Extracto
La mortalidad por cáncer de próstata (CaP) es debido a la formación de metástasis. La comprensión de cómo se regula este proceso tanto, es fundamental. Hemos demostrado anteriormente que la endoglina, una de tipo III factor de crecimiento transformante β (TGF) superfamilia de receptores, suprime la invasión humana de células CaP y la metástasis. La endoglina mediada por la supresión de la invasión También se demostró por nosotros para ser depende del tipo de receptor I TGF, activin receptor de la quinasa 2 (ALK2), y el efector aguas abajo, Smad1. En este estudio hemos demostrado por primera vez que se requieren dos receptores de tipo II TGF para la supresión de la endoglina mediada de la invasión: activina A IIA tipo receptor (ActRIIA) y morfogenética ósea de tipo receptor de la proteína II (BMPRII). de señalización corriente abajo a través de estos receptores es predominantemente mediada por Smad1. ActRIIA estimula la activación Smad1 de manera quinasa dependiente, y esto es necesario para la supresión de la invasión. En contraste BMPRII regula Smad1 en una forma bifásica, promoviendo Smad1 señalización a través de su dominio quinasa pero suprimiendo a través de su cola citoplasmática. efectos Smad1-reguladora de BMPRII dependen de su nivel de expresión. Además, su capacidad para suprimir la invasión es independiente de cualquiera de las funciones quinasa o dominio de cola. Demostramos que ActRIIA y BMPRII interactúan físicamente, y que cada uno también interactúa con la endoglina. Los resultados actuales demuestran que tanto BMPRII y ActRIIA son necesarias para la supresión de la endoglina mediada de la invasión de células PCa humana, que tienen efectos diferenciales en la señalización Smad1, que hacen contribuciones separadas a la regulación de la invasión, y que interactúan funcionalmente y físicamente.
Visto: Breen MJ, Moran DM, Liu W, X Huang, Vary CPH, Bergan RC (2013) Supresión endoglina mediada por la invasión del cáncer de próstata está regulado por Activina y morfogenética ósea de tipo II receptores de proteínas. PLoS ONE 8 (8): e72407. doi: 10.1371 /journal.pone.0072407
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Septiembre, 2012; Aceptado: July 15, 2013; Publicado: 13 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Breen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud a RCB, CA122985. Este trabajo es apoyado en parte por los programas académicos de Malkin el Centro de Cáncer Integral Robert H. Lurie de la Universidad Northwestern través de un premio a MB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más común y la segunda causa de mortalidad por cáncer en los hombres estadounidenses [1], con esencialmente todas las muertes como consecuencia de la enfermedad metastásica [2]. La metástasis es un proceso muy ineficiente en la que las células deben superar numerosas barreras, una inicial de las cuales es escapar desde el sitio de origen a través de la adquisición de un fenotipo invasivo [3]. La señalización a través de la superfamilia TGF y sus receptores asociados es un regulador clave de este proceso en numerosos tipos de cáncer [4], incluyendo CaP [5]
TGF es el miembro prototípico de una familia de ligandos extracelulares -. De los cuales hay 33 en los mamíferos - que regulan numerosos procesos homeostáticos y de desarrollo, y lo hacen a través de un mecanismo de señalización relativamente conservada [6]. Con canónica de señalización TGF, la unión del ligando induce la oligomerización de dímeros de tipo serina /treonina quinasa I y receptores tipo II (RIS y Riis, respectivamente), en el que constitutivamente activa Riis entonces fosforilan RIS. Estas IR activados entonces fosforilan Smads asociadas al receptor aguas abajo (R-Smads). El fosforilada R-Smad se une posteriormente al mediador común, Smad4, y los complejos resultantes afecta a la transcripción de genes. En términos generales, la señalización a través de esta superfamilia se puede subdividir en ligandos TGF-como cuyos IR afines tienden a ser activina quinasa de tipo receptor (ALK) 4, 5 o 7, que tiende a activar R-Smads Smad2 o 3, y morfogenética ósea proteína (BMP) -al igual que los ligandos de señalización a través de los RI afines ALK1, 2, 3, ó 6, y R-Smads Smad1, 5, u 8.
la endoglina (también conocido como CD105) es una proteína transmembrana homodimérica que actúa como un receptor de la superfamilia de TGF auxiliar, y se considera un receptor de tipo III [7] - [9]. La endoglina modula la señalización corriente abajo de los ligandos TGF y BMP, que tiende a promover la señalización preferentemente a través de las vías de BMP-como, mientras que la inhibición TGF-como las vías de [10] - [14]. Además, la endoglina regula numerosos procesos celulares a través de vías no dependientes de Smad. Pertinente para la invasión celular, endoglina interactúa a través de su dominio citoplasmático con las proteínas que contienen dominio LIM-zyxin y zyxin relacionados con la proteína 1 para regular la composición de adhesión focal y el citoesqueleto de actina [15], [16]. Por otra parte, la endoglina regula la activación de la integrina y la señalización en una serie de procesos celulares [17] - [21]. Endoglina también puede modular el potencial transformador de la H-Ras [22].
El papel de la endoglina en el cáncer es compleja, dada la expresión diferencial y la función en todos los tipos de células [23], [24]. La mayoría se han realizado estudios de la función endoglina en las células endoteliales. mutaciones en la línea germinal endoglina causan la enfermedad genética hereditaria telangiectasia hemorrágica [25], destacando el papel de la endoglina como un regulador clave de la motilidad de las células endoteliales, la invasión y proliferación. En varios tipos de cáncer incluyendo CaP, endoglina se sobreexpresa en las células endoteliales de la microvasculatura y se asocia con la angiogénesis [26] - [28]. También es altamente expresado en el microambiente del estroma [29]. Por lo tanto, a nivel de tejido en general, endoglina es a menudo sobreexpresado en el cáncer. En contraste y de gran importancia, en las células epiteliales de tumores sólidos múltiples - y en el epitelio de la próstata, en particular, - nosotros y otros han demostrado que la expresión de endoglina se pierde con la progresión de la enfermedad [30], [31]. Hemos demostrado que esta pérdida promueve el desprendimiento de células [31], la invasión de células [14], [32] y la metástasis [33]. Mecánicamente, hemos demostrado que la endoglina suprime la invasión de una manera que depende de la RI ALK2 y el de aguas abajo R-Smad Smad1 [14]. Sin embargo, los Riis involucrados en este proceso siguen siendo desconocidos.
Teniendo en cuenta el papel de ALK2 y Smad1 endoglina en la supresión mediada por la invasión (EMSI) en el CaP, la hipótesis de que una o más Riis están involucrados en este proceso. En este informe identificamos que se requieren ActRIIA y BMPRII. Curiosamente, tienen efectos opuestos sobre la señalización Smad1 aguas abajo. ActRIIA promueve el eje de señalización previamente identificada, mientras BMPRII tiene la función bimodal, la promoción de la señalización dependiente de Smad1 a través de su actividad quinasa, mientras que la inhibición de él a través de su gran dominio de cola citosólica. En conjunto, estos hallazgos son los primeros en identificar y ActRIIA BMPRII como importantes reguladores de la EMSI y demostrar que operan a través de mecanismos distintos pero interdependientes. Estos resultados abren nuevas vías para la orientación farmacológica de CaP potencial metastásico
Materiales y Métodos
Cell Culture & amp.; La transfección
El origen y las condiciones de cultivo de células de CaP humanas PC3-M se han descrito [34]. La línea PC3-M es una línea celular PC3-derivado altamente metastásico. Se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, tampón HEPES 10 mM, penicilina 50 unidades /ml, 50 mg /ml de estreptomicina y 10% de suero bovino fetal (Life Technologies, Grand Island NY). células DU145 son células de CaP humanos derivadas de una metástasis cerebral y se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA). Estas células se mantuvieron en medios DMEM suplementado con los productos mencionados anteriormente, además de piruvato de sodio 1 mM (Life Technologies). Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono 5% y 95% de aire en condiciones de crecimiento exponencial sub-confluente con cambios triweekly de medio, y se sustituyeron con células de paso fijo sobre una base regular.
las líneas celulares se autentican según los métodos descritos en la American Type Culture Collection Boletín Técnico N ° 8, teléfonos Recomendaciones prueba de verificación de la línea [35]. En concreto, las células de paso bajo (es decir, & lt; 15 pasajes.) Congelado las reservas se utilizaron y fueron repuestos después de 20 pasajes; las células se sometieron a examen microscópico de rutina para confirmar uniforme y arquitectura celular estándar y no la infección microbiana; y se pusieron a prueba las células (a menos de tres meses) y resultaron negativos para la infección por micoplasma.
Se realizó la transfección transitoria de células como se ha descrito anteriormente [36]. Brevemente, 24 horas después de la siembra, las células fueron transfectadas con el tránsito LT1 reactivo de transfección (Mirus Bio LLC, Madison, WI) para los ensayos de invasión que sólo afecten a ADN plásmido, con Dharmafect Duo (Thermo Scientific, Lafayette, CO) para ensayos de invasión que implican la entrega simultánea de ADN plásmido y siRNA, o con Dharmafect2 (Thermo Scientific, anteriormente Dharmacon) para los experimentos de invasión y de luciferasa de los cuales el suministro de siRNA solo. Para los experimentos de inmunoprecipitación, las células se transfectaron con ADN plásmido utilizando Lipofectamine LTX (Life Technologies). Las células fueron utilizados en los ensayos indicados 24-48 horas después de la transfección. Todos los reactivos se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos experimentos, tal como se indica, las células se lavaron dos veces con PBS, privadas de suero en medio que contenía 0,1% de albúmina de suero bovino durante 3 horas, y se trató con 2 ng /ml TGF, 5 ng /ml BMP7, o 20 ng /BMP9 ml durante 30 minutos antes de la lisis
Reactivos
La neutralización de anticuerpos a las trampas de ligandos Fc-BMPRII ActRIIA, Fc-ActRIIA y, y TGF humano recombinante fueron adquiridos de amp I +;.; D Systems (Minneapolis MN) . Los anticuerpos contra las proteínas siguientes fueron comprados: fosfo-Smad1 /5, fosfo-Smad1 /5/8, Smad1 y etiqueta Myc de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA), endoglina de BD Biosciences (San Jose, CA), GAPDH Ciencias de la vida (Enzo Farmingdale NY), bandera de etiqueta y etiqueta Myc de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), α-tubulina de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA), conjugado con HRP de cabra anti-IgG de ratón (H + L) F (ab ') 2 fragmento de KPL (Gaithersburg, MD), y anticuerpo completo ECL burro anti-conejo de GE Healthcare Biosciences (Pittsburgh, PA). Los siRNAs utilizados en este estudio fueron todos los grupos de cuatro siRNAs individuales, ordenados de Thermo Scientific como ON-TARGETplus SmartPools
Los plásmidos
Se utilizaron los siguientes vectores de expresión:. PCDNA3 vector vacío comprado de Vida Technologies, endoglina en un vector pCDNA3, fue construido y descrito previamente por nosotros [31], pCMV-β-galactosidasa (β-gal) comprado de Agilent Technologies (Santa Clara, CA), pCDNA3-ActRII, pCDNA3-ActRIIA-ΔKD- 5myc, pCDNA3-ActRIIB y pCDNA3-ActRIIB-ΔKD-5myc fueron generosamente proporcionadas por Wylie Vale (Salk Institute, La Jolla, CA) [37], [38], pCDNA3-ActRIIA-myc se generó a partir pCDNA3-ActRIIA por el ADN personalizada construcciones (University Heights, OH), pCMV5-BMPRII, -BMPRII-KI y -BMPRII-Δtail construcciones fueron generosamente proporcionadas por Liliana Attisano (Universidad de Toronoto, Canadá) [39], pGL3-MLP-BRE
2-luciferasa fue un generoso regalo de Peter diez Dijke (Leiden University Medical Centre, Países Bajos) [40], pRL-TK-
Renilla luciferasa
se adquirió de Promega (Madison, WI).
Invasión ensayos
Invasión ensayos se realizaron esencialmente como se describe anteriormente por nosotros [41], con las siguientes modificaciones. Brevemente, las células fueron co-transfectadas con el ADN indicado y β-gal, con o sin siRNA como se indica. Después de 48 horas, se sembraron células sobre reducido el factor de crecimiento de 8,0 micras de poro Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences) en medio libre de suero que contiene 0,1% de BSA, en réplicas de N = 4 pocillos para cada condición experimental. NIH-3T3 medio condicionado libre de suero se coloca en la cámara inferior como un quimioatrayente, y se dejó que las células para invadir durante 24 horas. Las células en la parte superior de la membrana se eliminaron a partir de tres pocillos por condición (que permite la cuantificación de células invadidas) mientras que el cuarto fue dejado (controles de células totales) inalteradas. Después de fijar las células y tinción para la expresión β-gal utilizando un In Situ ß-galactosidasa kit de tinción (Agilent Technologies), nueve campos microscópicos (de 100x) por pocillo fueron imágenes en un microscopio Olympus CKX41 equipado con una cámara digital CCD QImaging Retiga 1300 y software de imágenes QCapture. células positivas β-gal se contaron en cada campo utilizando el software Image J y se determinó la invasión normalizado para cada uno así como gal
+ células en la invasión y /β-gal
+ células en total del pozo. invasión relativa se calculó como una fracción de una condición de control (por ejemplo, el vector vacío /SINEG).
cuantitativa de la transcriptasa reversa reacción de polimerasa en cadena
Se aisló ARN de las células utilizando RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia , CA), según las instrucciones del fabricante. ARN fue tratado con RNasa libre de DNasa y su calidad y cantidad evaluada por densidad óptica. El ADNc se sintetizó usando TaqMan transcripción reversa Reactivos (Life Technologies) o qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD), y qPCR realizar utilizando TaqMan PCR Universal Master Mix y TaqMan pares de cebadores-sondas en un sistema de PCR en tiempo real 7500 (todas de Life Technologies), todos como se describió anteriormente por nosotros [33]. RT menos el control de las reacciones se llevaron a cabo como un control negativo. exón abarca conjuntos de cebadores /sondas específicas de genes validado para ACVR2A, ACVR2B, BMPRII, TGFβRII, endoglina, Smad1, Smad5, Smad8, y GAPDH fueron de Applied Biosystems. Los ensayos se llevaron a cabo en réplicas de 2 y de los ciclos resultantes medios de umbral (Ct) se utilizaron para su posterior análisis. Los ensayos se repitieron al menos una vez en un momento separado, también en réplicas de 2. El Ct para las reacciones individuales se identificó a través de Applied Biosystems 7500 software Sistema PCR en Tiempo Real. La expresión génica se normalizó a la de GAPDH, y la expresión génica relativa se calculó por la 2
-ΔΔCt método [42].
Los ensayos de luciferasa
Las células fueron transfectadas transitoriamente con pGL3 BRE
2-luciferasa (inducible) y pRL-TK plásmidos (constitutivo) en una proporción de 20:01, con plásmidos adicionales ± siRNAs tal como se indica, como se ha descrito previamente por nosotros [14]. En pocas palabras, después de 48 horas las células se lisaron y la actividad luciferasa se midió usando un Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega). Las mediciones se realizaron tanto en un lector de placas Synergy HT (BioTek, Winooski, VT) o un luminómetro Monolight 2010 (Laboratorio Analítico de luminiscencia, San Diega CA). Después de restar la señal de fondo, la actividad luciferasa se calcula como proporción de la luciferasa de luciérnaga /
Renilla luciferasa
.
Transferencia Western
La lisis celular y la inmunotransferencia se realizaron como se ha descrito previamente por nosotros [ ,,,0],14]. Brevemente, las células se lavaron con PBS, se lisaron con tampón de lisis: PBS (NaCl 137 mM, fosfato de Na 10 mM, KCl 2,7 mM), 0,5% de Triton X-100, EDTA 1 mM, pirofosfato de sodio 2,5 mM, 1 mM β-glicerofosfato con la adición de cóctel inhibidor de proteasa (# P8340), cócteles de inhibidores de fosfatasa 1 y 2, fluoruro de sodio 10 mM, y ortovanadato de sodio 1 mM (todos de Sigma-Aldrich), y los lisados aclarados por centrifugación, todo a 4 ° C. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA), cantidades iguales se separaron por SDS-PAGE bajo condiciones desnaturalizantes y reductoras, se transfirieron a nitrocelulosa (Bio-Rad), y se tiñeron con Ponceau S (Sigma-Aldrich ) para verificar incluso carga y transferencia. Las membranas se ya sea bloquearon y se sondaron con anticuerpo primario (4 ° C durante la noche) y secundaria (temperatura ambiente 1 hora) en 5% de leche en TBS-T (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween 20) o bloqueado y se sondaron con 0,5% de leche /TBS-T usando SNAP ID colector de vacío (Millipore), por las sugerencias del fabricante. Las membranas fueron incubadas con ECL Western Blot Detección Reactivos y se expusieron a Hyperfilm ECL Amersham (ambos de GE Healthcare). Las películas fueron desarrolladas utilizando un procesador de películas SRX-101A (Konica Minolta, Wayne, NJ). Las membranas fueron despojados en Tris 62,5 mM (pH 6,8), 2% de SDS, y 100 mM β-mercaptoetanol durante 20 minutos a 50 ° C, se lavó brevemente en TBS-T, y volvieron a sondar como anteriormente. Todas las transferencias de Western se repitieron al menos una vez, en un momento separado.
inmunoprecipitación
Las células se lavaron con PBS y proteínas de la superficie se reticularon con el reactivo de reticulación permeable al agua 2 mM 3,3 ' ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato) (DTSSP; Thermo Scientific) en PBS. reacción de reticulación se interrumpió mediante la adición de Tris, pH 7,5 a 20 mM. Las células se lisaron entonces como antes usando tampón compuesto de los siguientes: mM Tris HCl 10, pH 7,4; NaCl 145 mM; 10% de glicerol; 0,5% NP-40; proteasa y inhibidores de la fosfatasa que anteriormente. Los lisados se aclararon por centrifugación y la concentración de proteína se determinó por el método de Bradford como anteriormente. Una cantidad igual de proteína se precleared con perlas de agarosa conjugadas con proteína A recombinante (Life Technologies, que se utiliza para la IgG de conejo) o Proteína G Plus (Thermo Scientific, que se utiliza para IgG de ratón) durante 1 hora a 4 ° C con rotación. lisados precleared se transfirieron a nuevos tubos y se incubaron con IgG durante la noche a 4 ° con rotación. complejos de anticuerpo-antígeno se recuperaron por 2 h de incubación con proteína A o proteína G, en concordancia con la etapa de preautorización. Las perlas se recuperaron y sobrenadante se retiró y se guardan. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de lisis enfriado con hielo. Las muestras se equilibraron a 1X tampón de Laemmli que contiene 5% β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) y se incubaron en 95 ° C del bloque de calor de 6 min, reducir y desnaturalizar las muestras y la escisión del agente de reticulación. Las muestras se sometieron a transferencia Western como se describió anteriormente.
Análisis estadístico
Para el análisis de los ensayos de invasión pruebas t de una cola de Student no pareado se calcularon en base al fenotipo evaluado de revertir la supresión de la invasión. Para los ensayos de luciferasa y QRT-PCR, se utilizaron pruebas t de dos colas de Student no pareado de Student. P values≤0.05 se consideraron significativos.
Resultados
Supresión endoglina mediada por la invasión Requiere ActRIIA y BMPRII
La endoglina supresión mediada de la invasión (EMSI) en el CaP requiere una RI, es decir, ALK2 [14]. Además, la señalización canónica a través de la superfamilia de TGF de los receptores requiere la activación dependiente de ligando de la RI por un [6] RII. Por lo tanto, la hipótesis de que EMSI requeriría una o más Riis. Evaluamos esto mediante la transfección de células de CaP humanas PC3-M y DU-145 con la endoglina, junto con siRNA específico para los subtipos RII individuales: activina A del receptor de tipo IIA (ActRIIA), activina Un receptor de tipo IIB (ActRIIB), ósea morfogenética tipo de receptor de la proteína II (BMPRII), o el factor de crecimiento transformante β del receptor de tipo II (TGFβRII). Por tanto PC3-M y las células DU-145, endoglina suprime significativamente la invasión a 60% y el 50% de las células de control, respectivamente, y esto se suprime por siRNA ActRIIA la orientación o BMPRII pero no ActRIIB o TGFβRII (Figura 1A). Con el fin de investigar más a fondo el mecanismo de ActRIIA y BMPRII en afectar EMSI, los estudios se centraron en las células PC3-M CaP humanos. Constituyen un fenotipo metastásico [34] y se sabe que expresan niveles muy bajos de línea de base de la endoglina [14].
A) El efecto de los receptores de tipo II sobre la endoglina mediada por la supresión de la invasión (EMSI). PC3-M (izquierda) o DU-145 (a la derecha), las células fueron transfectadas transitoriamente con el vector vacío (Vec) o con la endoglina junto con siRNA, como se indica. Se utilizaron los siguientes siRNAs: SINEG - no director de control negativo, si2A - se dirige a ActRIIA, si2B - ActRIIB objetivos, metas siBMP - BMPRII, siTGF - TGFβRII objetivos. Después de 48 horas, se midió la invasión de células. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes, cada uno en réplicas de 3. *, p = 0.05 en comparación con Vec /SINEG. Micrografías son imágenes representativas de las células que han invadido a través de Matrigel, se tiñeron para gal, y la imagen (100X). B) ActRIIA y BMPRII siRNA es específica. células PC3-M fueron transfectadas transitoriamente con la endoglina junto con los siRNAs indicados como en (A). Después de la expresión de ARNm de 48 horas se evaluó a través de QRT-PCR, normalizado a GAPDH, y se expresa respecto a las células transfectadas con SINEG (normalizado a 1,0). Los datos representan la media ± desviación estándar de un solo experimento, realizado en réplicas de N = 2; se observaron resultados similares en un experimento independiente (N = 2 repeticiones). *, P = 0.05 en comparación con SINEG. C) ActRIIA y BMPRII ARNsi suprime la proteína diana. células PC3-M se transfectaron con ActRIIA-myc (paneles superiores) o BMPRII-flag (paneles inferiores), así como con los siRNAs indicados, seguido de transferencia de Western de las proteínas indicadas. Los datos son de un experimento representativo (n = 2 experimentos separados). D) El bloqueo de ActRIIA o inhibe la unión del ligando EMSI BMPRII. células PC3-M se transfectaron transitoriamente con el vector vacío o endoglina como anteriormente. Después de 2 días, se trataron previamente las células durante 5 horas trampas de ligandos que comprenden o ActRIIA BMPRII dominio extracelular fusionado con región Fc de inmunoglobulina (Fc-A2 o Fc-B2 respectivamente). El tratamiento continuó durante la posterior realización de ensayos de invasión celular. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes, cada una de las repeticiones de N = 3. *, p = 0.05 en comparación con Vec /-.
Existe una estrecha homología entre los receptores de la superfamilia TGF. Por lo tanto, es particularmente importante para hacer frente a la especificidad siRNA, que se demuestra en la Figura 1B. El uso de cebadores específicos de secuencia para cada receptor, se muestra de QRT-PCR que el receptor de siRNA específico llama significativamente el receptor diana por ≥60% en cada caso, sin modulación significativa de los receptores no diana. La eficacia y la especificidad de siRNA dirigidos ActRIIA y BMPRII estaba al lado demostrado por los efectos a nivel de proteínas de medición. Un problema endémico en el campo se refiere al hecho de que los anticuerpos generados contra un subtipo de receptor de la superfamilia TGF dado tienden a tener niveles relativamente altos de reactividad cruzada. Hemos tratado esta por las células co-transfección, ya sea con o ActRIIA bandera de etiquetado BMPRII, junto con siRNA para Riis individuales myc-etiquetados, seguido de Western blot-etiqueta específica (Figura 1C). De esta manera se demuestra la supresión de siRNA mediada por el receptor específico de la expresión de proteínas a niveles prácticamente indetectables tanto para ActRIIA y BMPRII.
La unión de ligandos extracelulares a ActRIIA y BMPRII constituye un determinante principal de su función de señalización. Por lo tanto, la hipótesis de que si ActRIIA y BMPRII son verdaderamente importantes reguladores de la EMSI, a continuación, su modulación de este proceso debe ser dependiente de ligandos afines, al menos en parte. Se determinó que esto es de hecho el caso mediante la transfección de células con la endoglina, seguido por la medición del efecto sobre la invasión cuando ligandos afines extracelulares fueron bloqueados de la unión al receptor (Figura 1D). Esto se logró mediante el tratamiento de las células con construcciones de proteínas recombinantes, Fc-A2 o Fc-B2, que consiste en la ActRIIA o dominios extracelulares BMPRII, respectivamente, fusionado a un dominio constante de inmunoglobulina, por lo que sirve como una trampa de ligando. Como puede verse en la Figura 1D, el bloqueo de la unión del ligando al receptor o bien invierte EMSI. Estos estudios ligando bloqueo complementan nuestros estudios desmontables. Tomados en conjunto, nuestros resultados implican ActRIIA y BMPRII como importantes reguladores fisiológicos de EMSI.
ActRIIA y BMPRII tienen efectos opuestos sobre Aguas abajo Smad1 Señalización
Hemos demostrado previamente que la endoglina aumenta la fosforilación de Smad1, que Smad1 suprime la invasión de células, y que es necesario para Smad1 EMSI [14]. Por lo tanto, se evaluó el efecto de ActRIIA y BMPRII en la regulación de la fosforilación Smad1. Esto se hizo derribando ActRIIA o BMPRII a través de la transfección de células PC3-M con siRNA, mientras que la co-transfección con el vector vacío o endoglina. entonces fosforilación de Smad1 se evaluó mediante transferencia Western (Figura 2A). Independientemente del estado de la endoglina, desmontables de ActRIIA disminuye los niveles de fosfo-Smad1. Sorprendentemente, desmontables de BMPRII tiene el efecto contrario; aumenta fosfo-Smad1. Al igual que con nuestros estudios anteriores [31], la expresión de endoglina endógeno en células PC3-M es tan baja como para acercarse al límite de detección.
células PC3-M fueron transfectadas transitoriamente con el vector o endoglina vacía y el indicado siRNA como en la Figura 1. Dos días después se lisaron las células por transferencia Western (a) o el ensayo de luciferasa promotor (B). A) ActRIIA y BMPRII diferencialmente regulan la fosforilación de proteínas Smad1. transferencia de Western en el lisado celular resultante se realizó para Smad1, fosfo-Smad1 /5 (pSmad1 /5), endoglina y GAPDH. Los datos son de un experimento representativo (n = 4 experimentos). B) ActRIIA y BMPRII regulan diferencialmente BRE activación
2-luciferasa. Las células fueron adicionalmente co-transfectadas con BRE
actividad de luciferasa 2-luciferasa y
Renilla
constructos de luciferasa, y (normalizado a
Renilla
actividad de la luciferasa) se midió. Los datos son la media ± SD de un solo experimento llevado a cabo en réplicas de N = 2, llevado a cabo tres veces por separado con resultados similares (también N = 2). *, P = 0.05 entre los grupos indicados. C) BMP7- y la fosforilación Smad1 BMP9 estimulada se diferencialmente regulados por ActRII y BMPRII. Las células se transfectaron como anteriormente, mueren de inanición de suero, y se trataron con BMP7 o BMP9 como se indica. Western blot en el lisado celular resultante se realizó para fosfo-Smad1 /5 (pSmad1 /5) y Smad1 total. Los datos provienen de un experimento representativo (n = 2 experimentos).
Hemos demostrado previamente en el mismo sistema en que estamos utilizando esa primaria inducida por los aumentos en estado de expresión de endoglina inducir aumentos tanto en la fosforilación, así Smad1 como en la actividad transcripcional Smad1, medido por el ensayo de indicador de luciferasa usando el Smad1 sensible BRE reportero constructo
2-luciferasa [14]. Es importante destacar que, en este mismo sistema, también hemos demostrado cómo varias perturbaciones diferentes tienen efectos discordantes sobre la fosforilación Smad1 y su actividad transcripcional funcional. Sin embargo, en todos los casos, cambios en la función transcripcional Smad1 reflejan efectos concordantes sobre la función biológica, como evaluado por estudios asociados Smad1 desmontables, así como ensayos de invasión [14], [32]. Aunque el mecanismo que subyace a este fenómeno no está completamente claro, parece reflejar el hecho de que las células de próstata humanos contienen niveles muy altos de la fosfatasa ácida, y que durante la lisis celular tiene efectos específicos de la proteína que no se pueden introducir de manera adecuada bajo control incluso con alto los niveles de inhibidores de la fosfatasa [43]. Por consiguiente, consideramos evaluación de la función transcripcional Smad1 ser el ensayo informativo. Como tal, pasamos a evaluar el efecto de ActRIIA y BMPRII caída tras la activación BRE
2-luciferasa (Figura 2B). Una vez más se demuestra que, independientemente del estado de la endoglina, desmontables de ActRIIA disminuye significativamente la función Smad1 mientras que desmontables de BMPRII que aumenta significativamente. Estos resultados son consistentes con los datos de fosforilación Smad1 en la Figura 2A, y demuestran que los cambios en la fosforilación Smad1 están asociados con alteración de la transcripción mediada por Smad. Sin embargo, también demuestran que los efectos inducidos por BMPRII sobre la función transcripcional Smad1 no son congruentes con el efecto de BMPRII sobre EMSI.
Para investigar BMPRII Además, hemos examinado los efectos sobre la señalización en condiciones de proteína morfogénica ósea (BMP) la estimulación del ligando . ActRIIA y BMPRII fueron derribados como en la figura 2A, fueron suero de hambre células, ya sea simulado con BMP-7 o BMP9, y Smad1 5 fosforilación /evaluado por Western blot (Figura 2C). Con cualquiera de BMP-7 o BMP9, desmontables de ActRIIA atenúa estimulada por ligando Smad1 /5 fosforilación, mientras que desmontables de BMPRII lo multiplica. Al demostrar un perfil de respuesta de señalización similar bajo condiciones de estimulación del ligando BMP comparación con la de las condiciones de cultivo estándar, se apoya además la importancia de la BMP. Estos resultados corroboran los de la Figura 1D, que demuestran que la BMP ligando es necesaria para EMSI.
Ni el
2-sistema promotor de luciferasa BRE ni los anticuerpos fosfo-Smad disponibles en la actualidad son capaces de distinguir completamente entre Smad1 , Smad5 y Smad8 isoformas. Por lo tanto, se evaluó el grado en que estas otras isoformas Smad podría ser responsable de los efectos observados actualmente. En concreto, dado que BMPRII caída inesperada dado lugar a lo que parecía ser el aumento de la señalización Smad1, hemos querido examinar la posibilidad de que BMPRII caída fue aumentando Smad5 o Smad8 de señalización, lo que podría enmascarar una disminución funcionalmente importante en la señalización Smad1. Utilizando el análisis de QRT-PCR específica de gen, que primero demostramos que siRNA a las isoformas individuales Smad es altamente específico y eficaz, silenciando significativamente la isoforma blanco de ≥90% en cada caso, mientras que no tiene efecto significativo sobre las isoformas no diana (figura 3A). A continuación trató de determinar qué Smads se activaron a la sobreexpresión endoglina. Desmontables de Smad1 resulta en la pérdida casi total de la señal específica de un anticuerpo que reconoce fosfo-Smad1, 5, y 8 (Figura 3B). Verificamos que la expresión de proteínas Smad1 se suprime efectivamente por siRNA a Smad1, pero no se suprime por siRNA dirigidos Smad5 o Smad8. El uso de un anticuerpo que reconoce tanto fosforilada Smad1 y Smad5, se demuestra que Smad5 también es fosforilada en presencia de endoglina. A continuación, pasó a demostrar que desmontables de Smad1 provoca una reducción del 90% del aumento inducido por la endoglina en BRE
2-luciferasa (Figura 3C). Por el contrario, el aumento de la endoglina inducida por la actividad BRE
2-luciferasa se reduce sólo en un 30% después de Smad5 caída, y no en todos por Smad8 caída. Por último, como se muestra en la Figura 2 que BMPRII caída aumenta la activación Smad1, hemos examinado el efecto de la supresión isoforma Smad en la cara de BMPRII caída en células repletas de endoglina (Figura 3D). Similar a los hallazgos en la Figura 3C, Smad1 caída abroga significativamente el aumento de la actividad BRE
2-luciferasa alcanzado por BMPRII caída, mientras que Smad5 o desmontables Smad8 no tienen ningún efecto significativo. En conjunto los resultados anteriores demuestran que ActRIIA aumenta la fosforilación y la función Smad1, mientras BMPRII lo disminuye.