renal
Extracto
Antecedentes
miR-23b se encuentra en el cromosoma 9 y desempeña diferentes papeles en diferentes órganos, especialmente con respecto al desarrollo del cáncer. Sin embargo, no se ha informado de la importancia funcional de miR-23b-3p en el carcinoma de células renales (CCR).
Métodos y Resultados
midieron los niveles de miR-23b-3p en 29 pares de El carcinoma de células renales y sus tejidos normales emparejados utilizando PCR en tiempo real. El nivel de expresión de miR-23b-3p se correlacionó con la tasa de supervivencia a los 5 años de los pacientes con cáncer renal. En 15 casos (52%), se encontró que la expresión de miR-23b-3p a ser alta. Todos los pacientes con moderada a baja expresión de miR-23b-3p sobrevivieron 5 años, mientras que aquellos con alta expresión de miR-23b-3p, sólo el 50% sobrevivió. Después de eliminar a la expresión de los genes miARN-23b-3p en líneas celulares de RCC, hubo una inducción de la apoptosis y reduce las capacidades invasivas. MiR-23b-3p se demostró que apuntar directamente gen PTEN a través de ensayos de reportero 3'UTR. La inhibición de miR-23b-3p induce la expresión del gen PTEN con una reducción concomitante de la PI3-quinasa, Akt total y IL-32. La inmunohistoquímica mostró la falta de expresión de la proteína PTEN en regiones cancerosas de muestras de tejido, donde la expresión de miR-23b-3P era alta. Se estudió la
in vitro
efectos de la quimioterapia en la dieta agente de prevención de la genisteína sobre la expresión de miR-23b-3p y encontramos que inhibe la expresión de miR-23b-3p en líneas celulares de RCC.
Conclusiones
El presente estudio muestra que el miR-23b-3p es un miARN oncogénico e inhibe el gen supresor de tumores PTEN en el CCR. Por lo tanto, la inhibición de miR-23b-3p puede ser una diana terapéutica útil para el tratamiento del carcinoma de células renales
Visto:. Zaman MS, Thamminana S, V Shahryari, Chiyomaru T, G Deng, Saini S, et Alabama. (2012) La inhibición de PTEN de la Expresión Génica por Oncogénicos miR-23b-3p en el cáncer renal. PLoS ONE 7 (11): e50203. doi: 10.1371 /journal.pone.0050203
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Agosto, 2012; Aceptado: 17 de octubre de 2012; Publicado: 26 Noviembre 2012
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Revista Mérito VA, VA Proyecto de Programa y Subvenciones del NIH RO1CA130860 (PI: R. Dahiya). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
miRNAs se han demostrado estar involucrados en diversas enfermedades renales [1]. miR-23b se encuentra en el cromosoma número 9 en un clúster con miR-27b y miR-24-1 [2]. Se ha demostrado que desempeñan diferentes funciones en diferentes órganos, especialmente en relación con el desarrollo del cáncer. En cánceres como el de vejiga y carcinoma de células escamosas oral de [3] - [4] se ha demostrado que es sobreexpresado. En el cáncer renal miR-23b-5p actúa como un potencial oncomir suprimiendo prolina oxidasa, que es una nueva proteína supresora de tumores [5]. Mientras que en el cáncer de próstata [6], que desempeña el papel de un gen supresor tumoral microARN, ya que está dirigido por el factor de transcripción oncogénica de c-myc. Esto finalmente da como resultado un aumento en la expresión de la proteína de la glutaminasa mitocondrial enzima pro-canceroso, que es un objetivo para miR-23b [7]. En el cáncer de mama se ha demostrado que ser regulada hasta con miR-27b y miR-24-1 por el factor de transcripción oncosuppressor ERβ [8]. Del mismo modo, en el carcinoma hepatocelular que actúa como un supresor de tumores por la orientación del activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) y c-met que resulta en la migración disminuido y la proliferación de células de HCC [9]. En el cáncer de colon que funciona en la supresión de la metástasis del cáncer de dirigir genes prometastatic FZD7 o MAP3K1 [10].
En este estudio, hemos examinado el papel de miR-23b-3p en el carcinoma renal de células claras. Hemos encontrado que la expresión de miR-23b-3p se incrementó en líneas de células Caki-2 A-498 y y una mayoría de muestras de tejido. El aumento de expresión también se correlacionó con una menor tasa de supervivencia para los pacientes con carcinoma de células renales. La inhibición de la expresión de miR-23b-3p en A-498 y Caki-2 células provocó un aumento de la apoptosis y una disminución de las propiedades invasivas. Se encontró expresión de la proteína PTEN que aumentarse después de eliminar a miR-23b-3p en las células A-498, con la consecuente disminución de la expresión de PI3-quinasa, Akt total y la IL-32. El gen PTEN se demostró que era un objetivo directo de miR-23b-3p 3 'por los ensayos de reportero de luciferasa. La inmunohistoquímica mostró la falta de expresión de la proteína PTEN en las regiones cancerosas de muestras de tejido donde la expresión de miR-23b-3p era alta.
Resultados
miR-23b-3p es regulada hasta en carcinoma renal las muestras de tejidos y líneas celulares de cáncer renal
Para comprender la relevancia clínica de miR-23b en el cáncer de riñón que mide los niveles de miR-23b-3p en 29 pares de cánceres de riñón humano (todo de células claras carcinoma de células renales) y emparejados tejidos normales por PCR en tiempo real. En 15 casos (52%), se encontró que miR-23b-3p ser aumentado (T /N [Tumor /Normal] fue mayor que 1,2). En 5 muestras (17%) la expresión fue moderada (T /N 0,8-1,2). La expresión de miR-23b-3p también se mide en líneas celulares de cáncer renal cultivadas,, ACHN, Caki-1, Caki-2 y no malignas HK-2 células 498-A normales. expresión miR-23b-3p en células A-498 fue de aproximadamente 11x la de las células HK-2 mientras que la de ACHN fue 4.1x, Caki-1 4,8x, y Caki-2 5.8x (Figura 1).
a) Ratio de expresión T /N en muestras de tejido se encontró que era alta en la mayoría de las muestras. B) Las células A-498 y Caki-2 tenían una alta expresión de miR-23b-3p, en comparación con las células no malignas normales HK-2 (T-tumorales, N-Normal), [valor de p (A) 0.032; valor de p (B) 0.018)].
correlación entre la expresión de miR-23b-3p con la supervivencia en el cáncer renal
El nivel de expresión de miR-23b-3p correlacionada con 5 años la supervivencia de los pacientes. Para aquellos pacientes con moderada a baja expresión de miR-23b-3p (n = 12) (Figura 2), todos sobrevivieron 5 años después de la cirugía, mientras que aquellos con alta miR-23b-3p (n = 12) la expresión, sólo el 50% sobrevivió (Figura 2). La curva de supervivencia se basa en el número de pacientes (24) para los que teníamos información de supervivencia de un total de 29 pacientes. No se observó ninguna correlación entre el grado del tumor, el estadio y los niveles de miARN-23b-3p.
papel funcional de miR-23b-3p en células A-498
Para dilucidar el papel funcional de miR-23b-3p en el cáncer renal derribaron la expresión de miR-23b-3p en Caki-2 células de cáncer renal a-498 y con un inhibidor de miR-23b-3p disponible en el mercado. Control anti-miR-Negativo#1 también se utilizó para estos experimentos. El nivel de miR-23b-3p se redujo en más de un 99%, en comparación con el control negativo en las células A-498 (Figura 3a). transfección anti-miR-23b-3p en Caki-2 células también redujo el nivel de expresión de miR-23b-3p en estas células (Figura 3b).
La expresión de miR-23b-3p se redujo en más de 99% después de su inhibición en ambos a-498 (a) y células Caki-2 (B).
efecto en el ciclo celular y apoptosis
Los efectos de miR-23b- 3p tumbar sobre el ciclo celular y la apoptosis se analizaron por citometría de flujo. ensayo de apoptosis mostró un aumento significativo en el número de células apoptóticas totales (temprano de apoptosis más apoptóticas) tanto en A-498 (8,87%) (Figura 4a) y las células Caki-2 (11,74%) (Figura 4B) con miR-23b- 3p derribar el mayor en comparación con el control negativo [a-498 (3,37%) y Caki-2 (3,68%)]. No hubo cambios significativos en el ciclo celular para ambas células A-498 y Caki-2 (datos no mostrados).
A) ensayo de apoptosis mostró un aumento significativo en el número de células apoptóticas totales (8,87%) en el anti-inhibidor de miR-23b-3p células transfectadas en comparación con el control negativo (3,37%) en las células a-498 (valor p 0,029). B) En Caki-2 células el número total de células apoptóticas (11,74%) en el inhibidor de anti-miR-23b-3p células transfectadas en comparación con el control negativo (3,68%) (valor p 0,030).
Efecto sobre la invasión celular y la migración Propiedades
Para determinar si miR-23b-3p afecta a la migración celular y la invasión del cáncer renal una cytoselect de 24 pocillos se utilizó la migración celular y la invasión kit. A-498 y Caki-2 células fueron transfectadas con inhibidor anti-miR-23b-3p y el control anti-miR-Negativo. Tanto A-498 y Caki-2 células mostraron una disminución del 30% en la invasión de células en las muestras en las que miR-23b-3p se inhibió en comparación con los controles negativos (Figura 5a y 5b). No se observó ningún cambio significativo en la migración tanto en las células A-498 y Caki-2 (datos no mostrados).
propiedades invasivas de las células Caki-2 (B) A-498 (A) y se redujeron en un 30 % después de miR-23b-3p derribar en comparación con los controles. Eje Y-absorbancia a 560 valor de p [nm (A) 0.026; valor de p (B) 0.030].
PTEN se incrementó después de tumbar de miR-23b-3p en células A-498
Para ver el efecto de miR-23b-3p expresión de diferentes genes implicados en la apoptosis y la invasión se comprobó la expresión de la proteína de varios genes implicados en estos procesos. Se encontró que el gen PTEN apoptótica pro ser regulada hasta después de miR-23b-3p tumbar en las células A-498 (Figura 6A). También se encontró una disminución en los niveles de proteína de la PI3-quinasa y Akt total. Curiosamente, una disminución en la expresión de la pro IL32 citoquina inflamatoria también se observó después de miR-23b-3p derribar. Los niveles de expresión de proteína se cuantificaron por densitometría óptica usando ImageJ Software versión 1.36b (http://rsb.info.nih.gov/ij/). (Muestras de Anti-miR-23b-3p transfectadas /GAPDH) veces el cambio se calculó como la relación entre la intensidad neta de cada muestra transfectadas con anti-miR-23b-3p dividido por GAPDH y las muestras de control transfectadas negativos dividido por el GAPDH /(Neg control de miR transfectaron muestras /GAPDH) (Figura 6B).
a) La expresión de PTEN, PI3-quinasa, Akt y la IL-32 en células a-498, en comparación con el control negativo. GAPDH se utilizó como un control de normalización. B) Los datos cuantitativos para el análisis de Western blot. PTEN fue hasta regulado, mientras que la PI3-quinasa, Akt y la IL-32 expresión se regula por disminución.
PTEN es un objetivo directo de miR-23b-3p
Desde un aumento significativo en la apoptosis se observó en ambos a-498 y Caki-2 células y el aumento de la expresión de PTEN en las células a-498 después de miR-23b-3p tumbar, miramos para ver si miR-23b-3p dirige el gen PTEN pro apoptótica. Usando TargetScan (targetscan.org) y microrna.org hemos identificado las secuencias complementarias a miR-23b en el 3'UTR del gen PTEN (Figura 7). Hemos llevado a cabo ensayos de reportero de luciferasa utilizando un 3'PTEN construir con miR-23b-3p o miR-Control-expresando células A-498 y observó una reducción constante de la actividad de la luciferasa (Figura 7b) en transfectantes de miR-23b-3p lo que sugiere que el miR -23b-3p reprime directamente PTEN.
a) análisis de Software muestra secuencias complementarias a las secuencias de semillas de miR-23b-3p en el gen 3 'UTR de PTEN. B) Ensayo de la luciferasa mostró una disminución en las unidades relativas de luciferasa en muestras de co transfectadas con miR-23b-3P era y PTEN 3 'construcción génica UTR en comparación con el control de los constructos (control Con-negativo Neg; Con-Control de plásmido constructo carece de PTEN 3' UTR sitios de miR-23b-3p; PTEN-PTEN plásmido constructo que tiene sitios 3'UTR del gen PTEN para miR-23b-3p;. (valor p 0,017) guía empresas
Expresión de la proteína PTEN en condiciones normales y regiones de cáncer de muestras de tejidos que tienen una alta expresión de miR-23b-3p
para confirmar aún más que PTEN es un objetivo de miR-23b-3p una inspección para detectar la expresión de la proteína PTEN en las regiones normales y el cáncer de tejido del paciente se seleccionaron muestras que tenían una alta expresión de miR-23b-3p, mediante inmunohistoquímica (IHC). Diez muestras con alta expresión de miR-23b-3p. un ejemplo representativo de PTEN inmunohistoquímica se muestra en la Figura 8A.
A) Representante imágenes de inmunohistoquímica (IHC) analiza. B) Representación gráfica de los datos que muestran que la expresión de PTEN fue alta en las regiones normales de muestras de pacientes con cáncer renal mientras que en las regiones cancerosas no se observó con una expresión de alto miR-23b-3p PTEN.
IHC resultados de la tinción para tejidos se clasifican de acuerdo a la puntuación rápida (porcentaje de células teñidas × intensidad de la mancha). El marcador rápida obtenida a partir de las muestras de tumor se normalizó con la puntuación más rápido de sus muestras normales (T /N) y la prueba de Chi-cuadrado se realizó con los niveles de expresión de miR-23b-3p en las mismas muestras de pacientes (Figura 8B). Todas las muestras normales expresan la proteína PTEN aunque a niveles variados. tinción de PTEN estuvo ausente de las muestras de tumores que expresan altos niveles de miR-23b-3p (p & lt; 0,001). (Figura 8B)
La genisteína disminuye la expresión de miR-23b-3p en células A-498
también examinó el efecto del agente de quimioprevención, la genisteína (un producto de soja), sobre la expresión de miR-23b-3p en las células a-498. El tratamiento con genisteína (25 M) durante 96 horas disminuyó la expresión de miR-23b-3p en un 50%, mientras que una mayor concentración de genisteína (50 M) para el mismo período de tiempo disminuyó la expresión en un 45% (Figura 9).
expresión de miR-23b-3p se redujo en un 50% en 25 mM genisteína tratados células a-498 en comparación con las células no tratadas, 50 mM genisteína disminución de la expresión de miR-23b-3p en un 45% (valor p 0,030).
Discusión
El presente estudio muestra que las funciones de miR-23b-3p como un microRNA oncogénicos en el carcinoma de células renales. Su expresión está aumentada en líneas celulares de carcinoma de células renales y muestras de tejido (carcinoma de células claras) en comparación con células renales normales y los tejidos normales emparejados, respectivamente. Además, encontramos que los altos niveles de plomo miR-23b-3p para reducir la supervivencia en pacientes con cáncer renal. Para estudiar el papel funcional de miR-23b-3p su expresión fue derribado en Caki-2 líneas celulares de cáncer renal A-498 y. Esto condujo a un aumento en el número total de células en proceso de apoptosis en ambas líneas celulares en comparación con los controles. Sin embargo, no hubo ningún cambio significativo en el ciclo celular. Además A-498 y Caki-2 células mostraron una disminución de la invasión de células de miR-23b-3p derribados células, pero ningún cambio significativo en la migración. El análisis de Western de miR-23b-3p tumbar mostró un incremento en la expresión de PTEN y la consiguiente disminución en la expresión de PI3-quinasa, Akt y la IL-32. PTEN se encontró que era un objetivo directo de miR-23b-3p través de ensayos de gen reportero.
El cambio significativo en el número de células apoptóticas después de tumbar de miR-23b-3p tanto en A-498 y Caki células -2 nos llevan a buscar genes y vías de señalización implicadas en la apoptosis. Estudios anteriores han demostrado que PTEN puede inducir la apoptosis a través de una vía dependiente de PI3-quinasa [11]. PTEN actúa como un gen supresor de tumor a través de la acción de su producto de la proteína fosfatasa [12], degradando PIP3 a inactivo fosfatidilinositol (4,5) PIP2 -diphosphate [13], [14]. Esto a su vez regula negativamente la vía PI3K favor de la supervivencia de señalización /Akt. La vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) regula diversos procesos celulares, incluyendo la proliferación, el crecimiento, la apoptosis y la reorganización del citoesqueleto. PI3Ks son quinasas de lípidos heterodiméricas que se componen de subunidades reguladoras y catalíticas codificadas por diferentes genes [15]. Una de las funciones principales de PI3K es sintetizar los segundos mensajeros PtdIns (3,4,5) P3 (PIP3) de PtdIns (4,5) P2 (PIP2). AKT, una quinasa serina /treonina que tiene una amplia gama de sustratos, se activa por reclutamiento hacia la membrana plasmática a través del contacto directo de su pleckstrin-homología (PH) de dominio con PIP3, y la fosforilación en Thr308 y Ser473. AKT actúa aguas abajo de PI3K para regular muchos procesos biológicos, como la proliferación, la apoptosis y el crecimiento, sino que también se conocen otras vías de señalización que se rige por la actividad de PI3K y podría estar implicado en la tumorigénesis mediada por PI3K. PTEN es uno de los genes supresores de tumores más comúnmente perdidas en el cáncer humano. Durante el desarrollo de tumores, las mutaciones y deleciones de PTEN se producen, que desactivan su actividad enzimática que conduce a un aumento de la proliferación celular y la reducción de la muerte celular. la inactivación genética frecuente de PTEN se produce en glioblastoma, cáncer endometrial, cánceres de la próstata; y reducción de la expresión se encuentra en muchos otros tumores como el de pulmón y el cáncer de mama [15]. En este estudio de análisis de Western también mostraron una disminución en la expresión de IL-32 después de la inhibición de miR-23b-3p en células A-498. No se realizaron controles de IL-32 en los medios de cultivo. IL-32 es una citocina y su papel pro-canceroso se ha documentado en varios estudios [16], [17], [18]. La vía de la PI3-quinasa se ha demostrado que induce IL-32 expresión en una serie de estudios [19], [20], [21], [22], especialmente en el cáncer de páncreas, donde se ha establecido su papel canceroso pro-. Por lo tanto, estos estudios sugieren que la razón de la disminución de la IL-32 expresión en tumbar de miR-23b-3p es que también afecta a la expresión de PI3-quinasa y Akt. Una búsqueda de software para sitios en la PI3-quinasa y Akt unión de miR-23b-3p se llevaba a cabo sin embargo, no se encontró ninguna evidencia de que la PI3-quinasa y Akt son blancos directos de miR-23b-3p.
La genisteína (40,5,7-trihidroxiflavona), una de las principales isoflavonas de soja, tiene una amplia gama de acciones quimiopreventivos. Los efectos contra el cáncer de la genisteína se han atribuido a varias vías de señalización y mecanismos que afectan a la detención del ciclo celular, apoptosis, invasión, metástasis y la angiogénesis, atributos que podría prevenir potencialmente la iniciación del tumor y la progresión [23], [24]. La genisteína es abundante en los productos de soja y se ha identificado como un inhibidor de la proteína tirosina quinasas y por lo tanto puede jugar un papel clave en el crecimiento celular y la apoptosis [25], [26]. Se ha informado de que tienen propiedades estrogénicas y la actividad anti-neoplásica en múltiples tipos de tumores [27]. En un estudio previo Hillman et. Alabama. han demostrado que la combinación de la genisteína con irradiación del tumor primario actúa eficazmente como un enfoque terapéutico, en tumores renales establecidos, debido al crecimiento del tumor se inhibió tanto a los sitios primarios y metastásicos. En su estudio de la genisteína sola tenía una tendencia a estimular el crecimiento del tumor renal primaria y aumentar la metástasis [28]. Por lo tanto nos estos hallazgos llevaron a controlar la expresión de los genes miARN-23b-3p después del tratamiento de células A-498 con diferentes concentraciones de genisteína. Encontramos una disminución del 50% en la expresión de miR-23b-3p después del tratamiento de células A-498 con 25 mM genisteína para 96 horas (Figura 8). En un estudio previo [29] también informó de una disminución de la expresión de miR-21 en xenoinjertos de tumores de ratón formado después de la inyección de 25 M genisteína trataron células A-498 por vía subcutánea en ratones desnudos en comparación con los tumores más pequeños formados por células A-498 no tratadas. También se midió la expresión de miR-23b-3p en aquellos tumores y no pudimos encontrar ningún cambio significativo en su expresión.
En resumen, el miR-23b-3p es un oncogén en el RCC e inhibe directamente el tumor PTEN gen supresor. Por lo tanto miR-23b-3p puede ser útil como un marcador de diagnóstico del cáncer renal, y como una diana terapéutica para el tratamiento del carcinoma de células renales.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
fijado en formol (FFPE) muestras de cáncer renal incluidas en parafina se obtienen a partir de los Asuntos de Veteranos de San Francisco (VA) Medical Center. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Humana de la UCSF (Número de autorización: H9058-35751-01).
Líneas celulares y cultivo celular
renales humanas líneas celulares de cáncer a-498, ACHN, Caki-1, Caki-2, y una línea celular renal normal (HK-2) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Integridad de las líneas de células fue confirmada por la ATCC utilizando ADN de perfiles (STR). renales HK-2 Las células normales se cultivaron como una monocapa en queratinocitos medio libre de suero (K-SFM) complementado con 0,05 mg /ml de extracto de pituitaria bovina (BPE), 5 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF) (Life Technologies /Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), suero bovino fetal al 10% (Atlanta Biológicos, Lawrenceville, GA, EE.UU.), 50 mg /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las líneas celulares de cáncer renal A-498 y ACHN fueron cultivadas como una monocapa en medio esencial mínimo de Eagle, (UCSF Fondo para el cultivo celular, San Francisco, CA, EE.UU.). Caki-1 y Caki-2 se cultivaron de la misma manera en los medios McCoy's5A (UCSF Fondo para el cultivo celular, San Francisco, CA, EE.UU.). Todas las líneas celulares se mantuvieron en una incubadora con una atmósfera humidificada de CO2 del aire y 5% 95% a 37 ° C.
Genistein tratamiento de células A-498
células A-498 (60 -70% de confluencia) se trataron con genisteína (25 mM y 50 mM). La genisteína (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, EE.UU.) se disolvió en DMSO, y las células tratadas con vehículo (DMSO) sirvió como control. genisteína se administró fresca todos los días con un cambio de medio, y las células se incubaron durante 4 días.
Cuantitativo PCR en tiempo real
En la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR), ADN complementario fue amplificado con el inventario de genes Análisis de los productos que contiene dos cebadores específicos de genes y una sonda MGB TaqMan (6-FAM marcado con colorante) usando una mezcla maestra rápido TaqMan PCR universal en un sistema 7500 Fast real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA , ESTADOS UNIDOS). Ciclos térmicos condiciones incluyen 95 ° C durante 20 segundos (s), 40 ciclos de 95 ° C durante 3 segundos y 60 ° C durante 30 años de acuerdo con el protocolo Fast PCR Universal TaqMan. Micro RNA total fue extraído utilizando un kit de Qiagen miRNeasy (Valencia, CA, EE.UU.). Por miARN experimentos en tiempo real de la cadena de cDNA fue sintetizado utilizando un kit de Applied Biosystems TaqMan MicroARN transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), con 200 ng del total extraído miARN. RNU48 se utilizó como control endógeno. También se utilizó como control endógeno para en tiempo real PCR experimentos, en los que los miRNAs se aislaron a partir de muestras renales fijado en formol e incluidos en parafina (FFPE). MiARN total fue extraído de muestras FFPE utilizando un kit de Qiagen miARN FFPE.
Micro Disección de cáncer renal tejidos y extracción de RNA de muestras de tumores renales humanas FFPE
tejidos renales normales y cancerosas adyacentes se obtuvieron de 29 bloques representativos de tejido FFPE muestras de nefrectomía radical del Departamento de Patología de los Asuntos de Veteranos (VA) Medical Center de San Francisco. Los bloques eran de pacientes con cáncer de riñón que fueron operados en el Centro Médico VA entre 1980-2009. Se prepararon secciones (4 m) de los bloques, H & amp; E manchadas, y las diapositivas fueron revisados por un patólogo certificado por la junta para marcar las áreas normales y cancerosas. Posteriormente, 12 micras portaobjetos se hacen de los bloques y micro disección se ha realizado mediante la H & amp marcado; E portaobjetos teñidos como plantilla. extracción de microARN se realizó utilizando un kit de extracción de Qiagen FFPE miARN. Los niveles de miR-23b-3p se evaluaron mediante el ensayo de Taqman de miR como se describe anteriormente. Después de la PCR, relativos miR-23b-3p niveles de expresión en las regiones cancerosas se normalizaron a sus contrapartes normales adyacentes.
La transfección celular
células A498 y Caki-2 fueron transitoriamente transfectadas con cualquiera de los genes miARN-23b -3P inhibidor (
mir
Vana® miARN inhibidores de Applied Biosystems, Ensayo de identificación. MH10711) o anti-MIR control negativo#1 (de Ambion, Austin, TX, EE.UU. Catálogo no. AM17010), usando X- reactivo de transfección tremeGENE siRNA (Roche Diagnostics Indianapolis, IN, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) 24 h antes de la transfección y transfectadas transitoriamente en una confluencia del 40-50%. transfección Mock, con el reactivo de transfección, también se utilizó como control. La mezcla de transfección se disolvió en medio libre de suero Opti-MEM (UCSF Fondo para el cultivo celular, San Francisco, CA, EE.UU.) y en el momento de la transfección las células fueron sembradas en esencial (instalación de cultivo celular UCSF) de Eagle Mínimo Medio, con un 10% FBS (Atlanta Biológicos, Lawrenceville, GA, EE.UU.) y sin antibióticos. Al día siguiente se cambió el medio a de Eagle medio esencial mínimo que contiene tanto FBS y 1% de antibióticos (penicilina-estreptomicina, 100x, UCSF Cell Culture Facility). Las células se sedimentaron después de 72 h de transfección para citometría de flujo, ARN y la extracción de proteínas.
Análisis de Ciclo Celular
El análisis del ciclo celular se realizó 72 h después de la transfección. Las células se recogieron, se lavaron con PBS frío, (UCSF Cell Culture Facility), y se resuspendieron en la mancha nuclear 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (Beckman Coulter, Brea, CA, EE.UU.). Las células teñidas se analizaron inmediatamente con un citómetro de flujo (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).
Ensayo de apóptosis
En la apoptosis, las células a las 72 h después de la transfección se doble tinción con el colorante de viabilidad 7 amino-actinomicina D (7-AAD) y Anexina V-FITC usando un V-FITC kit Anexina /7-amino-actinomicina D (Beckman Coulter) según el protocolo del fabricante. Las células teñidas se analizaron inmediatamente por citometría de flujo (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).
migración y la invasión ensayos
Un cytoselect la migración celular y la invasión kit de ensayo de 24 pocillos (Cell Biolabs, Inc ., San Diego, CA) fue utilizado para los ensayos de migración y la invasión a las 72 horas después de la transfección (8 micras, formato colorimétrico) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Análisis Western
extractos de células enteras se prepararon en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA; Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU., 50 mmol l-1 Tris (pH 8,0), 150 mmol l-1 de NaCl, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS y 1,0% NP-40) que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche, Basilea, Suiza). los ensayos de proteínas se realizaron utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. La proteína total (40 g) se sometió a electroforesis en 12% geles de SDS-PAGE, y la transferencia Western se llevó a cabo utilizando protocolos estándar y las proteínas detectadas por quimioluminiscencia. Los anticuerpos, incluyendo PTEN (cat. No. 9552S) y Akt (cat. No. 4691S) fueron adquiridos de Señalización Celular (Danvers, MA, EE.UU.), PI3-quinasa (no. Ab69870) e IL-32 (no. ab62580) eran de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.), mientras que GAPDH (cat. no. sc-32233) era de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.).
La proteína se cuantificaron los niveles de expresión por densitometría óptica usando ImageJ Software versión 1.36b (http://rsb.info.nih.gov/ij/). (Muestras de Anti-miR-23b-3p transfectadas /GAPDH) veces el cambio se calculó como la relación entre la intensidad neta de cada muestra transfectadas con anti-miR-23b-3p dividido por GAPDH y las muestras de control transfectadas negativos dividido por el GAPDH /(Neg control de miR transfectaron muestras /GAPDH).
luciferasa reportero de ensayo
Las células en placas de 24 pocillos se transfectaron con 30 nM de control pre-MIR negativo (CN) o pre-miR-23b -3P (Applied Biosystems) y construcción de PTEN (nº de catálogo. HmiT015535, Genecopoeia, Rockville, MD, EE.UU.) o el control de la construcción, pEZX-MT01 (Genecopoeia) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La construcción de control carecía de sitios diana de miR-23b-3p. Todos los experimentos de transfección se realizaron por triplicado. La actividad de luciferasa se ensayó a las 48 h después de la transfección, usando un sistema de ensayo de indicador Dual-Luciferase (Promega).
Inmunohistoquímica
La inmunotinción se realizó en portaobjetos de tejido de cáncer renal [hechos de fija-formalina, embebidos en parafina (FFPE bloques de tejido) con cáncer de células renales utilizando un microtomo (Leica)]. Las diapositivas se deparaffinized y la recuperación de antígeno se llevó a cabo en el microondas en las diapositivas /L de tampón de citrato de sodio 10 mmol. Los portaobjetos se incubaron durante la noche con anticuerpo anti-PTEN (señalización de la célula). La tinción se realizó utilizando el LabVision Corporation (Thermo Fisher Scientific) Sistema de tinción anti-conejo (RHD mucho-80924) según las instrucciones del fabricante.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis estadístico utilizando Statview versión 5.0 para Windows. Se utilizó la prueba t de Student para comparar los diferentes grupos. valores de p de & lt; 0,05 se consideraron como estadísticamente significativas. Se realizó la prueba de Chi-cuadrado para determinar la correlación entre los niveles de expresión de miR-23b-3p y PTEN niveles de expresión de proteínas en muestras de tejido.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Roger Erickson de apoyo y asistencia con la preparación del manuscrito.