Extracto
hipoxia tumoral con la expresión desregulada de factor de hipoxia inducir (HIF) y su consecuencia biológica conduce a un mal pronóstico de los pacientes diagnosticados con tumores sólidos, lo que resulta en una mayor mortalidad, lo que sugiere que la comprensión de la relación molecular de hipoxia con otras funciones celulares de la agresividad del tumor sería muy valiosa para el desarrollo de nuevos terapia dirigida para tumores sólidos. Emergentes evidencia también sugiere que la hipoxia y HIF vías de señalización contribuye a la adquisición de funciones epiteliales-a-mesenquimal transición (EMT), el mantenimiento de células madre de cáncer (CSC), y también mantiene el ciclo vicioso de inflamación, todo lo cual contribuye a la radiación terapia y resistencia a la quimioterapia. Sin embargo, los mecanismos de aplicación por parte hipoxia /HIF conducir estos eventos no se entienden completamente. Aquí, hemos demostrado que la hipoxia conduce a aumento de la expresión de VEGF, IL-6, y los genes marcadores de CSC como Nanog, Oct4 y EZH2, y también aumentó la expresión de miR-21, un miARN oncogénico, en el cáncer de próstata (CaP) células (PC-3 y LNCaP). El tratamiento de células de CaP con CDF, un nuevo análogo sintético derivado de la curcumina mostró previamente una actividad antitumoral
in vivo
, inhibió las producciones de VEGF e IL-6, y las reguladas la expresión de Nanog, Oct4 , EZH2 ARNm, así como el miR-21 en condiciones de hipoxia. Por otra parte, el tratamiento de células de CaP CDF conducido a la disminución de la migración de células en condiciones hipóxicas. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el efecto antitumoral de la CDF es, en parte, mediada a través de la desregulación de las vías de hipoxia tumoral, y por lo tanto CDF podrían llegar a ser útil para el tratamiento del cáncer
Visto:. Bao B, Ahmad A, Kong D, Ali S, Azmi AS, Li Y, et al. (2012) La hipoxia inducida por agresividad de las células del cáncer de próstata está vinculado con la expresión desregulada de VEGF, IL-6 y miRNAs que son atenuadas por CDF. PLoS ONE 7 (8): e43726. doi: 10.1371 /journal.pone.0043726
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Junio, 2012; Aceptado: 23 de julio de 2012; Publicado: August 27 de, 2012
Copyright: © Bao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores gracias Puschelberg Guido y fundaciones por su generosa contribución financiera. Conceder el apoyo del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 5R01CA131151, 5R01CA132794 y 1R01CA154321 (FHS), y el Departamento de Defensa de exploración de la hipótesis del desarrollo Premio PC101482 (BB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más comúnmente diagnosticado en los hombres y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los EE.UU. [1]. La mayoría de los pacientes con CaP son tratables, pero los pacientes generalmente mueren debido a la resistencia a los medicamentos y la enfermedad metastásica. Por lo tanto, hay una gran necesidad para el desarrollo de nuevas estrategias mediante las cuales resistencia a los medicamentos y la enfermedad metastásica podrían ser controlados con agentes nuevos que pueden mejorar el resultado del tratamiento. La hipoxia es uno de los fenómenos biológicos fundamentales que están estrechamente asociadas con el desarrollo y la agresividad de una variedad de tumores sólidos, incluyendo CaP. factores inducibles por hipoxia (HIF) funcionan como un factor de transcripción principal, que regula la hipoxia genes de respuesta y han sido reconocidos a jugar un papel crítico en la invasión tumoral, resistencia a la quimio-radiación, y el aumento de la proliferación celular, la supervivencia, la angiogénesis y la metástasis [2]; [3]. Por lo tanto, la hipoxia tumoral con la expresión desregulada de HIF y su consecuencia biológica conduce a un mal pronóstico de los pacientes diagnosticados con tumores sólidos, lo que resulta en una mayor mortalidad, lo que sugiere que la comprensión de la relación molecular de la hipoxia con otras características celulares de la agresividad del tumor sería muy valiosa para el desarrollo de nueva terapia dirigida para tumores sólidos.
ha sido bien reconocido que las células madre del cáncer (CSC) y epitelial a mesenquimal transición (EMT) células fenotípicos se asocian con la resistencia terapéutica y contribuye al crecimiento del tumor agresivo, invasión y la metástasis, y se cree que son la causa de la recurrencia del tumor [4]. Nuevas pruebas sugieren que la hipoxia y la vía HIF mejorar los fenotipos y funciones de las células madre cancerosas y EMT [5] - [9], lo que contribuye a la agresividad del tumor, lo que también podría ser debido a la desregulación de microRNAs (miRNAs). Los miRNAs se sabe que juegan papeles críticos en una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo la diferenciación celular, la proliferación, la muerte celular, el metabolismo y la homeostasis de la energía [10]; [11]. La acumulación de pruebas ha sugerido que miRNAs podrían tener un papel importante en el desarrollo y progresión de tumores. La expresión alterada de miRNAs se ha asociado con el pronóstico clínico de tumor, resistencia a la quimio-radioterapia, y la recurrencia del tumor [12] - [14]. Un gran número de miRNAs se han notificado a ser sensible a la hipoxia y la vía de HIF en una amplia gama de células y tejidos, incluyendo células del cáncer [15] - [18]. Se ha informado de que las causas de la hipoxia disminución de la expresión de miR-101, un potencial anti-oncogénica miARN, y aumento de la expresión de miR-21 y miR-210, miRNAs oncogénica en diversos tipos de cáncer incluyendo CaP [13]; [19]. De este modo, la desregulación hipoxia mediada por miRNAs pueden desempeñar un papel importante en la agresividad del tumor mediada a través de la regulación de las vías de señalización celular que incluyen la vía HIF. Por lo tanto, la orientación de estos miRNAs hipoxia mediada utilizando nuevos agentes puede proporcionar estrategia terapéutica innovadora para la prevención y /o tratamiento de CaP.
A continuación, hemos examinado los efectos de la hipoxia en la migración celular, invasión, la angiogénesis y la expresión de VEGF, IL-6, los genes de CSC, y miR-21 y miR-210 en células de CaP en condiciones de hipoxia. También se investigó el papel de miR-21 en la regulación de la expresión de VEGF, IL-6, genes marcadores de CSC, y su asociación con la formación de prostaspheres en células de CaP en condiciones de hipoxia. Además, se examinaron los efectos de un nuevo análogo sintético curcumina derivados (CDF) que mostró que la actividad anti-tumor con una mayor biodisponibilidad tejido sistémico y de destino, en la supervivencia celular, la migración, la invasión, la angiogénesis, la formación de prostaspheres, y la expresión de HIF-1α, VEGF, IL-6, CSC genes marcadores, y miRNAs en células de CaP en condiciones de hipoxia. Se encontró que la hipoxia condujo a un aumento de expresión de VEGF, IL-6, y los genes marcadores de CSC como Nanog, Oct4 y EZH2, y también aumentó la expresión de miR-21 en células de CaP humanos. El tratamiento de células con CDF inhibe las producciones de VEGF e IL-6, y el regulado de la expresión de Nanog, Oct4 y EZH2 mRNAs, así como miR-21 en estas células bajo condiciones hipóxicas. CDF también disminuyó la migración celular de células de CaP en condiciones hipóxicas. A partir de estos resultados, se concluye que el efecto antitumoral de CDF está parcialmente mediada a través de la desregulación de las vías de señalización de hipoxia tumoral.
Materiales y Métodos
cultivo celular, medicamentos y reactivos
líneas celulares de cáncer de próstata humano células PC-3 y LNCaP fueron mantenidos bajo condiciones de cultivo estándar (21% O
2 y 5% de CO
2, 37 ° C). Hipóxico (1% O
2) y 5% de CO
2 condiciones se generaron mediante el control de las velocidades de flujo de entrada de nitrógeno y dióxido de carbono, respectivamente, en la incubadora de cultivo. Todas las líneas celulares se mantuvieron en 10% de medio FBS-RPMI-1640 en condiciones de cultivo celular estándar. CDF se sintetizó como se describe en nuestras publicaciones anteriores [20]; [21].
Ensayo de Supervivencia Celular
Con el fin de investigar el efecto de la FCD sobre la supervivencia celular en células de CaP humanos bajo condiciones hipóxicas, ensayo MTT se realizó utilizando humana CaP (PC-3 y LNCaP) células. 3000 células se sembraron en cada pocillo de las placas de 96 pocillos y se incubaron a condiciones de cultivo estándar (21% O
2 y 5% de CO
2) durante la noche. Las células se trataron entonces con diferentes concentraciones de CDF (0,5 M) y se incubaron durante 8 h bajo condiciones hipóxicas, seguido de 16 h en condiciones de normoxia cada día. Después de 3 días de tratamiento, las células se recogieron para el ensayo MTT estándar, como se describe en nuestras publicaciones anteriores [22]; [23]. Cada experimento se llevó a cabo en cuatro repeticiones y repite dos veces de forma independiente.
clonogénico Ensayo
ensayo clonogénico se realizó para examinar el efecto de la CDF sobre el crecimiento celular de células de CaP bajo condiciones de hipoxia, como se describe anteriormente [ ,,,0],22]. Brevemente, 5 × 10
4 Las células se sembraron en una placa de seis pocillos y después de 3 días de la exposición a 0,5 M de CDF (8 h de la condición hipóxica y 16 h de la condición de normoxia cada día), las células se tripsinizaron, y 1.000 células viables individuales se sembraron en 100 mm placas de Petri. Las células se incubaron durante 10 a 12 días a 37 ° C en un 5% de CO
2/5% de O
2/90% N
2 incubadora. Las colonias se tiñeron con 2% de cristal violeta, se lavaron con agua, y se contaron. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió dos veces de forma independiente.
Invasión Ensayo
El
in vitro
ensayo de invasión de células de CaP se llevó a cabo bajo condiciones de hipoxia mediante el uso de Costar Transwell 24 -Bueno placas con membrana de policarbonato (Corning Incorporated, Corning, NY), como se describe anteriormente [23]. Brevemente, 4 × 10
4 de las células cancerosas (PC-3 y LNCaP) expuestos a 3 días de incubación en condiciones de normoxia o condición hipóxica se sembraron en cada pocillo de las placas Transwell pre-recubiertos con Matrigel. Los pocillos de fondo del sistema se llenaron con medio completo. Después de 20 h de incubación, ya sea en ausencia o presencia de CDF (0,5 M), las células de cáncer invadidas se tiñeron con 4 mg /ml de calceína-AM (Invitrogen) en una solución de PBS a 37 ° C durante 1 h, siguiendo el fabricante de manual. Las fotografías fueron tomadas usando un microscopio de fluorescencia. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió dos veces de forma independiente.
Curación de Heridas Ensayo
Con el fin de examinar el efecto de la FCD sobre la migración celular de las células de CaP bajo condiciones de hipoxia, se realizó el ensayo de curación herida , como se describe anteriormente [24]. En pocas palabras, cuando las células PC-3 se convirtió en el 90-95% de confluencia, la herida fue generado por el rascado de la superficie de las placas con una punta de pipeta. Las células fueron incubadas en ausencia y presencia de CDF (0,5 M) y se cultivaron bajo condiciones hipóxicas durante 4 h, seguido de 16 h de las condiciones de normoxia, y después se fotografiaron con un microscopio Nikon Eclipse TS100, como se describe anteriormente [23] . Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió dos veces de forma independiente.
Tubo de ensayo de formación de
Con el fin de examinar el efecto de la FCD sobre la angiogénesis
in vitro
en las células endoteliales vasculares bajo condición hipóxica, se realizó ensayo de formación de tubo, como se describe anteriormente [25]; [26]. Brevemente, 3 × 10
4 conejo células endoteliales vasculares se sembraron en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de pre-recubiertos con Matrigel en 100 l de medio FBS-DMEM 10%, y se expusieron a condiciones de normoxia o hipoxia durante 4 h de incubación a 37 ° C, seguido de 16 horas de las condiciones de normoxia. La fotografía fue tomada a las 4 h y 20 h, respectivamente. Cada experimento se repitió dos veces de forma independiente.
Expresión de VEGF y de IL-6
ELISA se llevó a cabo para examinar el efecto de CDF en la expresión inducida por hipoxia del VEGF e IL-6 en células de CaP. Los medios de cultivo de células de CaP bajo condiciones hipóxicas o normóxicas durante 16 h se recogieron para la medición de VEGF e IL-6 mediante el uso de kits de ensayo de ELISA (R & amp; D Systems), siguiendo el manual del fabricante. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió dos veces de forma independiente.
Formación Esfera Ensayo
El ensayo de formación de esferas se realizó para examinar el efecto de la CDF en la capacidad de auto-renovación de células de CaP CSC bajo condiciones de hipoxia, como se ha descrito anteriormente [23]. Brevemente, suspensiones de células individuales de células de CaP se sembraron en pocillos de adherentes ultra baja de una placa de 6 pocillos (Corning, Lowell, MA) a 1.000 células /pocillo en medio de formación de esferas (01:01 medio DMEM /F12 suplementado con B-27 y N-2 (Invitrogen), y se expusieron a condiciones hipóxicas cada dos días. Después de 7 días, las esferas denominado como "prostaspheres" se recogieron por centrifugación (300 xg durante 5 min), y se contaron. La proporción de generador de esfera las células se calculó dividiendo el número de prostaspheres por el número de células sembradas con el diámetro mayor de 50 μmeters. Cada experimento se realizó en tres repeticiones y repite dos veces de forma independiente.
inmunotinción de ensayo y microscopía confocal
suspensiones de células individuales de células de CaP se sembraron en pocillos de adherentes ultra bajo de la placa de 6 pocillos (Corning, Lowell, MA) a 10.000 células /pocillo en medio esfera-formación, y se incubaron durante 24 h seguido de cultivo en condiciones de hipoxia cada otro día, como se describió anteriormente. Después de 7 días de tratamiento con fármacos, 3 pocillos de las prostaspheres en cada grupo de tratamiento se agruparon y se recogió por centrifugación (300 xg durante 5 min), se lavó con 1 x PBS, y se fija con 3,7% paraformaldehído durante 10 min a temperatura ambiente. Monoclonal CD44 y anticuerpos EpCAM (Señalización Celular) se utilizaron para la inmunotinción de ensayo, siguiendo el protocolo del fabricante, tal como se describe anteriormente [24]; [27]. Los prostaspheres CD44 o EpCAM marcadas se fotografiaron bajo una Nikon E800 ESLIPSE con aumento de 100X. La microscopía confocal (Leica TCS SP5) se llevó a cabo en las instalaciones de MIRL Core, Escuela de Medicina de la Universidad del Estado de Wayne. Cada experimento se repitió dos veces de forma independiente.
transitoria y transfección estable de células de CaP con ADNc y miRNAs
Las transfecciones de ADNc y miRNAs se llevaron a cabo mediante el uso de ExGen 500 reactivo de transfección (Fermentas, Alemania) y DharmaFECT reactivo de transfección (Dharmacon), respectivamente, los manuales de los fabricantes siguientes, tal como se describe anteriormente [24]. La transfección estable de ADNc se llevó a cabo bajo la selección de medio que contenía G418 (Sigma) y se verificó mediante análisis de transferencia Western, como se describe anteriormente [25]. Cada experimento se repitió dos veces de forma independiente.
extracción de proteínas y Western Blot análisis
Western blot se llevó a cabo para medir los niveles relativos de la proteína HIF-1α en células de CaP en condiciones de hipoxia. Total de lisados celulares de las células expuestas a 16 h de la condición hipóxica se obtuvieron lisando las células en tampón de lisis de proteína que contiene 50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,1% de SDS, desoxicolato de sodio 0,5%, 2 fluoruro de sodio mM, Na 2 mM
3VO4
2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, y 1 × inhibidor de la proteasa cóctel (Roche Diagnostics, Alemania), y Western Blot se realizó según lo descrito anteriormente [24], y la intensidad de la señal se midió usando el sistema de detección quimioluminiscente (Pierce Rockford, IL). Cada experimento se repitió dos veces de forma independiente.
en tiempo real (RT) de la transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para medir la expresión de ARNm y miRNAs
Para determinar la expresión del ARNm, dos microgramos del total de los ARN extraídos de cada muestra se utilizaron para la reacción de RT en 20 l de volumen de reacción usando un sistema de transcripción inversa (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. kit SYBR verde ensayo (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) se utilizó para la reacción de PCR en tiempo real, utilizando StepOnePlus System AB Real-Time PCR (Applied Biosystems), siguiendo el protocolo del fabricante. Las secuencias de cebadores de PCR se describieron anteriormente [23]. Los datos se analizaron usando C
método t y se normalizaron por la expresión de GAPDH en cada muestra. Para determinar la expresión de miRNAs en las células, se utilizó el kit TaqMan MicroARN ensayo (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo del fabricante. El ARN total se extrajo de las células y 5 ng de ARN se transcribió de forma inversa como se describió anteriormente [28]. Los cebadores se obtuvieron de miARN Systems AB. En tiempo real las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un volumen total de mezcla de reacción 10 l tal como se describe anteriormente [24], utilizando el Sistema de StepOnePlus en tiempo real PCR (AB Systems). Los datos fueron analizados utilizando C
método de T y se normalizaron por la expresión RNU48 en cada muestra. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió dos veces de forma independiente.
informador de luciferasa Ensayo del gen
Con el fin de examinar el efecto de CDF o deficiencia de miR-21 en la actividad de unión de miR-21 a 3 ' -UTR en células de CaP bajo condiciones de hipoxia, se realizó ensayo de gen indicador de luciferasa mediada por el miR-21 en las células PC-3 mediante el uso de vectores gen indicador de luciferasa mediada por el miR-21 (Signosis, Sunnyvale, CA), en la que el miR-21 vinculante a su sitio de unión de ADN en el vector gen de la luciferasa suprime la actividad de luciferasa. Brevemente, 10
4 células PC-3 se sembraron en cada pocillo de las placas de 96 pocillos, y se incubaron durante la noche a la condición de cultivo estándar. Las células fueron luego transfectadas con suprimido-miR-21 vector del gen indicador de luciferasa (Signosis, Sunnyvale, CA) mediante el uso de ExGen 500 reactivo de transfección (Fermentas, Alemania) o co-transfectadas con el vector de luciferasa y anti-miR-21 mediante el uso de DharmaFECT reactivo de transfección (Dharmacon) siguiendo el protocolo del fabricante, como se describió anteriormente. Después de toda la noche de la transfección, los transfectantes fueron tratados con CDF por otros 20 h bajo condiciones de cultivo estándar, y se expusieron a 4 h de la condición hipóxica. Por último, los transfectantes se recogieron para el ensayo de la actividad de luciferasa mediante el uso de sistema de ensayo de luciferasa (Promega), siguiendo el manual del fabricante. Cada experimento se repitió dos veces de forma independiente.
Métodos Estadísticos
Las comparaciones de los resultados del tratamiento fueron probados por diferencia significativa por el emparejado
t
prueba. La significación estadística se supuso en un
valor de P Red de menos de 0,05.
Resultados
Efecto de la CDF de la célula de supervivencia y clonogenicidad de células de CaP en condiciones hipóxicas Condición
Los datos de ensayo de MTT indican que CDF supervivencia notablemente inhibido celular de las células LNCaP PC-3 y bajo condiciones de hipoxia en un dependiente de la dosis de forma (Figura 1A). tratamiento CDF también disminuyó clonogenicidad de las células LNCaP PC-3 y bajo condiciones hipóxicas (Figura 1B). Estos hallazgo sugiere que CDF podría inhibir la supervivencia celular y el crecimiento clonogénico de células de CaP en condiciones de hipoxia.
Los paneles A, B, y C representan los datos de la supervivencia celular, clonogenicidad, y análisis de transferencia Western, respectivamente. Las barras en las cifras indican la desviación estándar de n = 4.
Efecto de la FCD sobre la proteína HIF-1α y las producciones de VEGF e IL-6 en células de CaP en condiciones hipóxicas Condición
Como se muestra en la Figura 1C, el tratamiento CDF disminuyó el nivel relativo de HIF-1α en las células LNCaP PC-3 y bajo condiciones hipóxicas. Las células incubadas en condiciones hipóxicas condujeron a un aumento de la producción de VEGF, en comparación con las células incubadas bajo condiciones de normoxia (Figura 2). tratamiento CDF disminuyó notablemente la producción de VEGF inducida por hipoxia en células de CaP (Figura 2). HIF-1α mostraron aumento de sobre-expresión de las células PC-3 la producción de VEGF en condiciones de hipoxia, en comparación con sus padres células PC-3. tratamiento CDF también inhibió la producción de VEGF inducida por hipoxia en HIF-1α sobre-expresión de las células PC-3. Estos resultados sugieren que las células cultivadas en condiciones hipóxicas conduce a una mayor producción de IL-6, en comparación con las células incubadas bajo condiciones de normoxia (Figura 2). tratamiento CDF disminuyó notablemente la producción de la hipoxia inducida por IL-6 en células de CaP (Figura 2). CDF también disminuyó la producción de IL-6 inducida por hipoxia HIF-1α en la sobre-expresión de las células PC-3 (Figura 2).
Los medios condicionados se recogieron a partir de células cultivadas en condiciones normoxic hipóxica y como se describe en los métodos sección. Las mediciones de VEGF e IL-6 se llevaron a cabo por ELISA. Las barras en las cifras indican la desviación estándar de n = 3.
Efecto de la CDF en Angiogénesis
in vitro Hoteles en las células endoteliales vasculares en condiciones hipóxicas Condición
Nuestros resultados indican que las condiciones hipóxicas aumentaron la capacidad de formación de tubos de células endoteliales vasculares a las 4 h y 20 h de incubaciones, respectivamente, en comparación con condiciones de normoxia. tratamiento CDF inhibió la formación de tubos inducida por hipoxia en las células endoteliales vasculares (Figura 3A). Para aclarar si o no mediadas por moléculas CDF o CDF en sí contribuye a la inhibición de la formación del tubo, se recogieron los no-CDF-tratada (control) y CDF-tratada medios de condición a partir de células cancerosas y llevó a cabo el ensayo de formación de tubo bajo condiciones de normoxia. Se encontró que las células endoteliales vasculares incubadas con condición de control de los medios de comunicación ha aumentado la formación de tubos en 4 h y 20 h, en comparación con las células incubadas con la condición de medios de comunicación pre-tratada CDF. La adición de CDF a los medios de control de condición inhibió significativamente la formación de tubos, en comparación con las células incubadas en los medios de comunicación de condición de control y estado del soporte de CDF-pre-tratado (Figura 3B). Estos datos sugieren que la propia CDF contribuye a la inhibición de la formación de tubos
Los paneles A & amp;. B, C & amp; D, y E representan los datos de la angiogénesis
in vitro
, la migración celular, y invasión. Según se describe en la sección Métodos, angiogénesis
in vitro
se evaluó por el ensayo de formación de tubo; la migración celular se evaluó mediante el ensayo de la cicatrización de heridas; invasión se evaluó mediante un ensayo de invasión de cámara.
Efecto de la FCD sobre la migración celular y la invasión
in vitro en células de CaP
bajo condiciones hipóxicas Condición
PC- expuestos al Hipoxia 3 células habían aumentado la capacidad de curación de las heridas, en comparación con las células cultivadas en normoxia (Figura 3C). tratamiento CDF inhibe la capacidad de las células de CaP bajo condiciones hipóxicas (Figura 3C y D) de curación de heridas. Como se muestra en la figura 3D, la sobre expresión de HIF-1α aumentado la capacidad de las células PC-3 expuestos a 16 h de la condición hipóxica de curación de heridas. tratamiento CDF inhibe la capacidad de curación de heridas tanto en las células HIF-1a-sobre-expresión de PC-3 bajo condiciones hipóxicas (Figura 3D). Estos resultados proporcionaron datos convincentes que muestran que la FCD podría inhibir la migración celular inducida por la hipoxia de las células de CaP, incluso en células de CaP HIF-1a-sobre-expresa. El
in vitro
ensayo de invasión en la muestra que tanto las células PC-3 y LNCaP expuestas a condiciones hipóxicas habían aumentado la capacidad de invasión, en comparación con las células expuestas a condiciones de normoxia (Figura 3E). CDF tratamiento inhibe la capacidad de invasión de hipoxia inducida de células de CaP.
Efecto de la FCD sobre la expresión génica de CSC marcadores y genes miARN expresión en células de CaP en condiciones hipóxicas Condición
Los datos de tiempo real ensayo de RT-PCR indican que la hipoxia inducida los niveles relativos de Nanog, Oct4 y EZH2 mRNAs así como miR-21 y miR-210 en células PC-3 y LNCaP mientras CDF disminuyó los niveles de Nanog, Oct4 y EZH2 mRNAs, así como miR-21 y miR-210 en células de CaP bajo condiciones de hipoxia (Figura 4).
en tiempo real RT-PCR se llevó a cabo como se describe en la sección Métodos. Las barras en las cifras indican la desviación estándar de n = 3.
Efecto de la CDF o anti-miR-21 en CSC capacidad de auto-renovación y marcadores de superficie celular CD44 y EpCAM en células de CaP humano bajo condiciones hipóxicas condición
los datos del ensayo de formación de esfera indican que el anti-miR-21 se redujo la formación de prostaspheres de células PC-3 (Figura 5A). Estos datos sugieren que el miR-21 puede jugar un papel importante en la regulación de la capacidad de auto-renovación de células de CaP CSC-como. tratamiento CDF también decesased la formación de prostaspheres de células de CaP en condiciones de hipoxia (Figura 5A). Por otra parte, se realizó la microscopía confocal de formación de imágenes para la evaluación de la expresión de CD44 y EpCAM en las células de formación de esferas de células PC-3. Los resultados muestran que el anti-miR-21 disminuyó la expresión de CD44 y EpCAM en las células de formación de esferas bajo condiciones de hipoxia, en consonancia con el tratamiento CDF (Figura 5B) 3 PC. Estos datos sugieren que CDF disminuyó la formación de prostaspheres y la expresión de CD44 y EpCAM en parte mediada por la orientación de la expresión de miR-21.
Los paneles A y B representan los datos de la formación de prostaspheres, las expresión de CD44 y EpCAM, y la producción de VEGF y de IL-6 en las células de formación de esferas CSC-como de células de CaP, respectivamente. El ensayo de formación de esferas se realizó para examinar la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas de células de CaP como se describe en la sección Métodos. La microscopía confocal se llevó a cabo para medir la expresión de marcadores de superficie CD44 CSC y EpCAM en las células de formación de esferas derivadas de células de CaP como se describe en la sección Métodos. Las barras en las cifras indican la desviación estándar de n = 3.
Efecto de la CDF o anti-miR-21 en el VEGF e IL-6 La producción en las células de formación de esferas de células PC-3 Bajo hipóxica condición
Hemos examinado el efecto de la CDF de VEGF e IL-6 producciones en las células de formación de esferas de células PC-3 bajo condiciones de hipoxia mediante ensayo ELISA. Encontramos que las células de formación de esferas de PC-3 producen una cantidad mayor de VEGF en condiciones de hipoxia, en comparación con sus células PC-3 parentales (3172 pg /ml /10
4 PC-3 células de formación de esferas vs 3.192 pg /mL /10
6 células PC-3; Figura 2 y 5C), lo que sugiere que las células de formación de esferas PC-3 pueden promover la angiogénesis por hasta la regulación de la expresión de la producción de VEGF. También se encontró que el tratamiento CDF disminución de la producción de VEGF inducida por hipoxia en PC-3 células de formación de esferas, en consonancia con los resultados de las células PC-3 de formación de esferas con la inhibición condicionada de miR-21. Además, hemos encontrado que al igual que la producción de VEGF, las células de formación de esferas produjo una notable cantidad más alta de la hipoxia inducida por IL-6, en comparación con sus células parentales (129,3 pg /ml /10
4 PC-3 de formación de esferas células vs 457,6 pg /ml /10
6 PC-3 células; Figura 2 y 5C). tratamiento CDF o deficiencia condicional de miR-21 por su inhibidor /siRNA disminuyeron la producción de la hipoxia inducida por IL-6 por las células de formación de esferas (Figura 5C). También se examinó si el tratamiento CDF o deficiencia de miR-21 podrían regular la expresión del gen de HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, los marcadores EpCAM y EMT en células PC-3 de formación de esferas bajo condiciones hipóxicas. Se encontró que la supresión condicional de miR-21 dio como resultado una disminución significativa en los niveles de ARNm relativos de HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, los marcadores de EpCAM, y mesenquimales del fenotipo EMT como ZEB1, vimentina, y Twist, y el aumento de los niveles de ARNm relativos de epitelio marcador de e-cadherina en células PC-3 de formación de esferas en condiciones de hipoxia (datos no mostrados). Del mismo modo, CDF disminuyó los niveles de ARNm de HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, y marcadores mesenquimales ZEB1, ZEB2, vimentina y retuerza en células PC-3 de formación de esferas bajo condiciones hipóxicas. Sin embargo, CDF también disminuyó la expresión de genes de E-cadherina en las células de formación de esferas de PC-3 bajo condiciones hipóxicas (datos no mostrados).
Efecto de la CDF de la expresión de miRNAs en PC-3 de formación de esferas las células en condiciones hipóxicas condición
Hemos examinado el efecto de la CDF de let-7, miR-21, miR-101 y miR-210 en células PC-3 de formación de esferas en condiciones hipóxicas. Los resultados mostraron que el CDF aumentó los niveles relativos de miARN let-7c, d, y miR-101 y la disminución del nivel relativo de miR-210 en células PC-3 de formación de esferas en condiciones de hipoxia (Figura 6A). Estos datos sugieren que la FCD podría desregular la expresión de miRNAs hipoxia asociada en las células CSC-como de células de CaP.
Los paneles A y B representan los datos de miRNAs en las células de formación de esferas de CSC-como derivados de las células humanas y de colaboración y actividades de luciferasa en células de CaP, respectivamente. La transfección mediada de miR-21 vector de luciferasa gen reportero y anti-miR-21 se llevaron a cabo en células PC-3, como se describe en detalle en la sección Métodos. La actividad de luciferasa se midió utilizando kit de sistema de ensayo de luciferasa de Promega, siguiendo el manual del fabricante. Las barras en las cifras indican la desviación estándar de n = 3.
Efecto del tratamiento CDF o miR-21 Deficiencia de miR-21 la actividad de unión a la 3'-UTR en células de CaP en condiciones hipóxicas Condición según la evaluación por ensayo de luciferasa
Hemos examinado el efecto del tratamiento CDF o deficiencia de miR-21 en la actividad de unión de miR-21 al 3'-UTR en células de CaP en condiciones hipóxicas usando el ensayo de gen indicador de luciferasa mediada por el miR-21. Como se muestra en la Figura 6B, se encontró que la hipoxia redujo la actividad de luciferasa en las células PC-3 transfectadas con el vector de luciferasa mediada por miR-21, en comparación con las mismas células bajo condiciones de normoxia, lo que sugiere que la hipoxia incrementa la actividad de unión de miR-21, que conduce a la disminución de la actividad de luciferasa. Anti-miR-21 aumentó la actividad de luciferasa en las células PC-3 bajo condiciones de hipoxia, en comparación con las mismas células sin tratamiento, lo que sugiere que el anti-miR-21 disminución de la unión del ADN miR-21, lo que lleva a un aumento en la actividad de luciferasa en PC-3 células bajo condiciones hipóxicas. Del mismo modo, el tratamiento CDF mostraron aumento de la actividad de luciferasa en células PC-3 en condiciones de hipoxia en una forma dependiente de la dosis, lo que sugiere que CDF podría inhibir el ADN miR-21 de unión en las células PC-3.
Discusión
Una serie de estudios epidemiológicos y clínicos han demostrado que la hipoxia y vías de señalización inducida por hipoxia se asocia con un mal pronóstico de los pacientes diagnosticados con tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata (CaP). Nuevas pruebas también sugieren que la hipoxia aumenta la migración celular, la invasión y la angiogénesis, dando lugar a fenotipos agresivos tumorales. Aquí, confirmamos que la hipoxia induce la migración celular, la invasión y la angiogénesis, y el aumento de la producción de VEGF en células de CaP. También se observó que la hipoxia induce la formación de prostaspheres en células de CaP, en consonancia con el aumento de expresión de genes marcadores de CSC como Nanog, Oct4, EZH2, CD44, y EpCAM en células de CaP. Se ha demostrado que la hipoxia juega un papel clave en la regulación de las características de CSC a través de proteínas HIF, y HIF genes diana aguas abajo tales Oct4 y Notch-1 [6]; [7]. Estos hallazgos sugieren que la hipoxia puede jugar un papel clave en la regulación de las características de CSC, lo que lleva a fenotipo agresivo tumor.
Nuevas evidencias sugieren que los miRNAs juegan un papel crítico en el desarrollo y progresión de tumores mediante la regulación de la degradación del ARNm o la traducción de proteínas mediada a través de su unión a la región no traducida 3 '(3'-UTR) de los genes diana. Se ha documentado que el miR-21 se considera una molécula de pro-oncogénica, que promueven la tumorigénesis. [21].