad de luciferasa relativa (*
P Hotel & lt; 0,05). Los resultados se expresan como la media ± S.D.. de al menos tres experimentos independientes. (C y D) análisis de QRT-PCR de la expresión relativa DNMT3A en células BGC-823 transfectadas con imita miR-29b /c (C) /inhibidores de la (D) o el oligonucleótido de control negativo (*
P Hotel & lt; 0,05). (E) Análisis de transferencia Western de la expresión en las células DNMT3A BGC-823 transfectadas con imita miR-29b /c (carril 1, 2, 3) /inhibidores (carril 4, 5, 6) o negativo de control de oligonucleótidos.
β-actina
se utilizó como control de carga. Las intensidades de las bandas se cuantificaron y normalizado a
β-actina
intensidades con el software ImageJ.
miR-29b /c es suprimida por DNMT3A en un ADN dependiente de la metilación de manera
Dado que la hipermetilación aberrante es crítico para miARN baja regulación, se especula que existe retroalimentación negativa entre el miR-29b /cy DNMT3A. Para probar esta hipótesis, la presencia de la isla CpG metilación de la región promotora de miR-29b /c se evaluó mediante un análisis de BGS en las células DNMT3A-desmontables. Como se muestra en la figura 3A, 7 sitios CpG individuales dentro de las regiones isla CpG (5 kb aguas arriba de miR-29b /c) fueron secuenciados para identificar los residuos de citosina metilados. La frecuencia de miR-29b /c metilación del promotor en las células desmontables-DNMT3A era 34,2%, lo que fue significativamente menor que las células de control (58,6%; Figura 3B). Este resultado indica que el silenciamiento transcripcional de miR-29b /c en las células de GC se asocia con la presencia de la isla CpG hipermetilación, que fue confirmado por la medición madura miR-29b /c de QRT-PCR. Hubo un aumento significativamente la expresión de miR-29b /c en las células AGS-shDNMT3A y BGC-shDNMT3A en comparación con sus controles (Figura 3C). Estos resultados indican una base molecular importante para miR29-b /c baja regulación y apoyar la hipótesis de que existe diafonía entre miR-29b /cy DNMT3A.
Mapeo
(A y B) de la metilación estado de los sitios CpG individuales en el promotor de miR-29b /c mediante el ensayo de BGS en células BGC-shDNTM3A BGC-control y. Se analizaron las regiones que abarca la isla CpG con 7 sitios CpG. Los círculos negros representan el sitio CpG metilado; círculos blancos representan el sitio CpG no metilado. Cada fila representa la secuenciación de bisulfito de promotor de miR-29b /c para un solo clon aleatoria analizada. (C) QRT-PCR análisis de miR-29b /c expresión en ambos AGS-823 y BGC células DNMT3A-caída.
DNMT3A promueve la migración celular GC
La conexión molecular entre miR-29b /cy DNMT3A plantearon la cuestión de la participación en la migración celular DNMT3A GC. Además, se aplica
in vitro
ensayos para determinar los cambios funcionales en el comportamiento celular siguientes alteraciones en la expresión de DNMT3A. El ensayo de curación de heridas demostró una recuperación notablemente más lento en las células BGC-shDNMT3A en comparación con las células de control (Fig 4A, arriba), pero sólo una modesta recuperación en las células AGS-shDNMT3A en comparación con las células de control (Fig 4A, parte inferior). Estos resultados indican que DNMT3A es importante para la movilidad celular. Dado que las moléculas de adhesión celular son importantes para la motilidad celular, la expresión de CDH1 y vimentina fueron examinados por qRT-PCR y Western blot. Desmontables expresión DNMT3A aumentado significativamente la expresión de CDH1, tanto a nivel de ARNm y proteínas, pero no tuvo un efecto notable sobre la expresión de vimentina (Figura 4B y 4C), lo que sugiere que CDH1 puede ser un objetivo de la desregulación mediada por DNMT3A de la célula motilidad. Además, se realizó un ensayo de BGS en el gen CDH1 en las células DNMT3A-desmontables. Como se muestra en la figura 4D, el porcentaje de CpG metilados situadas dentro de CDH1 fue menor en las células DNMT3A empobrecido que en las células de control (35,8% vs. 94,1%). Estos resultados indican que la expresión anormal de DNMT3A conduce a un silenciamiento epigenético de CDH1.
tasas de (A) migratioin celulares de DNTM3A desmontables BGC o células AGS se compararon con el control a través de ensayos de curación de heridas. La observación microscópica se registró a las 0 y 48 horas después de rayar la superficie de una capa confluente de células. (B y C) QRT-PCR (B) y Western Blot (C) Análisis de CDH1 o expresión de vimentina en células BGC-823-desmontables DNMT3A.
β-actina
se utilizó como control de carga. (D) La asociación del estado de metilación de sitios CpG en el promotor CDH1 mediante ensayo BGS (izquierda) y los gráficos de barras que representan las tasas de metilación del promotor CDH1 en células BGC-shDNTM3A (derecha) BGC-control y. Se analizaron las regiones que abarca la isla CpG con 17 sitios CpG. Los círculos negros representan los sitios CpG metilados; los círculos blancos representan los sitios CpG no metilados. Cada fila representa la secuenciación de bisulfito de CDH1 promotor de un único clon aleatoria analizada. (E y F) QRT-PCR (E) y Western Blot (F) el análisis de CDH1 o vimentina expresion en las células BGC-823 después imita el miR-29b /c o negativo imita control de 48 horas de la transfección (**
P
& lt; 0,01).
β-actina
se utilizó como control de carga. gráficos (G) de barras que representa las tasas de metilación del promotor CDH1 en las células BGC-823 después imita el miR-29b /c o imita control negativo de 48 horas de la transfección. Se analizaron las regiones que abarca la isla CpG con 17 sitios CpG.
miR-29b /c está implicado en la supresión de CDH1
A fin de investigar el efecto de la alteración de miR-29b expresión /c en CDH1, que transfectadas transitoriamente los miR-29b /c imita o control negativo imitan a las células BGC-823. En comparación con los controles, la expresión forzada de miR-29b /C aumentó significativamente la expresión de CDH1 tanto en el mRNA y los niveles de proteína (Figura 4E y 4F). Posteriormente, el estado de metilación de la región promotora de CDH1 fue examinada usando un ensayo de BGS en los miR-29b imita c /o control negativo imitan transfectaron transitoriamente células BGC-823. Los resultados mostraron que la frecuencia de CDH1 metilación del promotor en las células de sobreexpresión /c miR-29b fue 5,2% o 12,9%, lo que fue significativamente menor que el nivel medido en las células de control (88,2%; Fig 4G). Estos datos fueron consistentes con el resultado de que DNMT3A caída media la regulación de CDH1 y demuestra que la desregulación de miR-29b /cy DNMT3A están involucrados en la migración celular y la invasión GC.
Disminución de la expresión de miR-29b y miR-29c en los tejidos GC
La expresión de miR-29b /c en 50 tumores GC y tejidos no tumorales emparejadas fue examinado por QRT-PCR. En comparación con los tejidos no tumorales emparejadas, la frecuencia de miR-29b y miR-29c baja regulación (definida como una reducción mayor de dos veces) fue del 66% (33/50) y 60% (30/50), respectivamente (Fig 5A y 5B). La media veces el cambio de miR-29b y miR-29c fue significativamente menor en los tejidos tumorales que en los tejidos no tumorales (
P Hotel & lt; 0,01, Figura 5C y 5D). Para explorar el significado clínico-patológica de los miR-29b y miR-29c patrones de expresión en la tumorigénesis GC, se analizaron las características clínicas de los pacientes con cáncer gástrico. Todos los 43 pacientes analizados se clasificaron en dos grupos de acuerdo con el miR-29b y los niveles de expresión de miR-29c. Disminución de miR-29b fuertemente correlacionada con el grado de diferenciación de células tumorales y la invasión, mientras que la disminución de miR-29c solamente correlacionada con la invasión tumoral (tabla 1). Por otra parte, la relación entre la expresión de miR-29b /cy DNMT3A expresión se puso a prueba en 33 casos de CG. Un estudio de asociación mostró que la expresión DNMT3A se correlacionó negativamente con el miR-29b (
R
= -0,640,
P Hotel & lt; 0,01, Figura 5E) y miR-29c (
R
= -0,349,
P Hotel & lt; 0,05, figura 5F). En conjunto, estos datos indican que el miR-29b /c podría desempeñar un papel importante en la progresión de la carcinogénesis gástrica.
(A y B) QRT-PCR análisis que muestra el miR-29b (A) o miR-29c ( B) en 50 tejidos GC (T) y los tejidos no tumorales emparejados (N). Las muestras clínicas fueron divididos en tres grupos basados en miARN expresión relativa puntuación es mayor o menor que dos veces: N & gt; T, N = T y N & lt; T. El número de caso se muestra en cada grupo. (C y D) Gráficos de dispersión de miR-29b (C) o miR-29c (D) plegar los cambios en GC y sus tejidos no tumorales pareadas. En ambos paneles, las líneas horizontales representan la media y las barras verticales representan el intervalo de los datos (**
P
& lt; 0,01). (E y F) Correlación entre DNMT3A y miR-29b (E) o miR-29c (F) expresión en 33 muestras clínicas, con las líneas de regresión lineal y correlación de Pearson importancia (miR-29b: R = -0,640; **
P Hotel & lt; 0,01; miR-29c:. R = -0,349; *
P Hotel & lt; 0,05; Pearson
χ2
prueba)
Discusión
La familia de miR-29 conserva, incluyendo el miR-29a, 29b MIR-MIR-29c y, está implicado en varios procesos de bodega, como la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y la metástasis, por lo que una bien analizada familia de miRNAs en la tumorigénesis [16]. Estudios anteriores han demostrado que el aumento de la expresión de miR-29a se asocia con mejores tasas de supervivencia global en pacientes en estadio II del cáncer de colon [27] y los niveles más bajos de miR-29b podrían promover la metástasis del cáncer de próstata mediante la regulación de las vías de señalización de transición epitelio-mesénquima [28] . Además, las funciones miR-29c como un supresor de la metástasis que inhibe la adhesión de células de cáncer de pulmón a la matriz extracelular y la migración
in vitro
y
in vivo
[29]. En GC, redujo significativamente los niveles de miR-29b y miR-29c, en particular, se han observado en comparación con miR-29a [14], lo que sugiere que el miR-29b /c puede jugar un papel más importante. Por lo tanto, se seleccionó miR-29b /c para el análisis en este estudio. En el presente estudio, hemos demostrado un aumento de miR-29b /c suprime la migración y la invasión de las células BGC-823 utilizando un ensayo de cicatrización de la herida y un ensayo Transwell. Estos resultados son consistentes con otros datos presentados obtenidos de SGC-7901, HGC-27 y MGC-803 células GC [14, 15]. Dado que miR-29b /c también juegan un papel en la proliferación y la apoptosis en GC, se evaluó la capacidad de crecimiento de las células y los niveles de apoptosis celular en las células BGC-823. Los resultados mostraron que no hay diferencia en la proliferación a las 48 horas para imita /c miR-29b o células inhibidores-transfectadas, en comparación con las células de control negativo (
P
& gt; 0,05, S2A y S2B Fig). Además, Anexina-V tinción demostró ningún aumento dramático en los niveles de apoptosis en las células transfectadas con imita /c miR-29b después de 48 horas de incubación (Fig S2C). Además, el análisis del ciclo celular no mostró diferencias significativas en G1, S, G2 /M fases después del tratamiento con los miR-29b imita /c o imita control negativo para 48 horas (
P
& gt; 0,05, S2D Higo). Estos datos sugieren que el miR-29b /c retarda la herida recuperación de la zona a las 48 horas, principalmente debido a las capacidades de la motilidad celular disminuida.
miRNAs ejercen sus funciones principalmente apuntando a los 3'UTRs de genes diferentes. Sin embargo, los mecanismos moleculares detallados de miR-29b /c relacionadas con el desarrollo GC malignos son poco conocidos. Cabe destacar que el miR-29b /c comparte la misma complementariedad de los sitios en el 3'UTR de DNMT3A, que fue predicho por los programas de predicción de destino incluyendo TargetScan, Miranda y miRBase. Todavía no se sabe si miR-29b /c regula la metilación anormal de genes asociados con la metástasis mediante la interacción con DNMT3A durante el desarrollo de GC. Por lo tanto, se realizó un ensayo indicador de luciferasa y se encontró que una expresión elevada DNMT3A se asoció con baja expresión de miR-29b /c en las células de GC, lo que indica DNMT3A es un objetivo directo transcripcional de miR-29b /c. Sin embargo, la base molecular que conduce al desequilibrio de miR-29b /c en GC sigue siendo desconocido. miR-29 promotores proximales tienen sitios de unión para varios factores de transcripción, tales como c-Myc, y CEBPA, que contribuyen a la desregulación de miR-29 [30, 31]. Sin embargo, no se ha informado de la investigación sobre la regulación epigenética de los genes miARN-29.
En las células eucariotas, hay tres metiltransferasas de ADN enzimáticamente activas (DNMTs), DNMT1, DNMT3A y DNMT3B. La expresión de DNMT3A en GC es significativamente mayor que la de DNMT3B [32, 33]. Por otra parte, sólo el aumento de la expresión DNMT3A se asoció significativamente con un período más corto de supervivencia libre de enfermedad en GC [34], lo que indica DNMT3A juega un papel más importante en la carcinogénesis gástrica. de tres experimentos independientes.