Extracto
cromosomas dobles diminutos son manifestaciones citogenéticas de amplificación génica observada con frecuencia en las células cancerosas. Los genes amplificados en los cromosomas dobles minuto incluyen oncogenes y genes resistentes a múltiples fármacos. Estos genes codifican proteínas que contribuyen a la formación de cáncer, la progresión del cáncer, y desarrollo de la resistencia a los medicamentos utilizados en el tratamiento del cáncer. Eliminación de cromosomas dobles por minuto, y por lo tanto los genes amplificados en ellos, es una manera eficaz de reducir la malignidad de las células cancerosas. Se investigó la eficacia de un fármaco contra el cáncer, gemcitabina, en la pérdida de cromosomas dobles hora de la línea celular de cáncer de ovario UACC-1598. La gemcitabina es capaz de disminuir el número de cromosomas dobles hora en células a una concentración 7500X más baja que la hidroxiurea medicamento contra el cáncer de uso común. genes amplificados presentes en los cromosomas dobles hora se reducen a nivel del ADN después del tratamiento con gemcitabina. Gemcitabina, incluso a una baja concentración nanomolar, es capaz de causar daños en el ADN. La incorporación selectiva de señales dobles minutos de la cromatina y γ-H2AX en micronúcleos proporciona un fuerte vínculo entre el daño del ADN y la pérdida de cromosomas dobles hora de las células tratadas con gemcitabina. Las células tratadas con gemcitabina también mostraron una disminución de crecimiento celular, la formación de colonias, y la invasión. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la gemcitabina es eficaz en la disminución de los cromosomas dobles diminutos y esto afecta a la biología de las células de cáncer de ovario
Visto:. Yu L, Zhao Y, Quan C, W Ji, Zhu J, Huang Y, et al. (2013) La gemcitabina Elimina cromosomas dobles diminutos de células de cáncer de ovario humano. PLoS ONE 8 (8): e71988. doi: 10.1371 /journal.pone.0071988
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 17 Marzo, 2013; Aceptado: July 5, 2013; Publicado: 22 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Internacional de Ciencia & amp; Programa de Tecnología de Cooperación de China (2013DFA31610 a SF), el Programa de Changjiang eruditos y Equipo de investigación innovadora en la Universidad (IRT1230 a YJ), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31000626 y 31271347 de WS, 81.201.761 de LY), y el Nuevo Programa siglo Apoyo al alumno excelente, Ministerio de Educación de China (NCET-10-0149 a WS, NCET-11-0954 a YY). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
amplificación
gene es una forma de inestabilidad genómica que se observa con frecuencia en los cánceres, y se puede manifestar regiones citogenéticamente como tinción homogénea (HSR) o cromosomas dobles hora (DMS) [1], [2], [3 ], [4]. DMS de replicación autónoma, acéntrico, y el ADN circular atelometric que van desde cientos de kilobases a unos megabases en tamaño [5], [6], [7], [8], [9], [10]. En la metafase para untar teñido con un tinte de unión al ADN, DM puede ser visto bajo el microscopio como cromatina minutos simple o emparejado mucho más pequeños que los cromosomas.
Como un vehículo extracromosómico para las amplificaciones de secuencias de ADN genómico, contribuyen a DM formación y progresión del cáncer porque oncogenes y genes de resistencia a múltiples fármacos son con frecuencia presentes en las secuencias amplificadas y las proteínas que codifican son a menudo sobre-expresado [11]. Los ejemplos de genes amplificados en los DM incluyen
MYCN
en el neuroblastoma [12],
C-MYC
en células de cáncer de colon [13],
EGFR
en los gliomas [14], y
eIF-5A2 Hoteles en células de cáncer de ovario [15], y todos los cuales cuando se pierde a través de modalidades contribuye a la reversión del fenotipo del cáncer [12], [13], [14], [16]. Eliminación de amplificaciones de oncogenes en DM también se ha demostrado que induce la muerte apoptótica celular, la diferenciación celular, y la senescencia celular [13], [17], [18].
Muchos estudios han contribuido a nuestro entendimiento de la mecanismo de la pérdida de DM de las células cancerosas. La pérdida de la DM se ha demostrado en muchas líneas celulares de cáncer [12], [13], [17], [19], [20], [21], [22]. bajas concentraciones no letales de la hidroxiurea (HU) en primer lugar se ha encontrado para aumentar la pérdida de DM a partir de células de ratón que contiene amplificada DHFR [23], y más tarde se encontró que tienen el mismo efecto en las células cancerosas de mamífero [13], [24] . La pérdida de DM por bajas concentraciones de HU puede aumentar la sensibilidad de drogas [24] y reducir la tumorigenicidad de las líneas celulares de cáncer [13]. Lo más importante, la pérdida de DM se contribuyó a su atrapamiento en micronúcleos (MN) [13] y esto atrapamiento también puede mejorarse por bajas concentraciones de HU [25], [26].
Existen dos modelos de la formación de MN: ciernes /nucleación en interfase y la formación de post-mitótico [27]. Existe evidencia limitada de la contribución de HU a la formación de MN por gemación /nucleación [25]. Un estudio detallado indica HU puede inducir la formación de MN a través del modelo post-mitótico [28]. En este modelo, HU induce el desprendimiento de DM de cromosomas mitóticos tales que los agregados de DM se forman después de la mitosis en la siguiente fase G1 del ciclo celular. Después las células entran en la fase S, los agregados DMs están rodeadas por la proteína lamina para producir un MN citoplásmica replicable [28]. El mecanismo molecular de HU en la formación de MN se ha investigado intensamente en las células de cáncer de colon que contienen DM [26]. Las bajas concentraciones de HU provoca daños en el ADN en el núcleo celular en la fase S, detectable como γ-H2AX focos, pero las señales no se superponen significativamente con los DM de la cromatina. A medida que se repare el daño y las células progresan a través del ciclo celular, la mayoría de las señales de γ-H2AX se pierden por la metafase mientras que cualquier señal que permanecerá superposición con DM cromatina. Los DM con γ-H2AX señal se encontraron a desprenderse de anafase los cromosomas y formar MN en la siguiente fase G1 [26].
HU es un inhibidor que inhibe específicamente la ribonucleótido reductasa (RNR). RNR es una enzima importante que se requiere para el
de novo síntesis de desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs) en las células mediante la conversión de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos [29], [30], [31]. La ribonucleótido reductasa es codificada por dos genes
RRM1
y
RRM2
, correspondiente a la gran R1 y R2 de la subunidad pequeña de la enzima, respectivamente. HU es un inhibidor importante de esta enzima, inhibiendo específicamente la subunidad R2. RNR no sólo es importante para el mantenimiento de equipos de dNTP necesarios para la replicación del ADN, sino también juega un papel importante en el mantenimiento de la integridad del genoma [32].
La gemcitabina (2 ', 2'-difluorodesoxicitidina, GEM) es un medicamento contra el cáncer más reciente e inhibe la subunidad R1 de RNR. Tiene dos propiedades funcionales. Una es la interacción directa con la subunidad R1 de RNR que disminuye la función RNR y con ello disminuye el nivel de dNTPs en las células. Muchos estudios han indicado que
RRM1
nivel de expresión determina la sensibilidad o resistencia GEM [33], [34], [35], [36], [37]. Desde GEM es un análogo de la desoxicitidina, la segunda característica de GEM es que puede ser modificada por enzimas celulares para producir dFdCTP (2 ', 2'-difluorodesoxicitidina-5'-triphsophate) que puede ser incorporado en el ADN recién replicado que resulta en la terminación de cadena [38]. GEM se usa para tratar varios tipos de cáncer, como el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama y cáncer de ovario [39], [40], [41], [42], [43] .
el cáncer de ovario es una de las principales neoplasias ginecológicas. A pesar de los recientes avances en el tratamiento de este tipo de cáncer, más de la mitad de los pacientes con enfermedad avanzada desarrollan resistencia a la terapia, la experiencia recurrencia de la enfermedad, y eventualmente mueren a causa de estas propiedades [44]. El tratamiento estándar del cáncer de ovario es la cirugía seguida de carboplatino más paclitaxel terapia, sin embargo, muchos pacientes desarrollan enfermedad recurrente con la resistencia a la terapia de platino [45]. Tras la aprobación del uso de GEM en el tratamiento de cáncer de ovario en Europa, EE.UU. y otros países en los últimos años, GEM está convirtiendo en un nuevo fármaco prometedor en el tratamiento de los cánceres de ovario. Recientemente GEM se ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de los cánceres de ovario, especialmente en la subclase resistente platino, ya sea utilizado solo o en combinación con otros fármacos [1], [40], [44], [45], [46]. se encontraron
Los DM a estar presentes en las muestras de carcinoma de ovario primarios y ascitis de pacientes con cáncer de ovario, y en líneas celulares de cáncer de ovario establecidos [15], [47], [48], [49], [50] . Un estudio ha encontrado que en los pacientes la frecuencia de carcinoma de ovario de DM es tan alta como 88% [51]. Un estudio ha encontrado que los pacientes con cáncer de ovario tratados con bajas concentraciones de HU, el número de DM disminuyó en las células cancerosas de estos pacientes [52]. Aunque HU puede tomarse oralmente o inyectarse por vía intravenosa, es un inhibidor débil de RNR con una vida media de sólo 3,4 horas antes de ser eliminado por el riñón [53]. En este estudio, determinamos si GEM puede disminuir selectivamente ciertos amplificaciones de genes a través de modalidades, los mecanismos de disminución de modalidades, y qué valor tiene en el tratamiento de cáncer de ovario. GEM podría disminuir el número de DM en las células de cáncer de ovario, así como los genes amplificados en el proyecto de modalidades específicas a una concentración inferior a 7500X HU. Con la adición de GEM, el número de MN aumentó, y genes realizadas en DM se incorporan selectivamente en estos MN. Incluso bajas concentraciones de GEM podrían causar daños en el ADN en las células, y éstas ADN dañado, también se incorporan selectivamente en MN. Proponemos que GEM puede causar daños en el ADN en los DM, que cuando no se repara, se incorporan selectivamente en MN y perdió a partir de células. Esto a su vez afecta a la biología de las células cancerosas, de tal manera que las células muestran un crecimiento disminuido, disminución de la formación de colonias, y la disminución de la invasión.
Materiales y Métodos
1. Líneas celulares y condiciones de cultivo
La línea celular de cáncer de ovario UACC-1598 fue una especie de regalo del doctor Xin-Yuan Guan (Universidad de Hong Kong) [15]. La línea celular UACC-1598-4 era un clon de UACC-1598 seleccionado para el mantenimiento estable de un elevado número de DM. Fue realizado por el método de dilución en serie. Todas las líneas celulares se mantuvieron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Las células fueron cultivadas a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y pasaron cada 2 a 3 días cuando crecieron confluente.
2. Tratamiento y análisis de crecimiento
HU y el IPG fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, EE.UU.) y Lilly France (Francia), respectivamente, y preparados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La solución madre de HU se hizo en dimetilsulfóxido (DMSO) y la solución GEM Stock se hizo en 0,9% de NaCl. Las concentraciones de HU utilizados en los experimentos fueron de 100 y 150 mM siguientes concentraciones publicados [23], [24], [26]. Las concentraciones de GEM utilizados fueron 10 y 20 nM, que eran diferentes diluciones de su media máxima concentración inhibitoria (IC
50) en las líneas celulares utilizadas en este estudio. La concentración de gemcitabina utilizado en este estudio fue 3-6 veces menor que el estándar
in vivo
dosis administrada a los pacientes (Lilly Francia). Las concentraciones de 10 y 20 nM de GEM corresponde a 0,01 IC
50 y 0,02 IC
50 de GEM en la línea celular UACC-1598-4. Las mismas concentraciones corresponden a 0,032, y 0,064 IC
50 de GEM en la línea celular UACC-1598. Las células se pasaron cada 2 a 3 días y se añadieron los compuestos frescos. El IC
50 de GEM se calculó utilizando CellTiter 96 AQ
ueous Una célula de soluciones Kit de Ensayo de proliferación de Promega (Madison, WI, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante.
3. MTS, formación de colonias, y la invasión ensayos
Brevemente, los ensayos biológicos de células se llevaron a cabo como sigue. Para el ensayo de MTS, 2000 células se sembraron en cada pocillo de placas de 96 pocillos. Las células se dejaron ya sea para crecer en medio solo o medio que contiene 150 mM HU o 20 nM GEM. La DO de cada pocillo se lee todos los días después de la CellTiter 96 AQ
protocolos One Solution Kit de ensayo de proliferación de células ueous y se representa. Para la formación de colonias, las células 2000 se sembraron en cada pocillo de una placa de 6 pocillos en presencia o ausencia de compuestos. Las células se dejaron crecer durante 14 días antes de ser lavada con solución salina tamponada con fosfato (PBS), la fijación de etanol, y la tinción de Giemsa. Se tomaron fotos de cada pocillo y se contaron las colonias manualmente con el software ImageJ. Tres repeticiones fueron realizadas para cada condición. Para la invasión de células, sesenta mil células se sembraron en BD BioCoat Matrigel Invasión Chambers (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.), y se dejaron invadir a través de una membrana de Matrigel. Después de 72 horas, se contó el número de células que invadieron a través de la membrana. Tres repeticiones se realizaron para cada condición compuesta.
4. Propagación de metafase
Las células se trataron con Colcemid (Sigma) durante 1,5 h, se tripsinizaron y se lavaron en PBS antes de preparar los diferenciales de metafase. Las células se hincharon primero en 9 ml de pre-calentado KCl 0,075 M durante 14 min, a 37 ° C. Después del hinchamiento, las células se pre-fijado con 1 ml de solución de fijación recién hecho (mezcla de 3: 1 de metanol ácido acético) y se centrifugaron inmediatamente. Las células se fijaron posteriormente y se centrifugaron dos veces con 10 ml de la solución de fijación. Los sedimentos celulares a partir de la última centrifugación se volvieron a suspender en 0,5 ml de fijador, y una pequeña cantidad fue tomada en una pipeta Pasteur y se dejó caer sobre portaobjetos de vidrio limpios. cromosomas mitóticos se observaron mediante tinción de los portaobjetos con Giemsa y se fotografiaron con el microscopio Olympus BX41 (Olympus America Inc., Melville, NY, EE.UU.) conectado a una cámara de vídeo en color JVC TK-C75U (JVC, Japón) con un aumento de 1000X. El número de DM presente en cada célula se contó manualmente. El número de células contadas rangos de 60 a 100 para cada muestra.
5. Aislamiento de ADN genómico y PCR en tiempo real
Las células se sedimentaron y el ADN genómico se preparó con el kit de ADN QIAamp Blood Mini (QIAGEN, Alemania) como se describe por el fabricante. PCR en tiempo real se realizó mediante la mezcla SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara Biotecnología (Dalian) Co., Ltd., China) en el LightCycler 480 (Roche Applied Science, Alemania) sistema de detección de PCR en tiempo real. El nivel de amplificación de
MYCN
,
EIF5A2
, y
MCL 1
se detectaron, y
ACTB
sirvió como control interno. La media ± desviación estándar (DE) de tres réplicas se trazan para cada serie de comparaciones entre las células de tratamiento y control. Los cebadores utilizados fueron los siguientes:
EIF5A2
, 5'-TACTTGGCAGAGATTAAACAGG-3 '(F), 5'-CAAAGTATTTGCACCTTGAAG-3' (R);
MYCN
, 5'-ACCACAAGGCCCTCAGTAC-3 '(F), 5'-GCAACGGCATTCTCTCAG-3' (R);
MCL 1
, 5'-CTGGAGATTATCTCTCGGTAC-3 '(F), 5'-CTGACTCGTTTCGGTTTC-3' (R);
ACTB
, 5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3 '(F), 5'-AAGCAAATAGAACCTGCAGAG-3' (R).
6. Fluorescente
La hibridación in situ
(FISH)
metafase para untar se prepararon por primera vez como se ha descrito anteriormente y luego FISH se realizó con el siguiente protocolo. Bacteriana RP11-654K19 copia cromosoma artificial (BAC) para
EIF5A2
, BAC RP11-355H10 clon de
MYCN
, y RP11-54A4 clon BAC para
MCL 1
fueron seleccionados para sondas FISH etiquetados con cianina 3 (Cy3), isotiocianato de fluoresceína (FITC), o cianina 5 (Cy5). Las diapositivas fueron counterstained con 4, 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) y las fotografías fueron tomadas con un microscopio Leica DM5000B (Leica Microsystems, Alemania) con un aumento de 1000X. El número de células analizadas varía de 180 a 280 para cada muestra
.
La señal completa del núcleo de la célula se observó se fija en 100%. Las células se agruparon en 3 categorías para el análisis de distribución de la señal: Grupo 1 incluye células con & lt; 30% de la señal, Grupo 2 incluye células con señal de 30 a 60%, y el Grupo 3 incluye células con & gt; 60% de la señal. El grado de la señal se cuantificó usando software MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) para el análisis de la superficie relativa de la señal en la zona del núcleo de la célula. A micronúcleos (MN) se define como cualquier región teñido DAPI menos brillante que el núcleo teñido DAPI y con una superficie de menos de un tercio del núcleo de la célula. Las células con dos o más micronúcleos no se contaron para eliminar artefactos. Las células también se agruparon en base al estado MN: Grupo A incluye células sin MN, Grupo B incluye células con el MN MN pero no contiene la señal, y el grupo C incluye células con MN que contiene la señal-
7.. Inmunofluorescencia
Las células fueron sembradas en cubreobjetos en placas de seis pocillos y se trataron con los diferentes compuestos para los tiempos indicados antes de realizar inmunofluorescencia. Brevemente, las células en cubreobjetos se lavaron 3 x 10 minutos en PBS, se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente, y rehidratada 3 x 10 minutos con PBS. Las células se permeabilizaron y se bloquearon en tampón de KCM (KCl 120 mM, NaCl 20 mM, 10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, 0,1% de Triton X-100, 2% de albúmina de suero bovino y 10% de leche desnatada en polvo) para 6 horas a 4 ° C y se incubaron con (Ser139) anticuerpo anti-fosfo H2AX (JBW301 clon, Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) diluido en tampón KCM (1:500) durante la noche a 4 ° C. Después, las células se lavaron 3 x 10 minutos en PBS, se incubaron con CF555 de cabra anti-IgG de ratón (H + L) (Biotium, Hayward, CA, EE.UU.) diluido en tampón de KCM (1:1000) durante 1,5 horas a temperatura ambiente, y se lavaron de nuevo tres veces 10 minutos cada uno con PBS. DNA se visualizó mediante tinción de contraste de las células con DAPI y se montaron en portaobjetos. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio Leica DM5000B. Para analizar el grado de daño en el ADN dentro de las células, las células se agrupan de acuerdo con sus señales de γ-H2AX independientemente del estado de Minnesota. Las células se agrupan en cinco categorías, incluyendo sin señal, & lt; 30% de señal, señal de 30-60%, & gt; 60% de la señal, y de señal completa por el software MetaMorph. Para la puntuación de MN en células liberadas a partir de compuestos, las células se agrupan en cuatro categorías: Grupo 1 contiene células sin MN, Grupo 2 contiene células con MN y el MN no contiene la señal, Grupo 3 incluye células con MN, Grupo 4 que contiene señal incluye células con 1 o 2 fuertes puntos de señal dentro del núcleo de la célula cerca de la periferia del núcleo.
8. Análisis estadístico
La significación estadística en los datos de modalidades y en tiempo real PCR se analizaron los datos utilizando la prueba t no pareada con la excepción de los datos de DMS UACC-1598-4, que se calcula con el análisis de la varianza (
ANOVA
) seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett posterior. La significación estadística de la señal de FISH, γ-H2AX vs no hay datos de las señales y los datos se analizaron con MN
prueba exacta de Fisher
. Importancia de MTS y la formación de colonias de datos se calculó con
ANOVA
. La significación estadística de la invasión de células se calculó con la
Chi-cuadrado prueba
. La significación estadística de todos los datos se indican como sigue: * denota un
P
valor de 0,01 a 0,05, ** denota un
P
valor de 0,001 a 0,01, y *** indica un
P
valor de. & lt; 0,001
: Resultados de la
1. GEM disminuye el número de DM en la línea celular de cáncer de ovario UACC-1598 y el clon UACC-1598-4
UACC-1598 es una línea celular de cáncer de ovario que consiste en la amplificación de genes en forma de DM. UACC-1598-4 fue creado por el método de dilución en serie mediante la siembra y aislamiento de células individuales de la línea celular de sus padres UACC-1598 y la preparación de la metafase se extiende para determinar el número de DM contiene un clon. Se encontró que este clon para tener un aumento en el número de DM en comparación con la línea celular parental (Figura 1A). Mientras que la línea celular UACC-1598 contenía un promedio de 34.61 DM por célula, UACC-1598-4 tenía un promedio de 76.16 DM por célula, que es más del doble del valor de la línea celular de sus padres. La diferencia entre el número de DM en UACC-1598 y el clon UACC-1598-4 resultaron ser estadísticamente significativa con un
valor de P Red de. & Lt; 0,001
A. imágenes representativas de la metafase propagación de UACC-1598 y células UACC-1598-4. Las flechas indican las MD. El número de DM en cada célula en metafase se contó y se representa. *** Indica
P Hotel & lt; 0,001. diferenciales de B. Metafase se prepararon para las células cultivadas en presencia de concentraciones bajas de o bien HU o GEM durante 1 semana o 2 semanas. Se contó el número de DM en cada célula en metafase. Las líneas rojas representan la media y las líneas negras representan el SEM. * Denota un
P
valor de 0,01 a 0,05 y ** indica un
P
valor de 0,001 a 0,01.
Primero probamos si la diferencia en el número de DM entre UACC-1598 y UACC-1598-4 afecta a la sensibilidad de GEM. Hemos utilizado el método MTS para calcular el IC
50 de GEM en las dos líneas celulares y se encontró que había una diferencia. El IC
50 de GEM fue 310 nM en UACC-1598 y 970 nM en UACC1598-4 (datos muestran ahora), y la diferencia se debe probablemente a un mayor número de modalidades para ser dirigida y eliminado de UACC1598-4. Dado que se seleccionó el clon UACC1598-4 para su generación y el mantenimiento de un gran número de DM, se utilizó por primera vez esta línea celular para determinar si GEM puede causar una pérdida de DM debido a la hipótesis de que podría ser más fácil de detectar una diferencia en el número de DM. Las células se dejaron crecer en medios que contienen 10 nM (0,01 × IC
50) de GEM durante dos semanas antes se prepararon los diferenciales de metafase. Nuestro experimento indicó que la adición de bajas concentraciones de GEM puede disminuir el número de DM en células de cáncer de ovario UACC-1598-4, similar a la adición de HU (Figura S1A). El número medio de DM se redujo de 76.16 a la 25.23 en 150 M de HU. Además, el número medio de DM se redujo a 48.99 en 10 nM de GEM.
A continuación, determinamos si GEM puede disminuir el número de DM en la línea celular UACC-1598 de los padres. Las células se dejaron crecer en medios que contienen 10 nM (0,032 × IC
50) y 20 nM (0,064 × IC
50) de GEM antes se prepararon los diferenciales de metafase. Se encontró que el GEM en 10 nM no fue eficaz en esta línea celular. Tras la incubación de las células UACC-1598 en 20 nM de GEM, se observó una disminución estadísticamente significativa en el número de DM tanto en 1 semana y 2 semanas después de las células se cultivaron de forma continua en medios que contienen GEM (Figura 1B). El número medio de DM disminuyó de 37.00 a la 24.83 después de 1 semana de crecimiento en presencia de GEM, y disminuyó 31,84 a 21,59 después de 2 semanas de crecimiento en GEM. Desde HU se disolvió en DMSO, eliminamos el efecto de DMSO en nuestros experimentos comparando HU células tratadas al DMSO células tratadas. El número medio de DM disminuyó de 29,37 en las células cultivadas en medios que contienen DMSO a 20,77 en las células cultivadas en medios que contienen 150 mM HU durante 2 semanas. También comparamos las células de control a las células tratadas DMSO y se encontró que la diferencia entre los dos no fue estadísticamente significativa (datos no presentados), lo que indica que el DMSO a la concentración se utilizó como el vehículo para HU no afecta significativamente a los resultados experimentales. Además, también se encontró que GEM es eficaz en la disminución de modalidades de otras líneas celulares también (datos no mostrados). Por ello, utilizó HU a una concentración de 150 mM y GEM a una concentración de 20 nM para todos nuestros experimentos siguientes.
2. GEM media la pérdida de genes amplificados DM
EIF5A2
y
MCL 1
Una vez que encontramos que GEM puede disminuir el número de DM en tanto UACC-1598 y UACC-1598- 4, la siguiente pregunta que nos preguntamos es si los genes amplificados en el proyecto de modalidades también están disminuidos. Se sabe que los oncogenes
EIF5A2
y
MYCN ¿Cuáles son dos genes amplificados en UACC-1598 [15], [16], y
MCL 1
también se encontró a amplificar en esta línea celular (datos no publicados). En primer lugar, comprobamos que estos tres genes que analizamos están presentes en DM con experimentos de FISH (Figura 2A). las células cultivadas en HU o joya que después se separa en 3 grupos de acuerdo al nivel de
EIF5A2, MYCN, España y
MCL1
señales (Figura 2B). El grupo 1 incluye células con & lt; 30% de la señal, lo que corresponde a las células con menos señales de
EIF5A2
,
MYCN
, y
MCL 1
, y es un indicador de las células con menor número de DM; grupo 2 incluye células con señal de 30 a 60%; y el grupo 3 incluye células con & gt; 60% de la señal, que es un indicador de las células con más de modalidades. El porcentaje de células en cada grupo se trazó. El porcentaje de células en el Grupo 3, que contiene las células con más de 60 señales%, disminuyó en presencia de cualquiera de HU (de 11% a 6%) o GEM (del 16% al 7%). Además, el porcentaje de células en el Grupo 2 se redujo de 33% a 24% para HU células tratadas y 37% a 25% en las células tratadas GEM. En contraste con la disminución en los porcentajes de células en el Grupo 2 y 3, el porcentaje de células en el Grupo 1 aumentó desde 14 hasta 21% en las células tratadas con HU (de 56% a 70%) o GEM (de 47% a 68% ). El aumento en el porcentaje de células en el grupo 1 en las células tratadas GEM HU o indica células han comenzado a perder sus MD. Además, se han consolidado los grupos 2 y 3 en un grupo grande, y el análisis estadístico demostró que las diferencias observadas entre DMSO y HU o control y células tratadas joya es estadísticamente significativa (Figura 2B). Estos resultados indican que la señal de los genes amplificados
MYCN
,
EIF5A2
, y
MCL 1
de DM en las células UACC-1598 disminuyó en presencia de ambos HU y el IPG . Un resultado similar se observó para el GEM en el análisis de
MYCN
y
EIF5A2 Hoteles en UACC-1598-4 células (Figura S1B).
A. Los genes
EIF5A2
,
MYCN
, y
MCL 1
están presentes en los DM en las células UACC-1598. Metafase propagación de las células UACC-1598 detectó con sonda de ADN para
EIF5A2
,
MYCN
, y
MCL 1.
Para las imágenes superpuestas,
EIF5A2 Opiniones y
MCL1
señales se muestran en rojo, y
MYCN
señal se muestra en verde. Solapado
EIF5A2
/
MYCN
y
MCL 1
/
MYCN
se muestran en amarillo. B. imágenes representativas de
EIF5A2
/
MYCN
y
MCL 1
/
MYCN
señales de FISH en interfase de células UACC-1598 y cómo las células individuales se separados en diferentes grupos.
MYCN
señal se muestra en verde,
EIF5A2
y
MCL 1
ha mostrado en rojo, y la superposición se muestra en amarillo. El porcentaje de células en los grupos 1, 2 y 3 se basa en
EIF5A2
/
MCL 1
/
MYCN
señales de FISH y
. El análisis estadístico mostró las diferencias de las células en el Grupo 1 y el Grupo de 2/3 en comparación con las células de control. * Denota un
P
valor de 0,01 a 0,05 y ** indica un
P
valor de 0,001 a 0,01.
Por otra parte, también confirmamos nuestros resultados la realización de PCR en tiempo real para analizar la amplificación de
EIF5A2, MYCN, España y
MCL 1
en las células cultivadas en presencia de HU o GEM (Figura 3). Vimos una disminución estadísticamente significativa en la amplificación de
EIF5A2
y
MCL1
genes cuando las células fueron cultivadas en presencia de cualquiera de HU o GEM. Para las células tratadas con HU, una disminución en el nivel de amplificación de ADN relativa de 1,151 ± 0,213 a 0,658 ± 0,092 se observó para
EIF5A2
, y una disminución en el nivel de amplificación de 0,860 ± 0,122 a 0,422 ± 0,106 se observó para
MCL 1
. Para las células tratadas con GEM, se observó una disminución en el nivel de amplificación de 0,930 ± 0,094 0,383 ± 0,005 a la de
EIF5A2
, y una disminución en el nivel de amplificación de 1,242 ± 0,343 hasta 0,388 ± 0,048 se observó para
MCL1
. Sin embargo, no se detectó una disminución estadísticamente significativa en la amplificación de
MYCN Hoteles en cualquiera de las células tratadas con HU o GEM. También se adquirieron resultados similares para las células UACC-1598-4, aunque con el cambio oscura de
MCL 1 gratis (Figura S1C).
El nivel de amplificación de genes
EIF5A2
,
MCL 1
, y
MYCN
fue analizado por PCR en tiempo real. El nivel de amplificación de cada gen en las células tratadas compuestos se compara con las células control (DMSO para HU tratada, y Ctrl. Para tratar GEM), y el nivel de amplificación relativa media ± SD se representa gráficamente. * Denota un
P
valor de 0,01 a 0,05 y ** denota un
P
valor de 0,001 a 0,01, *** denota
P
. & Lt; 0,001
3. Atrapamiento de genes amplificados en los DM micronúcleos
Una forma en la que se cree que las MD para ser eliminado de las células es mediante la incorporación en micronúcleos. Con genes amplificados como sondas, se observó algunas células con MN que contiene sondas mientras que otros tienen no MN que contiene las sondas (Figura 4). Se determinó el porcentaje de formación de MN en células tratadas con HU o GEM, y también se observó si estos micronúcleos contenían
EIF5A2, MYCN
y
MCL1
señales (Tabla 1). células tratadas con DMSO vehículo tienen una frecuencia de formación de MN de 13,87 × 10
-2, mientras que las células tratadas con HU tienen una frecuencia de formación de MN de 30,61 × 10
-2, lo que indica HU es eficaz en inducir la formación de MN. Además, GEM también es eficaz en la inducción de la formación de MN. Las células tratadas con 20 nM GEM tienen una frecuencia de formación de MN de 21,82 × 10
-2 comparación con 13,98 × 10 células de control
-2 en. Al examinar
EIF5A2, MYCN, España y
MCL
señales en el MN, también notado un aumento en la frecuencia de MN que contiene
EIF5A2, MYCN, España y
señales MCL
, designado MN (
EIF5A2
+
MYCN
+
MCL +
) o MN (+) para abreviar, para las células en el HU y tratamiento GEM grupos. Se observó un aumento pliegue 2,57 y 1,81 en la frecuencia de MN (+) para HU y GEM células tratadas respectivamente. En conjunto, nuestros resultados de FISH sugieren que los genes amplificados DM
EIF5A2, MYCN, España y
¿Cuáles son MCL perdió a partir de células tratadas con HU o GEM al ser atrapado selectivamente en MN. Se obtuvieron resultados similares con células UACC-1598-4 (Tabla S1).
Los dos paneles de la izquierda son imágenes representativas de las células que muestran MN sin señal y la derecha dos paneles son imágenes representativas de las células que muestran MN con
EIF5A2
/
MYCN
o
MCL 1
MYCN
señal
/.
MYCN
señal se muestra en verde,
EIF5A2
y
¿Cuáles son MCL 1 muestra en rojo, y la superposición se muestra en amarillo. Las flechas indican MN.
4. Bajas concentraciones de GEM causa un daño del ADN en células similares a las bajas concentraciones de HU
Se han encontrado concentraciones bajas de HU para causar daño en el ADN detectable como focos γ-H2AX en células. Determinamos si GEM también puede causar daños en el ADN. Se han tratado las células UACC-1598 con HU o GEM durante 24 horas y se realizó inmunofluorescencia para determinar la cantidad de focos de γ-H2AX en células individuales.