Extracto
Antecedentes
El hecho de que los receptores de la apoptosis relacionada con el TNF-ligando inductor (TRAIL) se expresan casi invariablemente en el cáncer colorrectal (CCR) representa el fundamento para el empleo de TRAIL-receptores dirigidas a compuestos para la terapia de pacientes afectados por este tumor. Sin embargo, los primeros informes sobre el uso de estos agentes bioactivos proporcionado resultados decepcionantes. Por lo tanto, la hipótesis de que la pérdida de la unida a la membrana de TRAIL-R puede ser una característica de algunos CRC y que la evaluación de la tinción de membrana en lugar de la de la expresión general de TRAIL-R podríamos predecir la respuesta a TRAIL-R de orientación compuestos en este tumor .
Objetivo y Métodos
por lo tanto, se evaluó el patrón de inmunofluorescencia de TRAIL-receptores y e-cadherina para evaluar la fracción de TRAIL-receptores unidos a la membrana en 231 pacientes seleccionados con el principio de su carrera CRC someterse único tratamiento quirúrgico. Por otra parte, hemos investigado si la tinción de membrana de TRAIL-receptores, así como la presencia de mutaciones de KRAS o de inestabilidad de microsatélites (MSI) tuvieron un efecto sobre la supervivencia y por lo tanto un efecto pronóstico.
Resultados
como era de esperar, casi todas las muestras de CRC tiñeron positivas para TRAIL-R1 y 2. en su lugar, la tinción de membrana para estos receptores fue positivo en sólo el 71% y el 16% de las muestras, respectivamente. No hay correlación entre el estado de la mutación KRAS o MSI-fenotipo y el pronóstico podría ser detectado. intensidad de la tinción TRAIL-R1 correlaciona con la supervivencia en el análisis univariado, pero sólo tinción membranosa de TRAIL-R1 y TRAIL-R2 en las membranas celulares fue un predictor independiente de análisis multivariante de supervivencia (cox: TRAIL-R1: p = 0,019; RR 2,06 [1,12 -3,77]; TRAIL-R2:. p = 0,033, RR 3,63 [1,11 a 11,84])
Conclusiones
a diferencia de los supuestos actuales, la pérdida de la tinción de la membrana de TRAIL-receptores es una característica común de CRC etapa temprana, que reemplaza a la importancia pronóstica de la intensidad de la tinción. La imposibilidad de lograr efectos terapéuticos en ensayos clínicos recientes que utilizan receptores TRAIL-dirigidos compuestos podrían deberse a la selección insuficiente de pacientes que tienen tumores con receptores TRAIL-membrana
Visto:. Kriegl L, Jung A, D Horst, Rizzani A, Jackstädt R, Hermeking H, et al. (2012) La inestabilidad de microsatélites, KRAS mutaciones y distribución celular de TRAIL-receptores en la etapa temprana del cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (12): e51654. doi: 10.1371 /journal.pone.0051654
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de febrero, 2012; Aceptado: 5 Noviembre 2012; Publicado: December 20, 2012
Derechos de Autor © 2012 Kriegl et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) con la DFG conceder a 605 /2-1 de EDT y por el Else Kröner-Fresenius Stiftung con la subvención 2011_A226 de EDT. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma colorrectal (CCR) es una enfermedad común que representa más de 1 millón de casos de tumores en todo el mundo y que representa la cuarta causa relacionada con el tumor de la muerte. Por desgracia, mientras que los tratamientos quirúrgicos curativos son factibles en pacientes con tumores en fase inicial, el pronóstico de los pacientes con enfermedad avanzada sigue siendo decepcionante [1].
En los últimos años, los avances en la comprensión de la biología del CRC tienen dado lugar a la creación de varias terapias basadas en mecanismos. Tras el reconocimiento de, por ejemplo el papel de EGF-R y VEGF-R en la proliferación y la angiogénesis, varios compuestos como cetuximab, panitumumab o bevacizumab han sido objeto de investigación clínica y se mostró a afectar positivamente a la supervivencia de los pacientes [2] - [4]. Se espera que un inventario completo de la contribución dada por vías de señalización individuales a la carcinogénesis permitirá el empleo de terapias adaptadas a un número limitado de dianas moleculares individuales.
Otro ejemplo reciente de una terapia basada en mecanismo está representado por el desarrollo de compuestos dirigidos a la "muerte-receptores" TRAIL-R1 y TRAIL-R2 para inducir selectivamente la apoptosis en las células cancerosas [5]. El desarrollo de estos agentes se basa en la lógica proporcionada por estudios que muestran que la anulación de TRAIL o el bloqueo de los receptores TRAIL-conduce a la formación de tumores y metástasis mejorada
in vivo
[6] y que la pérdida de los receptores TRAIL expresión en tejidos de cáncer humano se correlaciona con mal pronóstico y la recurrencia del tumor (revisado por Walczak y colegas [7]). En este sentido, recientemente hemos podido demostrar que la tinción de la membrana de TRAIL-receptores determina el pronóstico de los pacientes afectados por carcinoma hepatocelular [8], y que la expresión de la OPG receptor señuelo soluble de unión a TRAIL-se correlaciona con el estadio del tumor y la formación de metástasis en pacientes afectados por carcinoma de colon [9]. En las presentes varios receptores TRAIL-dirigidos compuestos todavía están bajo investigación clínica en diferentes entidades tumorales [5], [7].
estudios retrospectivos previos que muestran una tinción casi invariable para TRAIL-receptores en muestras de cáncer colorrectal representan el fundamento para el empleo de los receptores TRAIL-agentes de la orientación en el tratamiento de este tumor. Sin embargo Inesperadamente, la evaluación cuantitativa de los receptores TRAIL-intensidad de la tinción se asoció con diferentes resultados de pronóstico en estos estudios [10] - [13]. Además, los primeros informes sobre ensayos clínicos de fase temprana con TRAIL-receptores destinados a compuestos en los CRC mostraron resultados decepcionantes, lo que provocó una mayor investigación sobre un posible papel de los receptores de TRAIL como diana terapéutica en este tipo de tumor.
Para hacer frente a este problema que investigó una cohorte de pacientes con cáncer de colon en estadio temprano, sin metástasis ganglionar o distante de someterse a ningún otro tratamiento que la cirugía, y se clasifican las muestras tumorales de acuerdo a la presencia o ausencia de TRAIL-receptores en la superficie de las células tumorales, como alternativa a la única evaluación semicuantitativa de TRAIL-receptores tinción empleada en estudios previos. Se encontró que los cánceres colorrectales muestran un patrón de expresión heterogénea de receptor-1 TRAIL y -2 con respecto a su aparición membranosa. Las diferencias en la expresión de TRAIL-receptores en diferentes compartimentos subcelulares, en lugar de su intensidad de la tinción predijeron independientemente el pronóstico de los pacientes con CRC, lo que representa un marcador de identificación de un subconjunto de tumores que han perdido la sensibilidad a la apoptosis mediada por receptor.
Materiales y Métodos
las muestras clínicas
especímenes de cáncer colorrectal de pacientes sometidos a resección quirúrgica con intención curativa entre 1994 y 2004 en la Universidad de Munich fueron recuperados de los archivos del Instituto de Patología de las nuestra universidad. Recogida de muestras y de la información de los pacientes se realizó de forma anónima de acuerdo con las directrices del comité de ética de la Universidad de Munich. Sólo colorectal adenocarcinomas con diferenciación moderada (G2 de acuerdo con la clasificación de la OMS), T-categorías T2 y T3 que ni tiene nodal (N0) ni metástasis a distancia (M0) en el momento del diagnóstico, y por lo tanto en la etapa I y IIA de acuerdo con el TNM clasificación de cáncer de colon, se consideraron (T2 /T3N0M0 G2) [14]. Además, para minimizar una posible influencia de la radio- o quimioterapia-tratamiento en el estado TRAIL-receptores [15], [16] y en el pronóstico de los pacientes, los pacientes que se sometieron a la terapia neoadyuvante o adyuvante, además del tratamiento quirúrgico fueron excluidos de esta cohorte. Los datos de supervivencia fueron recuperados de la registro de tumores Múnich (www.tumoregister-muenchen.de). Los casos fueron censurados donde los pacientes se perdieron durante la observación o murieron debido a otras razones que el cáncer colorrectal. El estudio cumplió con los requisitos de la Comisión de Ética de la Ludwig-Maximilian Universität de Munich.
Construcción de microarrays de tejidos
microarrays de tejidos de cáncer colorrectal (TMA) se construyeron como se describe anteriormente [17]. Brevemente 5 micras H & amp; E secciones teñidas de parafina fijadas con formalina incorporado (FFPE) muestras de tumor se utilizaron para definir áreas representativas de tejido tumoral viable. A partir de estas áreas se tomaron 1,0 mm de diámetro de aguja de núcleo de biopsias de las áreas correspondientes en los bloques tumorales FFPE utilizando un arrayer tejidos (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, EE.UU.). Los núcleos se colocan en los bloques de la matriz de parafina receptor en las coordenadas definidas. Para asegurarse de que las partes representativas de los tumores fueron investigados se tomaron tres núcleos de cada tumor. Para tomar también la heterogeneidad del tumor en cuenta, los núcleos fueron tomados de las zonas centrales de tumores, así como desde el frente invasivo. Los núcleos en el bloque de parafina se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C para mejorar la adhesión entre los núcleos y la parafina del bloque receptor.
La inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica se realizó en 5 micras secciones de TMA bloques. Anti-TRAIL-R1 anticuerpo monoclonal de cabra (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Alemania art sc-6823), anti-TRAIL-R2 anticuerpo monoclonal de conejo (Calbiochem, California, EE.UU. art PC392), E- cadherina anticuerpo monoclonal de ratón (Invitrogen, Carlsbad, CA) se aplicaron como anticuerpo primario. Coimmunofluorescence se realizó utilizando la siguiente fluoresceína marcado con anticuerpos secundarios: por TRAIL-receptores FITC-conjugado anti-IgG de cabra (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) y para CDH1 un Cy3-conjugado anti-IgG de ratón (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA). Estos anticuerpos se utilizaron anteriormente y validados [8]. La recuperación del antígeno se realizó por ebullición de las secciones en Target Retrieval Solution (Dako, Hamburgo, Alemania), utilizando un horno de microondas 2 veces cada 15 min a 750 W. endógena de peroxidasa fue bloqueada por incubación en peróxido de hidrógeno 7,5% durante 10 minutos. Vectastain ABC-Elite Kit universal (Vector Laboratories, CA, EE.UU.), junto con AEC cromógeno (Zytomed Systems) fueron utilizados para el desarrollo. Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina (Vector).
Evaluación de TRAIL-R1 y TRAIL-R2 inmunohistoquímica
TRAIL-R1 y TRAIL-R2 inmunotinción fue evaluada por la clasificación de la intensidad de la tinción de acuerdo con la una puntuación semicuantitativa de 0 a 2, respectivamente, para grados positivos negativos, débiles y fuertes de inmunoreactividad (Figura 1). De acuerdo con el razonamiento de que un requisito previo para la actividad funcional de TRAIL-receptores es la expresión en la superficie membranosa [18], una segunda evaluación se realizó mediante la categorización de muestras de tumores según la presencia o ausencia de TRAIL-receptores de tinción en las membranas celulares, independientemente de la concomitante presencia de tinción citoplasmática y su intensidad de la tinción (Figura 2). Además de la inspección al microscopio de luz convencional, para discriminar con mayor sensibilidad entre la membrana y la tinción citoplasmática de TRAIL-receptores, el patrón de inmunofluorescencia de co-tinción de TRAIL-receptores y E-cadherina se llevó a cabo mediante el uso de la microscopía confocal (patrones de tinción de representación en Figura 3). Las imágenes fueron capturadas con un dispositivo de LSM 700 (Zeiss) utilizando un Apochromat Plan de 20 × /0.8 objetivo M27, software ZEN 2009 (Zeiss) y los siguientes parámetros: tamaño de la imagen 2048 × 2048 y 16 bits; píxel /reposo de 25,2 mu s; Tamaño de píxel de 0,31 micras; potencia del láser 2%; ganancia maestra 600-1000. Después de la captura de los archivos de imagen LSM originales fueron convertidos en archivos TIFF. Para excluir muestras de variabilidad intraobservador fueron evaluados dos veces por un observador que no tenía conocimiento previo de pronóstico o de otras variables clínico-patológica. características ejemplares de TRAIL-receptores de tinción en muestras de cáncer de colon o en tejidos no tumorales se muestran respectivamente en la Figura 1, Figura 2, y en la Figura S1.
(A) Porcentaje de muestras que no muestran tinción, débil o inmunoreactividad fuerte. (B-D): representante típico aspecto microscópico de la tinción de TRAIL-R1 (B:. Ninguna tinción C: débil y D: tinción fuerte). (D a F): tinción de TRAIL-R2 (E:. Ninguna tinción F: débil y G: fuerte tinción). Las actuales secciones son representativos de un cáncer de colon de grado 2 en el estadio II (T3N0M0) en la magnificación de 630 ×.
(A) porcentaje de muestras tumorales que muestran la tinción de membrana de TRAIL-R1 y TRAIL R2. Representante aspecto microscópico típico de tinción TRAIL-R1 con citoplasmática predominante (B) o tinción de membrana (C). patrón típico de tinción de TRAIL-R2 con la tinción predominante citoplasmática (D) o tinción de membrana (E). Ampliación, × 800. Las actuales secciones son representativos de un cáncer de colon de grado 2 en el estadio II (T3N0M0) en la magnificación de 630 ×.
patrón Representante de co-tinción de TRAIL-R1 y E-cadherina en las membranas celulares de células de cáncer colorrectal por microscopía confocal que muestra (a) un patrón de tinción de la membrana vs. predominante (B) tinción no membranoso. La tinción para TRAIL-R1 (verde, panel izquierdo), E-cadherina (rojo, panel central) y superposiciones de estos tinción (panel derecho).
Los análisis de mutaciones de KRAS
Para los análisis de mutaciones en el exón 2 del oncogén KRAS en el codón 12/13, el material se dejó solamente de 200 de los 231 pacientes (86,6%). Por lo tanto, el ADN genómico se extrajo de microdisección de las áreas de tejido que contienen tumor como se describe anteriormente [19]. Pyro-secuenciación se realizó utilizando el kit Pyro-Gold (Qiagen, Alemania) y HotStar Taq-polimerasa (Qiagen, Alemania). Se utilizó el cebador PF2 para determinar las secuencias anti-sentido. El dispositivo PyroMark Q24 (Qiagen, Alemania) y el software PyroMark ™ P24 se utilizaron para la secuenciación y análisis de secuencias [20], [21].
estabilidad de microsatélites análisis
Para determinar el estado de la estabilidad de microsatélites [estabilidad de microsatélites (SMS) o la inestabilidad de microsatélites de alto grado (MSIH)], se investigaron dos marcadores de repetición de mononucleótidos BAT-25 y BAT-26. ADN se amplificó en un dúplex de PCR (kit Qiagen ADN Multiplex PCR, cebadores 100 nM BAT25 y 100 nM BAT26-específicos - Tabla S3) aplicando el siguiente perfil de ciclo: desnaturalización a 95 ° C durante 15 min, 34 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 s, hibridación a 57 ° C durante 90 segundos y extensión a 72 ° C durante 60 seg, con una etapa de extensión final a 60 ° C durante 30 min, como se describe anteriormente [22], [23]. 1 l de producto de PCR se mezclaron con 18,5 l de formamida desionizada altamente (HiDi formamida) y 0,5 l de tamaño de ADN estándar LIZ 500 /(-250) (ambos de Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). Esta mezcla se desnaturaliza durante 3 min a 94 ° C, inmediatamente puso en hielo, y se separó usando un ABI 3130 Genetic Analyzer. Los resultados fueron analizados utilizando el software GeneMapper (Applied Biosystems).
Análisis de la expresión de la KRAS4A formas de empalme y KRAS4B
Para esta investigación suficiente material fue dejado por sólo 128 de 231 muestras de tumores (55,4 %). Por lo tanto ARN total se aisló de las zonas tumorales microdissected usando kits RNeasy (Qiagen; 74404) como se describe anteriormente [24]. las concentraciones de ARN se midieron por UV-fotometría. 200-1000 ng de los aislamientos de ARN se transcribe de forma inversa en presencia de 100 mM cebadores hexámeros aleatorios y de 200 U de la transcriptasa inversa RevertAid (tanto por Fermentas, St. Leon, Alemania; SO142, EP0441). 2 l de la reacción RT-crudo fueron utilizados como plantilla en la RT-qPCRs empleando Light Cycler 480 Sondas Master (Roche; 04902343001) con pares de cebadores específicos y universales ProbeLibrary sondas (Roche - Tabla S3). los valores de Cp (punto crítico) de RT-qPCRs específicos para
KRAS4A, KRAS4B
y el gen de referencia
HPRT gratis (
hipo-xantina phosphoribosyl- transferasa
) se determinaron empleando una LightCycler 480 dispositivo (Roche). Todas las concentraciones de
KRAS4A, KRAS4B
ARN se normalizaron específicos de la expresión de la
HPRT
gen (ΔCp). Los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron al menos dos veces. Para validar el sistema experimental, las cantidades relativas de las dos variantes de empalme KRAS4A y KRAS4B se evaluaron en líneas de células SW948 y HCT15 como se había descrito que SW948 expresar más variante KRAS4A de HCT15 células [25]. Este resultado fue reproducible (Figura S3) validando así el montaje experimental. Además, nuestro sistema de lectura de alta robustez demostrada en forma de curvas de calibración utilizando cantidades definidas de ADN molde mostró linealidad al menos más de cuatro escalas de registro de hasta 100 copias del tipo específico de ARN (Figura S3).
El análisis estadístico
Las tabulaciones cruzadas se calcularon utilizando la prueba exacta de Fisher. Se utilizó el análisis de Kaplan-Meier para estimar la supervivencia específica del cáncer. Importancia de la estadística de Kaplan-Meier se puso a prueba la aplicación de la prueba de log-rank. El análisis multivariante se realizó mediante el modelo de regresión de Cox. Las estadísticas se calcularon con el programa SPSS versión 15.0 (SPSS Inc.). los valores de p & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Pacientes y muestras
La detección de muestras de cáncer se llevó a cabo en pacientes sometidos a resección quirúrgica con intención curativa. entre 1994 y 2004 en nuestra institución. La selección de las muestras se limita a adenocarcinomas colorrectales con diferenciación moderada (G2), T-categorías T2 y T3 en pacientes que tienen ni nodal (N0) ni metástasis a distancia (M0) en el momento del diagnóstico, y se limita a pacientes que recibieron sólo el tratamiento quirúrgico . Esto dio lugar a una colección de 231 pacientes para el análisis. La colección constaba de 55% hombres y 45% pacientes de sexo femenino. El 64% de los pacientes eran mayores de 65 años (edad media 56 ± 8,1 años), mientras que el 36% restante de los pacientes tenían una edad media de 75 ± 6,9 años. 85% de los pacientes fueron diagnosticados con un tumor en estadio T3 mientras que el 15% de los pacientes se vieron afectados por un tumor en estadio T2. Los datos de supervivencia fue censurado como caso de seguimiento se suspendió o pacientes murieron por otras razones que el cáncer colorrectal. Las características de esta población de pacientes se resumen en la Tabla 1.
TRAIL-R1 y TRAIL-R2 en la tinción de muestras de cáncer colorrectal
Para evaluar la tinción de TRAIL-receptores en muestras de tumores se realizó primero un análisis semi-cuantitativo basado en la clasificación de muestras de acuerdo con la ausencia de tinción, o la presencia de una intensidad de tinción débil o fuerte para los respectivos receptores. De acuerdo con este criterio, 87 (38%) de las muestras de cáncer de colon mostró una fuerte tinción positiva, 129 (56%) mostraron una tinción débil, mientras que 15 (6%) muestras teñidas por completo negativo para TRAIL-R1 (Figura 1). Al igual que en las muestras de tumores se examinó TRAIL-R2, se observó una tinción fuerte en 110 (48%) de los casos, una tinción débil en 116 (50%), mientras que sólo 5 (2%) muestras teñidas negativo para TRAIL-R2 (Figura 1). En un análisis posterior se determinó la distribución celular de TRAIL-R1 y TRAIL-R2 mediante la categorización de muestras de tumores de acuerdo con la presencia o ausencia de tinción para los respectivos TRAIL-receptores en las membranas celulares. A juzgar por la tinción inmunohistoquímica y el patrón de inmunofluorescencia superposición de TRAIL-receptores y de E-cadherina, la tinción de membrana de TRAIL-R1 puede ser detectado en 163 (71%) de los casos, mientras que la tinción negativa o exclusivamente tinción citoplasmática se encontró en 68 (29 %) casos. Para la tinción de membrana TRAIL-R2 se observó en 36 casos (16%); Se observó tinción citoplasmática o negativo en 195 casos (84%)
.
Por lo tanto, mientras que la mayoría de las muestras de tumor se tiñeron por completo positivo para TRAIL-receptor 1 y 2, la fracción de las muestras tumorales que muestran la tinción de membrana para estos receptores era considerablemente inferior. Cuando la intensidad de la expresión y la distribución celular de TRAIL-receptores en las muestras de tumor se analizaron en relación con diferentes variables clínico-patológicas incluyendo el estado KRAS-mutación y la presencia de inestabilidad de microsatélites, ninguna correlación podría ser detectada como se juzga por la prueba exacta de Fisher (Tablas S1 y S2).
significado pronóstico de la expresión de TRAIL-receptor y la localización celular en el cáncer colorrectal
Cuando la expresión de TRAIL-receptores se considera en relación con la supervivencia de pacientes con cáncer colorrectal, TRAIL intensidad de la tinción -R1 (alta expresión versus baja /sin expresión) se asoció con un pronóstico significativamente mejor: la supervivencia a los 5 años de los pacientes que tienen tumores con mayor general TRAIL-R1 expresión fue del 70% frente a 56% de los pacientes con baja o por completo sin tinción para TRAIL-R1; la supervivencia a los 10 años para estos pacientes fue de 31%, respectivamente, frente al 25% (p = 0,008; Figura 4A). Además, cuando las muestras de tumores fueron clasificados de acuerdo a la presencia o ausencia de tinción de la membrana de TRAIL-receptores, los pacientes con tumores que exhiben tinción TRAIL-R1 en la superficie de las membranas celulares mostraron tener un mejor pronóstico frente a pacientes con citoplasmática o ninguna tinción (5 años de supervivencia del 65% frente a 44%; supervivencia a 10 años: 30% vs 22%, p = 0,003 - Figura 4B)
(A) parcela de supervivencia de los pacientes afectados por cáncer colorrectal acc. . a intensidad de la tinción TRAIL-R1. En este y en los siguientes gráficos casos censurados están indicados por una cruz. curvas (B) de supervivencia de la población de las mismas de los pacientes categorizados de acuerdo a las manchas TRAIL-R1 en la membrana celular. plot (C) La supervivencia de los pacientes de acuerdo con la intensidad de la tinción de TRAIL-R2 (fuerte frente a una expresión débil). plot (D) la supervivencia de la población del mismo paciente clasifican de acuerdo con la distribución celular TRAIL-R2. (E) La supervivencia de los pacientes de acuerdo a la condición de tinción de membrana de ambos receptores TRAIL. Las curvas de Kaplan-Meier representan la supervivencia global en relación con la tinción de membrana del receptor de TRAIL 1 y 2 pacientes portadores de tumores en comparación con tinción negativa tanto para los receptores de TRAIL.
Cuando se consideró tinción TRAIL-R2, la intensidad de la expresión no se correlacionó significativamente con la supervivencia (p = 0,17; Figura 4C). Sin embargo, si los pacientes fueron estratificados según la presencia o ausencia de tinción en las membranas celulares, la tinción de membrana de TRAIL-R2 en muestras de tumores correlacionados con una supervivencia significativamente mejor paciente (5 años de supervivencia: 83% vs. 57%; 10 supervivencia a cinco años: 38% vs 26% p = 0,015; Figura 4D). Cuando la supervivencia de los pacientes se analizó de acuerdo a la doble positividad para TRAIL-receptores, es decir, cuando la supervivencia de los pacientes con tinción de membrana simultánea de TRAIL-R1 y TRAIL-R2 se comparó con la de los pacientes que muestran ninguna tinción o la tinción citoplasmática única, la supervivencia de los pacientes con tinción de membrana para ambos receptores TRAIL-aumento de 92% frente a 44% de los pacientes sin tinción membranosa (p = 0,012, Figura 4E). Un análisis más detallado teniendo en cuenta la posible que, como se informó anteriormente, las mutaciones KRAS, una cantidad disminuida de la KRAS4A variante de empalme con respecto a la KRAS4B variante de empalme, o un MSI-fenotipo podría influir en la supervivencia de pacientes con cáncer colorrectal [26] - [28] , no se presentó ningún efecto significativo en la cohorte de pronóstico de nuestros pacientes (Figura S2).
por último, para evaluar la influencia específica de los receptores TRAIL-tinción en la supervivencia, un análisis de regresión de Cox que incluye al mismo tiempo la distribución celular de TRAIL los receptores, se realizó la intensidad de la tinción y otras variables clínico-patológicas relevantes. Esto demostró que la tinción de membrana de TRAIL-R1 y TRAIL-R2 de forma individual e independiente predice la supervivencia de nuestros pacientes con cáncer colorrectal colectiva (TRAIL-R1: p = 0,019; RR 2,06 [1,12-3,77]; TRAIL-R2: p = 0,033 , RR 3,63 [1,11-11,84]). Por el contrario, a pesar de la asociación significativa se encuentra en el log-rank test, la intensidad de la tinción /expresión de TRAIL-receptores no pudo ser confirmado como factor de riesgo independiente para la recurrencia (Tabla 2).
discusión
TRAIL-receptores en la fisiopatología y el tratamiento del cáncer colorrectal
la pérdida de receptores TRAIL se ha demostrado que desempeñan un papel importante en el desarrollo del cáncer. En particular, varios estudios diferentes apoyan la noción de que la señalización TRAIL jugadas
in vivo
una función importante en la prevención de la formación de metástasis [29] - [32]. Recientemente, también se demostró que la expresión de TRAIL-receptores se correlaciona con la de varios marcadores de apoptosis, proporcionando así un vínculo entre el papel funcional de estos receptores y su importancia pronóstica [33].
En informes anteriores sobre la casi ubicuidad de expresión de TRAIL-receptores en CRC representaba el fundamento para el uso de receptores TRAIL-agentes de la orientación para el tratamiento de este tumor. Sin embargo, sorprendentemente, mientras que la pérdida frecuente de TRAIL-receptores reportado por varias entidades tumorales podría representar un obstáculo para la eficacia clínica de tales compuestos [8], [10], [34], [35] hay una evaluación sistemática de la tinción de membrana de TRAIL los receptores en las muestras de CRC está disponible. Por otra parte, los primeros informes sobre ensayos clínicos de fase temprana con TRAIL-receptores dirigidos anticuerpos agonistas en el CCR no mostraron signos claros de eficacia [36] que provocó una mayor investigación sobre los receptores TRAIL como diana terapéutica en el tratamiento de este tumor. Para abordar esta cuestión, basándose en nuestros hallazgos recientes en el carcinoma hepatocelular [8] adoptamos la evaluación de la distribución celular de los receptores TRAIL como criterio para evaluar su importancia pronóstica. Además, para reducir los posibles factores de polarización, se decidió analizar un colectivo homogéneo de pacientes con tumores en estadio temprano sin cirugía de las metástasis sometidos solamente.
relevancia pronóstica de TRAIL-receptores intensidad de la tinción
De acuerdo con estudios anteriores [10], [12], [13], en nuestra cohorte la gran mayoría de las muestras mostró tinción positiva para TRAIL-R1 y TRAIL-R2, aproximadamente la mitad de las muestras que muestran una tinción fuerte (Figura 1). Como se evaluó la importancia pronóstica de TRAIL-receptores de tinción, TRAIL-R1 intensidad de tinción puntuaciones (fuerte frente al tratamiento pobre /no-tinción) mostró una correlación significativa con la supervivencia en el log-rank test, mayor intensidad de tinción TRAIL-R1 está asociada con mejor supervivencia (p = 0,008, Figura 4A); por el contrario, TRAIL-R2 intensidad de la tinción, KRAS-estado, la cantidad relativa de la variante de empalme KRAS4A o MSI-fenotipo no mostró correlación con la supervivencia (Figura 4C, la figura S2). Estos resultados están de acuerdo con estudios anteriores que informó de una correlación positiva entre la supervivencia y la expresión de TRAIL-R1 [10], [33] de los pacientes. Por razones desconocidas, también se informó de ningún efecto [13] o incluso una correlación negativa para TRAIL-R1 pero la correlación positiva de moda para TRAIL-R2 con la supervivencia [12].
relevancia pronóstica de la distribución celular de TRAIL receptores como alternativa a la intensidad de la tinción
En el intento de aclarar aún más este problema, que posteriormente se evaluó si la presencia o ausencia de tinción de la membrana de TRAIL-receptores podrían mejor se correlaciona con la supervivencia a continuación, la única evaluación de su intensidad de la tinción. En contraste con la tinción casi omnipresente para los receptores TRAIL, una fracción considerable de las muestras mostró tinción de membrana negativo para TRAIL-R1 y TRAIL-R2 (Figura 2). Con la adopción de este criterio, la supervivencia a cinco años en pacientes que tienen tumores que exhiben TRAIL-R1 o tinción TRAIL-R2 en las membranas celulares fue más alta que la de los pacientes que no muestran tinción o la tinción citoplasmática única (Figura 4). Los pacientes que tienen tumores con tinción positiva de doble membrana para ambos receptores TRAIL-sobrevivieron significativamente más largo en comparación con los pacientes que muestran la tinción de membrana de doble negativo (Figura 4E). El hecho de que en el análisis multivariante que comprende el efecto de la distribución celular de TRAIL-receptores, así como la de su intensidad de la tinción, este último no se pudo confirmar como factor pronóstico independiente sugiere que la detección de TRAIL-receptores de manchas en la membrana celular es el principal determinante de la supervivencia: esto es consistente con los datos disponibles para los pacientes afectados por el carcinoma hepatocelular [8], con la reciente
in vitro
evidencia sobre el papel de los receptores TRAIL internalización en la resistencia a TRAIL [18] , y con la idea de que los receptores de TRAIL unidos a la membrana se exponen al efecto de TRAIL circulante. Estudios anteriores habían demostrado ninguna importancia pronóstica de TRAIL-R2, o sólo una tendencia hacia una correlación positiva entre la expresión de este receptor y la supervivencia [12]; planteamos la hipótesis de que el hecho de reconocer el papel de TRAIL-R2 en la determinación de la supervivencia de los pacientes en estudios anteriores refleja la mayor importancia pronóstica de la distribución celular de los receptores TRAIL-vs la de su intensidad de la tinción.
Las consecuencias clínicas de el significado funcional de los receptores TRAIL-tinción de las membranas celulares
la pérdida de expresión de TRAIL-receptores tiene potenciales consecuencias sobre el empleo de anticuerpos agonistas dirigidos TRAIL-receptores en este momento de someterse a investigación clínica como terapia contra el cáncer: aunque podríamos confirmar que la gran mayoría de los tumores manchado positivo para TRAIL-receptores, se encontró que la pérdida de TRAIL-receptores en la membrana celular es una característica frecuente de CRC con significado pronóstico predominante; debe ser considerado, por lo tanto, si la no muestran signos de eficacia en ensayos clínicos recientes usando TRAIL-receptores anticuerpos agonistas [36] podrían ser atribuibles a la selección insuficiente de pacientes que tienen tumores con receptores TRAIL-membrana. Por otra parte, debido a la suma de los efectos de pronóstico de TRAIL-R1 y TRAIL-R2, pacientes que muestran la tinción de membrana para ambos receptores podrían aprovecharse de la administración combinada de anticuerpos dirigidos a los receptores o por la administración de TRAIL recombinante [37] .
el hecho de que, con independencia de su localización celular, casi todas las muestras tumorales mostraron algún grado de tinción para TRAIL-receptores está de acuerdo con la idea de que la pérdida genética o mutación de los receptores TRAIL es un evento raro en células del cáncer [34], [38]. Las diferencias en la distribución celular de estos receptores en lugar sugiere que la deficiencia de TRAIL-receptores de tráfico a la membrana celular externa o mecanismos de internalización jugar un papel en la determinación de la pérdida funcional de los receptores TRAIL. A este respecto, la endocitosis mediada por clatrina se ha descrito recientemente como la causa de la resistencia a TRAIL en células de cáncer de mama [18] y varios compuestos se muestran para aumentar la expresión de TRAIL-receptores, así como su localización en las membranas de las células [39], [ ,,,0],40].