Extracto
Los niveles de expresión de anoctamin 1 (ANO1, TMEM16A), un canal de cloruro activado por calcio (CACC) , se aumentó significativamente en varios tumores, y la inhibición de ANO1 se sabe que reduce la proliferación celular y la migración. A continuación, se realizó el cribado basado en células de una colección de productos naturales y compuestos similares a fármacos para identificar inhibidores de ANO1. Como resultado de la proyección, la idebenona, miconazol y plumbagina fueron identificados como inhibidores de ANO1 novedosas. Estudios electrofisiológicos mostraron que la idebenona, un análogo sintético de la coenzima Q10, la actividad ANO1 completamente bloqueada en las células FRT que expresan ANO1 sin ningún efecto sobre la señalización de calcio intracelular y CFTR, un canal de cloruro regulado por AMPc. Las actividades CACC en células CFPAC-1 que expresan abundantes ANO1 endógena PC-3 y estaban fuertemente bloqueadas por la idebenona. La idebenona inhibe la proliferación celular y la apoptosis inducida en células CFPAC-1 PC-3 y, pero no en las células A549, que no expresan ANO1. Estos datos sugieren que la idebenona, un nuevo inhibidor de ANO1, tiene un gran potencial para su uso en la terapia del cáncer
Visto:. Seo Y, Parque J, Kim M, Lee HK, Kim J-H, Jeong J-H, et al. (2015) La inhibición de la ANO1 /TMEM16A Cloruro Canal de idebenona y su citotoxicidad de líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 10 (7): e0133656. doi: 10.1371 /journal.pone.0133656
Editor: Johannes Reisert, Monell Sentidos Químicos Center, Estados Unidos |
Recibido: 15 Abril, 2015; Aceptado: June 29, 2015; Publicado: 21 de julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Seo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Yonsei Proyecto Global de especialización de 2014, una subvención de la tecnología sanitaria Corea R & amp; D Proyecto, Ministerio de Salud & amp; . Asuntos de bienestar, República de Corea (HI08C2149) y el Programa Básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología [NRF-2012R1A1A1040142]
Conflicto de intereses: El autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El calcio activada por Cl
-. canales (CaCCs) se expresan ampliamente en diversos tipos de células y tejidos, y que están implicadas en muchos actividades fisiológicas tales como la secreción epitelial fluido, contracción del músculo liso, y la señal sensorial transducción [1-3]. CaCCs se describieron por primera vez hace más de 3 décadas, pero la identidad molecular de CaCCs se ha identificado recientemente [4]. En 2008, tres grupos de investigación independientes informaron que anoctamin-1 gen (ANO1, TMEM16A) codifica una CACC, mostrando activados por calcio Cl
- corrientes cuando se expresa en oocitos y células de mamífero [5-7]. ANO1 se expresa en varios tipos de células incluyendo traqueal, intestinal, y el epitelio glandular, células de músculo liso, células marcapasos intestinales, las neuronas sensoriales, y varios tumores [5, 7-9].
ANO1 era conocido también como descubierto en GIST-1 (DOG1), y la secuencia amplificada sobreexpresa tumoral 2 (TAOS2), y el cáncer oral sobreexpresa 2 (ORAOV2) [10, 11]. DOG1, TAOS2 y ORAOV2 se denominan así porque ANO1 está fuertemente sobreexpresada en tumores del estroma gastrointestinal (GIST) y carcinomas de células escamosas orales. ANO1 se asigna a la banda cromosómica 11q13 que se amplifica frecuentemente en una variedad de carcinomas humanos, incluyendo carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), GIST, de mama y cáncer de próstata. La evidencia reciente sugiere la participación ANO1 en la proliferación celular, la migración celular, la tumorigénesis y la progresión del cáncer [12, 13]. Por ejemplo, la inhibición de la expresión ANO1 en células PC-3 de cáncer de próstata reduce significativamente la proliferación, la metástasis y la invasión, y se bloquea el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón [14]. La inhibición farmacológica de ANO1 por T16A
inh-A01, un inhibidor selectivo ANO1, la reducción de la proliferación de las células intersticiales de Cajal (ICC) y CFPAC-1 en las células de cáncer de páncreas que expresan endógeno ANO1 [15]. En las células de cáncer de mama, la baja regulación de la expresión génica ANO1 reducida proliferación, la apoptosis provocada, y inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto. Además, la inhibición farmacológica de la actividad CACC de ANO1 redujo la viabilidad celular en HNSCC, carcinoma esofágico de células escamosas (CECA) y de cáncer de mama células a través de la inhibición del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la calmodulina dependiente de la proteína quinasa II (CaMKII) de señalización [16 ].
mayoría de la evidencia indica que la inhibición farmacológica de la actividad del canal ANO1 puede tener el potencial para proporcionar beneficios terapéuticos para HNSCC, CECA, GIST, de mama y pacientes con cáncer de próstata. Desde ANO1 recientemente ha sido identificado, sólo unos pocos compuestos fueron identificados como inhibidores ANO1 potentes tales como CACC
inh-A01, ácido tánico, T16A
inh-A01, ácido digálico, diclorofeno, benzbromarona, y N - ((4 metoxi) -2-naftil) -5-nitroantranílico (MONNA). Por otra parte, la propiedad farmacológica y los mecanismos de acción de los inhibidores aún no están claros [17-21].
Para la identificación de inhibidores ANO1 novedosos, se realizó un cribado basado en la célula con una colección de productos naturales y fármacos compuestos -como utilizando un ensayo de cribado de alto rendimiento basado en células establecido para la identificación de inhibidores de ANO1 en estudio anterior [19]. Encontramos algunos compuestos similares a los medicamentos y productos naturales que muestran una potente actividad inhibidora ANO1, y se investigó el efecto de los compuestos de golpe en la inhibición del crecimiento de líneas celulares de cáncer, que expresan endógenamente ANO1.
Materiales y Métodos
Materiales y soluciones
Idebenona, la coenzima Q10, plumbagina, miconazol, y otros productos químicos, a menos que se indique lo contrario, se adquirieron de Sigma. ANO2 ratón se adquirió de Origene Technologies Inc. (Rockville, MD, EE.UU., nº de catálogo MC205812). La colección compuesto usado para el cribado (Spectrum Collection, 2320 compuestos) se adquirió de Microsource Descubrimiento Inc. (Gaylordsville, CT). Esta biblioteca se compone de drogas terapéuticas humanas o compuestos similares a medicamentos y productos naturales. Los compuestos se diluyeron con DMSO para alcanzar una concentración de 2,5 mM. Esto fue utilizado como el 100x solución madre concentrada que se trató en las células.
Cultivo de células
Fisher tiroides de ratas células (FRT) fueron transfectadas establemente con ANO1 humana (abc) o de tipo salvaje humana escriba CFTR por separado, y ambas de las células fueron transfectadas de forma estable con el sensor de haluro YFP-H148Q /I152L /F46L o YFP-H148Q como se describe en el estudio anterior [20, 22]. células FRT fueron transfectadas de forma estable con el ratón ANO2 (Origene Technologies Inc.) y el sensor de haluro YFP-F46L /H148Q /I152L. células FRT cultivadas en Coon`s modificados medio F12 suplementado con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, penicilina 100 U /ml y 100 mg /ml de estreptomicina. células PC3 y HT-29 se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células A549 se cultivaron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de FBS, 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. células CFPAC-1 se cultivaron en Medio Modificado de Iscove (IMDM) de Dulbecco suplementado con 10% FBS, 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina.
Cell basado cribado
ANO1 /TMEM16A y las células que expresan FRT YFP se sembraron en 96 pocillos de microplacas de negro de paredes (Corning Inc., Corning, NY) a una densidad de 20.000 células por pocillo en medio F12 suplementado con 10% FBS, penicilina 100 U /ml, 100 mg /ml de estreptomicina. Los ensayos se realizaron usando un lector de microplacas FLUOstar Omega (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania) y el software de análisis de datos MARS (BMG Labtech). Cada pocillo de la placa de 96 pocillos se lavaron 3 veces en PBS (200 l /lavado), dejando 100 l de PBS. Se añadieron compuestos de ensayo (1 mu l) a cada pocillo a 25 mM de concentración final. Después de 10 min, placas de 96 pocillos se transfirieron a un lector de placas para el ensayo de fluorescencia. Cada pocillo se ensayó individualmente para mediada por TMEM16A Me
- afluencia mediante el registro de la fluorescencia de forma continua, a continuación, (400 ms por cada punto) durante 2 s (línea de base) 100 l de 140 mM Me
- Se añadió una solución que contenía ATP 200 mM a los 2 s y luego YFP fluorescencia se registró durante 6 s. tasa de yoduro de afluencia inicial se determina a partir de la pendiente inicial de disminución de la fluorescencia, por regresión no lineal, después de la infusión de yoduro con ATP.
estudio Cámara Ussing
insertos Snapwell contienen ANO1- o CFTR que expresan FRT las células se montaron en cámaras Ussing (Physiologic Instruments, San Diego, CA). El baño basolateral estaba llena de HCO
3
- solución que contiene (en mM) tamponado: 120 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl
2, 1 CaCl
2, 10 D-glucosa, 2,5 HEPES, y 25 NaHCO
3 (pH 7,4), y el baño apical se llenó de una media-Cl
- solución. En el medio-Cl
- solución de NaCl 65 mM en el HCO
3
- solución tamponada fue reemplazado por Na-gluconato. La membrana basolateral se permeabilizaron con 250 g /ml de anfotericina B. Las células se bañaron durante un período de estabilización de 20 min y se aireó con 95% O
2/5% de CO
2 a 37 ° C. ATP se aplicó a la solución del baño apical para inducir aumento de calcio intracelular; idebenona, forskolina y CFTR
inh-172 se añadieron a la solución del baño apical y basolateral. Las corrientes de membrana apical se midieron con un EVC4000 multicanal V /I abrazadera (World Precision Instruments, Sarasota, FL) y se registran usando PowerLab 4/35 (AD Instruments, Castle Hill, Australia). Los datos fueron recogidos y analizados con el software de software de adquisición de ADInstruments LabChart Pro 7. La frecuencia de muestreo fue de 4 Hz.
patch-clamp
Plenario de células patch-clamp grabaciones se realizaron en ANO1-que expresan las células FRT y células PC3. La solución del baño contenía (en mM): 140 NMDG-Cl, 1 CaCl
2, 1 MgCl
2, 10 de glucosa y 10 HEPES (pH 7,4). La solución de la pipeta contenía (en mM): 130 CsCl, 0,5 EGTA, 1 MgCl
2, 1 Tris-ATP, y 10 HEPES (pH 7,2). Pipetas fueron extraídos de vidrio de borosilicato y tenía resistencias de 3-5 mO después del pulido al fuego. Después de establecer la configuración de célula completa, ANO1 fue activado por ATP (100 mM). corrientes de células enteras fueron provocados por la aplicación de hiperpolarización y despolarización de pulsos de voltaje desde un potencial de 0 mV a potenciales entre -80 mV y +80 mV en etapas de 20 mV. Las grabaciones se realizaron a temperatura ambiente usando un Axopatch-200B (Axon Instruments, Union City, CA). Las corrientes fueron digitalizados y analizados utilizando un convertidor Digidata 1440A (Axon Instruments), y el software pCLAMP 10,2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las corrientes se filtra paso bajo a 1 kHz y se tomaron muestras a 5 kHz.
inmunotransferencia
Se prepararon extractos celulares y inmunotransferencia como se describe anteriormente [23]. FRT-ANO1, PC3, las células CFPAC-1 y A549 se lisaron con tampón de lisis celular (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,25% de desoxicolato de sodio, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1 mM Na
3Vo
4, y el inhibidor de la proteasa mezcla). Lisados de células enteras se centrifugaron a 15.000 g durante 10 min a 4 ° C para eliminar los restos celulares, y cantidades iguales (80 g de proteína /carril) de la proteína sobrenadante fueron separadas por 4-12% de gel premoldeado de Tris-glicina (KOMA BIOTECH, Seúl, Corea) y después se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore, Billerica, MA). Membrana se bloqueó con leche desnatada sin grasa 5% en solución salina tamponada con Tris (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, NaCl 150 mM) que incluye 0,1% de Tween 20 durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, esta membrana se incubó durante la noche con el anticuerpo primario ANO1 (un generoso regalo de Duk joven Yang, Universidad CHA). Después de lavar con 0,1% de Tween 20 en solución salina amortiguadora Tris (TBST), la transferencia se incubó adicionalmente durante 45 min a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario anti-conejo (Cell Signaling). La membrana se lavó tres veces con TBST durante 5 minutos y luego se visualizó usando el sistema de detección de Western blotting ECL Plus (Amersham GE Healthcare; Piscataway, NJ).
calcio intracelular medida
FRT y células HT-29 se cultivaron en 96 pocillos de microplacas de paredes negro y cargado con Fluo-4 NW por el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Brevemente, las células se incubaron con tampón de ensayo 100 l (solución salina equilibrada de Hanks 1X 'con probenecid 2,5 mM y HEPES 20 mM) que incluye Fluo-4 NW. Después de 1 hora de incubación, las placas de 96 pocillos se transfirieron a un lector de placas para el ensayo de fluorescencia. Fluo-4 de fluorescencia se midió con un lector de microplacas FLUOstar Omega (BMG Labtech) equipado con bombas de jeringa y la costumbre Fluo-4 excitación /filtros de emisión (485/538 nm). El calcio intracelular era incremento por aplicación de ATP 100 mM.
Ensayos de proliferación celular
PC3, CFPAC-1 y las células A549 se sembraron en microplacas de 96 pocillos. Después de horas de incubación 24, las células se trataron con diferentes concentraciones de idebenona (3, 10, 30 M), la coenzima Q10 (100 M) y T16A
inh-A01 (10 mM), y luego se incubaron durante 2 días. Se añadió una cantidad igual de DMSO para el control de todo. El medio de cultivo y los compuestos se cambian cada 12 h. Para evaluar la proliferación celular, después de la incubación 48 horas con los compuestos, BrdU (concentración final: 10 mM) se añadió y las células se volvieron a incubar durante 2 horas adicionales. incorporación de BrdU se determinó mediante kit de proliferación celular ELISA, BrdU (colorimétrico) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Para el ensayo de MTS, después de incubación de 48 horas, las células se volvieron a incubar con MTS durante 1 hora. El formazan soluble producido por reducción celular del MTS se cuantificó midiendo la absorbancia a 490 nm con infinita M200 (Tecan, Grödig, Austria) lector de microplacas. ensayo de MTS se realizó utilizando CellTiter 96 Solución acuosa Un kit de ensayo de proliferación celular (Promega, Madison, WI, EE.UU.).
cicatrización de heridas ensayo
movilidad celular se evaluó utilizando un ensayo de cero herida. células PC3 se cultivaron en una placa de 96 pocillos hasta que era confluente. La capa de células fue herido usando un 96-Bueno WoundMaker (Essen BioScience, Michigan, EE.UU.) y se lavó dos veces con suero fresco libre de los medios de comunicación. Las células se incubaron con medio libre de suero, y las imágenes de las heridas fueron tomadas automáticamente cada 2 h durante 48 h utilizando el IncuCyte ZOOM (Essen BioScience). Las imágenes se analizaron mediante el paquete de software IncuCyte (Essen BioScience).
TUNEL ensayos
PC3, las células CFPAC-1 y A549 se sembraron en placas de 96 pocillos de microplacas de paredes negro. Después de horas de incubación 24, las células se trataron con idebenona (30 M) y después se incubaron durante 2 días. Las células se fijaron y se tiñeron con TUNEL (desoxinucleótido transferasa terminal mediada dUTP etiquetado nick-end, verde) con el ApopTag fluoresceína directa En Kit Situ Apoptosis Detección (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), y luego núcleo se tiñeron con DAPI ( 4,6-diamino-2-fenilindol, azul).
el análisis estadístico
los resultados de múltiples experimentos se presentan como la media ± EE El análisis estadístico se realizó con la prueba t de Student o por análisis de varianza según sea apropiado. Un valor de
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Identificación de ANO1 /TMEM16A inhibidores
Una proyección basada en células de una colección de productos naturales y compuestos de drogas, como se hizo para la identificación de inhibidores ANO1. la actividad del canal de cloruro ANO1 se midió utilizando Fischer tiroides de rata (FRT) células que expresan de forma estable ANO1 humana y la proteína fluorescente yoduro de detección codificado genéticamente, YFP-F46L /H148Q /I152L. Como se muestra en la figura 1A, para el cribado para identificar inhibidores ANO1, las células FRT se pre-incubaron con compuestos de ensayo en PBS antes de la adición de un yoduro y ATP, un agonista de receptor purinérgico P2 que provoca un aumento en la concentración de calcio intracelular, que contiene la solución. En presencia de inhibidor ANO1, se inhibirá YFP fluorescencia enfriamiento rápido por la ingesta de yoduro a través de ANO1.
(A) Principio de, el ensayo de cribado de alto rendimiento basado en células de fluorescencia. (B) Las estructuras químicas de los inhibidores de ANO1. (C) YFP fluorescencia mide en pocillos individuales de placas de 96 pocillos, muestra el efecto inhibidor de la idebenona, miconazol y plumbagina en la actividad del canal ANO1. concentraciones indicadas de idebenona, miconazol y plumbagin se añadieron 20 minutos antes de la activación por ANO1 ATP 100 mM
Proyección de 2320 produjo 24 compuestos compuestos que bloquean afluencia de yodo por & gt.; 70% a los 25 mM. Hemos encontrado tres nuevos inhibidores ANO, idebenona, plumbagin y miconazol, a partir de los compuestos de golpe primarias. La idebenona, plumbagina y miconazol inhibieron significativamente la actividad del canal de cloruro ANO1 de una manera dependiente de la dosis y ANO1 completamente inhibida a 30 M (Fig 1C).
Caracterización de idebenona
Idebenona se estudió más porque idebenona , un análogo sintético de la coenzima Q10 (CoQ10), muestra la inhibición potente y selectivo de ANO1, y es ampliamente utilizado como un poderoso antioxidante. Apical medición corrientes de membrana en ANO1 células que expresan FRT dio un IC
50 de 9,2 M de idebenona y mostrar inhibición casi completa de las corrientes de cloruro ANO1 por 30 M idebenona (Fig 2A y 2B). Para investigar el efecto de la idebenona sobre la señalización de calcio intracelular, las células HT-29 y FRT se cargaron con Fluo-4 NW, un sensor de calcio fluorescente. Las células fueron pretratadas con idebenona 30 mM y luego ATP aplican a una concentración de 100 mM inducidas aumento transitorio en la concentración de calcio citosólico. El aumento de calcio citosólico inducida por ATP no se vio afectada significativamente por la idebenona (Figura 2C). Para dilucidar si la idebenona altera los otros canales de cloruro, la fibrosis quística regulador de la conductancia transmembrana (CFTR) y ANO2 (TMEM16B), que comparte una homología alta de aminoácidos de ANO1, que mide las corrientes de membrana apical de las células FRT que expresan CFTR de tipo salvaje humanos y de ratón ANO2 (mANO2). la actividad del canal CFTR se vio afectada sólo un poco por la idebenona. Se inhibió CFTR por 8,2 ± 0,2% a 30 mM, una concentración que inhibe completamente ANO1 (Fig 2D), pero, como es lógico, la idebenona inhibe fuertemente 100 M activación ATP inducida de mANO2 de una manera dependiente de la dosis en las células FTR-mANO2 ( Fig 2E). Se midió corrientes de membrana apical para observar el efecto de CoQ10 en la actividad del canal ANO1 en células FTR-ANO1 porque la idebenona es un análogo de cadena corta de CoQ10. Como se muestra en la figura 2F, 100 M CoQ10 no inhibió las corrientes de cloruro inducidas ANO1-ATP. Para investigar si la idebenona inhibe de forma reversible ANO1, que mide las corrientes de membrana apical en las células FTR-ANO1 con E
acto, un activador específico de ANO1. El pretratamiento de 100 M idebenona inhibe por completo E
activación ANO1 acto inducida (Figura 2G). Como se muestra en la Figura 2H, el pretratamiento de 100 M idebenona inhibe completamente la activación ANO1 inducida por ATP. Sin embargo, después de lavado, la mayor parte del efecto inhibidor de la idebenona sobre la activación ANO1 por E
se eliminó acto. Idebenona inhibe de forma reversible por lo tanto ANO1 sin alteraciones en la señalización intracelular de calcio
.
(A) Las corrientes de membrana apical se midieron en células FRT-ANO1. La idebenona se añadieron 10 min antes de la activación por ANO1 100 ATP M. (B) Resumen de dosis-respuesta (media ± S. E., n = 3-4). (C) la concentración de calcio intracelular se midió usando Fluo-4 en las células FRT HT-29 y. 30 M idebenona (IDE), miconazol (MCZ) y plumbagin (PLB) fueron pretratadas durante 20 minutos y luego se aplicó ATP 100 mM. (D) Efecto de la idebenona sobre la actividad del canal de cloruro CFTR se midió en las células FRT que expresan CFTR de tipo salvaje humano. CFTR se activó por 20 M de forskolina e inhibida por 10 M CFTR
inh-172. (E) Efecto de idebenona en ratón ANO2 (mANO2) se midió en las células FRT-mANO2. (F) Efecto de la Coenzima Q10 (CoQ10) en la actividad del canal ANO1 se observó en células FRT-ANO1. 100 M CoQ10 se trató previamente durante 20 minutos y luego se aplicó 100 ATP M. (Derecha) Resumen de la corriente de pico (media ± S. E., n = 3-4). (G) Efecto de la idebenona sobre la activación ANO1 por E
actuar en ANO1 células que expresan FRT. 100 M idebenona (línea gris) se trató previamente durante 20 minutos y se activó mediante ANO1 10 M E
acto. Las corrientes ANO1 restantes fueron inhibidos por T16A
inh-A01. (Derecha) Resumen de la corriente de pico (media ± S. E., n = 3). (H) La idebenona reversibilidad. Después de desvanecimiento de 100 M actual ANO1 ATP inducida, las células se lavaron tres veces durante 5 min cada uno y luego ANO1 se activó por 10 M E
acto. (Derecha) Resumen de la corriente de pico (media ± S. E., n = 3). ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, prueba t no pareada de los estudiantes.
patch clamp de célula entera en FRT-ANO1 y las células PC-3
En la figura 3, el análisis de patch clamp de célula completa se llevó a cabo para determinar los mecanismos de inhibición de la idebenona. En las células que expresan FRT ANO1, la aplicación de 10 M idebenona inhibe las corrientes de cloruro inducidas ANO1-ATP en todas las tensiones, que indica que tiene el efecto inhibidor a través de un mecanismo independiente del voltaje (Fig 3A). medición de patch clamp de corrientes de células enteras en PC-3 (adenocarcinoma de próstata humano deriva) las células que expresan alto nivel de ANO1 mostró que la idebenona a 10 mM y 30 mM inhibe ATP inducida por las corrientes de cloruro CaCCs de ~ 54% y ~ 90%, respectivamente (figura 3B).
(a) (izquierda)-células enteras actual ANO1 registrados a un potencial de mantenimiento a 0 mV y pulsante a los voltajes entre ± 80 mV (en pasos de 20 mV) en ausencia y presencia de 10 mM idebenona. ANO1 fue activado por 100 ATP M. (Centro) de corriente /voltaje (I /V) parcela de corrientes medias en el medio de cada impulso de tensión. (Derecha) Los gráficos de barras que resumen los datos de densidad de corriente medidos a + 80 mV (media ± S. E., n = 4). (B) (izquierda) patch-clamp grabaciones de células enteras de células PC3. corrientes CACC registraron en ausencia y en presencia de idebenona. CACC fue estimulada por ATP 100 mM. (Centro) de corriente /voltaje (I /V) parcela de corrientes medias en el medio de cada impulso de tensión. (Derecha) Los gráficos de barras que resumen los datos de densidad de corriente medidos a + 80 mV (media ± S. E., n = 4). ** P & lt; 0,01, prueba t no pareada de los estudiantes.
ANO1 inhibidores disminuyen la proliferación y migración celular en células de adenocarcinoma
Se probaron tres tipos de líneas celulares de adenocarcinoma humano para determinar el efecto de la idebenona en la actividad CaCCs endógenos y el crecimiento celular y la migración. Western Blot reveló que endógeno ANO1 se expresa en altos niveles en PC3 y CFPAC-1 células (adenocarcinoma ductal pancreático humano deriva) pero no en A549 (adenocarcinoma de pulmón humano deriva) células (Fig 4a). La fluorescencia YFP temple ensayo con células CFPAC-1 que expresan el haluro de detección mutante YFP reveló que la idebenona potentemente bloqueado la activación del canal de cloruro CACC inducida por ATP de una manera dependiente de la dosis (Fig 4B). Para investigar si los inhibidores ANO1 afectan el crecimiento celular, la idebenona, miconazol y plumbagina se aplicaron a las células PC3 que expresan altos niveles de ANO1 y células A549 no expresan ANO1. Los resultados se muestran en la figura 4C, y revelan que la idebenona inhibe significativamente el crecimiento celular en células PC3 pero no en células A549. Miconazol y plumbagin mostraron una fuerte inhibición del crecimiento celular tanto en células PC3 y A549, pero no fue sorprendente, ya que en varias investigaciones anteriores, se demostró que el miconazol y plumbagin inhibe el crecimiento celular de varias células cancerosas humanas a través de diferentes mecanismos [24-29] . El efecto de la inhibición ANO1 por idebenona sobre la migración celular se determinó usando un ensayo de curación de la herida en células PC3. En el ensayo, las células de control PC3 cubiertos 63,6 ± 2,5% (n = 5) de la herida, mientras que T16A
inh-A01 (30 M) y idebenona (10 y 30 mM) células tratadas cubiertos 39,6 ± 2,5, 26,1 ± 1,8 y 13,8 ± 0,8% (n = 5) de la herida a las 48 h post-herida, respectivamente (Fig 4D).
(a) inmunotransferencia de proteínas ANO1 en FRT-ANO1, PC3, CFPAC-1 y células A549. Se muestran los representantes de los tres grupos de estudios. (B) Efecto de la idebenona en CaCCs se midió en las células CFPAC-1 que expresan mutante sensible haluro YFP. CaCCs fueron activadas por 100 ATP M. células PC3 y A549 (C) se trataron con idebenona (30 mM), miconazol (30 M) y plumbagina (30 mM), y se midió la proliferación de células después de 2 días usando ensayos de MTS (media ± S.E., n = 6). (D) la curación de la herida de ensayo en células PC3. Las células fueron tratadas con T16A
inh-A01 (30 M) y la idebenona. (Izquierda) El cierre de la herida se cuantificó en cada 2 h post-herida (media ± S.E., n = 5). (Derecha) Imágenes representativas tomaron a las 0 horas y 48 horas después de la curación (× 10). ** P & lt; 0,01, prueba t no pareada de los estudiantes.
A fin de determinar el efecto de la idebenona sobre la proliferación celular, se observó la proliferación celular en respuesta a la idebenona usando el ensayo de MTS y ensayo de BrdU en el PC3, CFPAC-1 y células A549 (Figura 5). En este estudio, la coenzima Q10 se utilizó como control negativo porque no inhibe ANO1 /CaCCs a pesar de que la idebenona es un análogo sintético de la coenzima Q10 (Fig 2F). Las células fueron tratadas con idebenona (3, 10 y 30 mM), la coenzima Q10 (100 M) y T16A
inh-A01 (10 mM), y la proliferación de las células se estimó cuantitativamente después de 2 días. En PC3 y las células CFPAC-1, la idebenona inhibe la viabilidad celular y la incorporación de BrdU en una forma dependiente de la dosis, pero idebenona y T16A
inh-A01did no afecta a la viabilidad celular y la incorporación de BrdU en las células A549 (Fig 5A-5C). La coenzima Q10 no bloquear la proliferación celular en todas las líneas celulares. Regulación a la baja de ANO1 induce la apoptosis en varias líneas celulares de cáncer que sobreexpresan ANO1 [14, 16, 30]. Para investigar si la idebenona induce apoptosis en células que expresan ANO1, TUNEL tinción se realizó en las líneas celulares de adenocarcinoma. PC3, las células CFPAC-1 y A549 se incubaron con 30 mM idebenona durante 48 h, y a continuación, el daño del ADN se controló usando el ensayo de TUNEL. Se detectaron las células TUNEL positivas en células PC3 y CFPAC-1 pero no en células A549 (Fig 5D-5F).
(AC) PC3, las células CFPAC-1 y A549 se sembraron en placas de 96 pocillos, y después de 24 h de incubación, se trataron con las concentraciones indicadas de idebenona (IDE), 100 M de coenzima Q10 (Q10) y 10 mM T16A
inh-A01 (A01) en el ensayo de MTS. IDE (30 mM), la coenzima Q10 (100 M) y T16A
inh-A01 (10 M) se aplicaron a las células en ensayo BrdU. La proliferación celular se calcula después de 2 días a través de MTS (izquierda) o ensayo BrdU (derecha) (media ± S. E., n = 6). (D-F) PC3, las células CFPAC-1 y A549 fueron tratados con 30 mM idebenona. Las células se tiñeron con TUNEL (etiquetado desoxinucleótido transferasa terminal mediada dUTP nick-end, verde) y DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol, azul). Las barras de escala representan 20 micras. * P & lt; 0,05, prueba t no pareada de los estudiantes.
Discusión
ANO1, un CACC recientemente identificado, está fuertemente sobreexpresada en diversos tipos de tumores incluyendo CECC, GIST, de mama y de próstata. En particular, la evidencia reciente sugiere fuertemente la implicación ANO1 en la proliferación celular, la migración celular, la tumorigénesis y la progresión del cáncer [12, 13, 16, 31]. Varios estudios han indicado que ANO1 se puede usar como una diana terapéutica de los tumores porque la regulación hacia abajo de ANO1 mostró beneficios terapéuticos potenciales en HNSCC, CECA, GIST, de mama y cáncer de próstata [14, 16, 30, 32, 33]. Gracias a la reciente identificación de ANO1, algunos inhibidores de molécula pequeña ANO1 están disponibles, tales como CACC
inh-A01, ácido tánico, T16A
inh-A01, y MONNA [17, 19-21], pero la propiedad farmacológica y los mecanismos de acción de los inhibidores aún no están claros. En este estudio, se realizó un cribado basado en células para identificar inhibidores ANO1 novedosos con una colección de medicamento como compuestos y productos naturales. Curiosamente, descubrimos que la idebenona inhibe fuertemente ANO1.
La idebenona [2,3-dimetoxi-5-metil-6- (10-hidroxidecil) -21,4-benzoquinona] es una benzoquinona cadena corta sintética como una análogo de la ubiquinona (coenzima Q10). Idebenona está siendo investigado actualmente para el tratamiento de una serie de enfermedades mitocondriales y neuromusculares, como la ataxia de Friedreich (FRDA), encefalopatía mitocondrial con acidosis láctica y episodios (MELAS) derrame cerebral similar y la distrofia muscular de Duchenne (DMD), debido a su capacidad para servir como un transportador de electrones en la cadena de transporte de electrones mitocondrial y su potente actividad antioxidante. efectos clínicos beneficiosos de la idebenona se han reportado en los pacientes tratados con idebenona con Ataxia de Friedreich (300-2250 mg /día; 0,5-5 años), MELAS (90-270 mg /día; 163 días) y DMD (450 mg /día; 12 meses) [34-36]. Además, los resultados de grandes ensayos clínicos mostraron que la idebenona fue segura y bien tolerada [37, 38].
Hemos demostrado que la idebenona inhibe potentemente la actividad ANO1 en el ensayo de extinción de la fluorescencia YFP (Figura 1C) y los estudios electrofisiológicos ( Figs 2A y 3A). Para averiguar si la actividad antioxidante y de electrones portador de idebenona afecta a la función del canal ANO1, se observó el efecto de CoQ10 en la actividad del canal ANO1 porque idebenona y CoQ10 comparten el mismo patrón de sustitución del resto quinona y sólo se diferencian en la cola alquilo unido al C6 átomo-carbono de su anillo de quinona. Como se muestra en la figura 2F, el pretratamiento de 100 M CoQ10 ligeramente (pero no significativamente) aumentó corrientes ANO1 en lugar de la inhibición de las corrientes inducidas ANO1-ATP en ANO1 que expresan células FRT. Además, CoQ10 no bloqueó la viabilidad celular y la proliferación de varias líneas celulares que expresan ANO1 (Fig 5), y la idebenona no afectó CFTR y la señalización de calcio intracelular (Figura 2C y 2D). En conjunto, los resultados anteriores sugieren que el mecanismo de acción de la idebenona sobre la inhibición ANO1 puede ser directa en lugar de a través de su capacidad antioxidante y portador de electrones. Todavía hay una posibilidad de que la idebenona afectar a la proliferación celular y la apoptosis a través de las otras vías. Sin embargo, la idebenona mostró una potente inhibición de ANO1 y la proliferación celular en las células que expresan ANO1, y un inhibidor específico ANO1 T16A
inh-A01 mostró respuesta similar en la proliferación celular (Fig 5). Este resultado sugiere que la idebenona inducida por la inhibición ANO1 es al menos parcialmente implicado en el efecto citotóxico de la idebenona. En la figura 4D, mostramos que la fuerte inhibición de la migración de las células en un área de la herida por la idebenona. En ensayo de curación de la herida, se utilizaron medios de cultivo celular libre de suero para reducir el crecimiento de las células debido a que tanto la proliferación celular y la migración afectan a la tasa de cicatrización de heridas. privación de suero dio como resultado la inhibición del crecimiento ~ 54% (datos no mostrados) y el efecto inhibidor de la idebenona sobre la curación de la herida era más fuerte que la de la idebenona sobre la proliferación celular (Figs 4D y 5A). Estos resultados sugieren que la idebenona inhibe la migración celular a pesar de que la inhibición del crecimiento por la idebenona puede afectar el resultado.
En el ensayo clínico, los pacientes han sido tratados con idebenona hasta 2.250 mg /día.