Extracto
El phosphatidylinositide-3-quinasa (PI3K) vía de señalización es fundamental para múltiples funciones celulares incluyendo el metabolismo, la proliferación, angiogénesis, y apoptosis, y es la vía más comúnmente alterado en los cánceres humanos. Recientemente, hemos desarrollado un novedoso modelo de ratón de cáncer de colon en los que los tumores se inician por una PI3K activa dominante (
FC PIK3CA *
). Los tipos de cáncer en estos ratones son moderadamente diferenciados adenocarcinomas mucinosos invasivos del colon proximal que se desarrollan en 50 días de edad. Curiosamente, estos cánceres se forman sin la señalización de Wnt aberrante intermediario o benigno, lo que indica un mecanismo no canónica de la tumorigénesis. Dado que estos tumores dependen de la vía PI3K, se investigó el potencial para la respuesta tumoral por la orientación de esta vía con la rapamicina, un inhibidor de mTOR. Una cohorte de
FC PIK3CA * ratones
fueron tratados con rapamicina a una dosis de 6 mg /kg /día o placebo durante 14 días. FDG PET /CT híbrido de doble demostró una respuesta tumoral dramático en el brazo de la rapamicina y esto fue confirmado en la necropsia. El tejido del tumor restante después del tratamiento con rapamicina demostró un aumento pERK1 /2 o persistente proteína ribosomal S6 fosforilado (PS6), lo que indica posibles mecanismos de resistencia. Este modelo único será mejorar nuestra comprensión de las enfermedades humanas y facilitar el desarrollo de la terapéutica farmacológica a través de la identificación y detección de biomarcadores
Visto:. Deming DA, Leystra AA, Farhoud M, L Nettekoven, Clipson L, Albrecht D, et Alabama. (2013) La inhibición de mTOR provoca una respuesta dramática en los cánceres de colon dependiente de PI3K. PLoS ONE 8 (4): e60709. doi: 10.1371 /journal.pone.0060709
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Octubre, 2012; Aceptado: March 1, 2013; Publicado: 9 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Deming et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El proyecto fue apoyado por la Fundación conquistar el cáncer de la Sociedad Americana de Oncología clínica a través de un Young Investigator Award (al DAD); el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos a través de T32 CA009614 (al DAD), P50 CA095103 Programa Especializado gastrointestinal de Investigación beca de excelencia, Vanderbilt Ingram Centro de Cáncer), R01 CA123438 (a RBH), CA014520 P30 (Core Grant, Universidad de Wisconsin (UW) Carbone Centro del cáncer); y puesta en marcha de fondos (a RBH) de la División de UW de Gastroenterología y Hepatología, del Departamento de Medicina de la Universidad de Washington, y la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington y la salud pública. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el desarrollo de terapias dirigidas para el tratamiento del cáncer ha sido un tema de gran interés y esfuerzo. Hasta hace poco, las nuevas terapias dirigidas se han estudiado en las poblaciones en gran parte no seleccionados. eficacia Limited se ha demostrado utilizando este enfoque. Sin embargo, a medida que evolucionamos más cerca de una era de la medicina personalizada, cada subtipo histológico de cáncer se está convirtiendo entiende mejor como una colección de cánceres poco comunes con cada uno definido por su perfil de mutación. Por lo tanto, el ensayo de agentes dirigidos se debe realizar con una población seleccionada llevar a mutaciones conocidas para activar las vías de señalización en la mira.
tumores colónicos humanos contienen varias mutaciones oncogénicas conductor posibles que podrían tenerse en cuenta, incluyendo
KRAS
,
BRAF
, y
PIK3CA
[1] Estas quinasas mutantes han sido objetivos clave para el continuo desarrollo de agentes terapéuticos. Ellos también han sido importantes en la comprensión de la biología de la resistencia al receptor del factor de crecimiento epidérmico terapias dirigidas, cetuximab y panitumumab [2], [3]. A pesar de los avances significativos en el tratamiento de esta enfermedad mortal, el cáncer colorrectal sigue siendo la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en los Estados Unidos [4]. Para avanzar en las opciones de tratamiento para los pacientes, más investigación sobre la biología de estas mutaciones es necesario. Esto proporcionará una mejor comprensión de qué pacientes son más propensos a responder a las terapias particulares.
PIK3CA
mutaciones ocurren en 20 a 30% de los cánceres colorrectales humanos [5], [6]. Tres mutaciones de punto de acceso se encuentran comúnmente, incluyendo H1047R, E542K, y E545K, que dan como resultado una forma constitutivamente activa de la subunidad catalítica de la PI3K p110α [7]. Este PI3K activa dominante entonces se traduce en el aumento de la señalización vía AKT /mTOR y aumento de la proliferación celular (Figura S1) [8]. Mientras que varios investigadores han examinado los efectos de estas mutaciones en las líneas celulares, nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un modelo murino de cáncer de colon que se inicia por un PI3K activa dominante (
FC PIK3CA *
) [9]. En este modelo, grandes adenocarcinomas invasivos mucinosos moderadamente diferenciadas desarrollan en el colon proximal por sólo 50 días de edad. Estos tumores se inician por una vía independiente no canónica de señalización Wnt aberrante. Dado que estos tumores son iniciados por PI3K activada, nuestro propósito es determinar si estos tumores dependen de esta vía. Aquí, nos demuestran que el tratamiento de
FC PIK3CA *
ratones con el inhibidor de mTOR, rapamicina, da como resultado una respuesta dramática en los cánceres de colon avanzado. Esto indica que los tumores humanos que dependen de la vía PI3K /AKT es probable que sean susceptibles a los inhibidores de mediadores abajo.
Materiales y Métodos
Ratón Cría
Todos los estudios con animales fueron conducido bajo los protocolos aprobados por el Cuidado y uso de Animales Institucional de la Universidad de Wisconsin-Madison, siguiendo las directrices de la Asociación Americana para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care. Homocigotos
FC
+
ratones hembra (FVB /N-Tg (Fabp1-Cre) 1Jig; NCI ratón Repositorio; número de cepa - 01XD8) se cruzaron con homocigotos
PIK3CA *
+ ratones macho (C57BL /6 a
Gt (ROSA) 26Sor
TM7 (PIK3CA *, EGFP) Rsky /
J; The Jackson Laboratory; Número de inventario - 012343) para generar
FC PIK3CA
* ratones utilizados en este estudio. Los ratones fueron genotipo para
FC
y
PIK3CA *
como se describe anteriormente [10], [11].
Tratamiento Animales
FC PIK3CA
* se seleccionaron los ratones entre 50 y 60 días de edad para la inclusión en el estudio, siempre y cuando ellos no estaban moribundos. híbrido de doble línea de base
exploraciones 18F-FDG PET /CT se realizaron antes y 15 días después de iniciarse el tratamiento. El tamaño del tumor se determinó subjetivamente de las imágenes en bruto pre-tratamiento y se utiliza para la estratificación durante la aleatorización hasta los rapamicina y el control de armas. Los animales en el grupo de control recibieron el etanol se disuelve en agua a una concentración final 1% por alimentación forzada oral diaria durante 14 días. Los animales asignados al azar al brazo de rapamicina recibieron 6 mg /kg de rapamicina (laboratorios de LC, Woburn, MA) por sonda oral por día durante 14 días consecutivos. La rapamicina se disolvió en etanol a una concentración de 50 mg por ml antes de suspender en agua hasta un volumen final de 200 l para la administración.
Imaging
Los animales se mantuvieron en ayunas durante al menos 6 horas antes a la inyección de
18 F-FDG (160 Ci; IBA Molecular, Romeoville, IL) o
18F-FLT (140 Ci; Universidad de Wisconsin Ciclotrón, Madison, WI). Después de la inyección, los animales se mantuvieron bajo anestesia durante 60 minutos y luego preparados para colonografía virtual como se describe anteriormente [12]. Se llevó a cabo una adquisición de 10 minutos en PET, seguida inmediatamente por la TC. proyecciones de máxima intensidad se crearon en Siemens Inveon Investigación del lugar de trabajo (Knoxville, TN). Las imágenes PET fueron reconstruidos utilizando OSEM3D /MAP (OSEM3D, 2 iteraciones; MAPA 18, 16 iteraciones subconjuntos). corrección de atenuación se realizó utilizando los datos de la TC. Las imágenes de TC fueron reconstruidos utilizando la reconstrucción conebeam estándar. exploraciones de PET de línea de base y después del tratamiento se normalizaron a dosis inyectada, la decadencia de la dosis, la actividad y el peso. Los volúmenes tumorales se estiman a partir de mediciones en las exploraciones PET /CT (Figura S2). La PET se utilizó para localizar tumores antes de la estimación del volumen. Los volúmenes tumorales sólo puede estimarse, ya que se definan los límites exactos del tumor es difícil. Esto es porque estos tipos de cáncer no son cambios luminales y sutiles de señal FDG relacionados con el epitelio normal hiperplásico circundante existen los tumores. Los volúmenes tumorales en cada cohorte se compararon mediante la prueba t de Student exacta de dos caras. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Histología e inmunohistoquímica
Los ratones fueron sacrificados por CO
2 asfixia después de su formación de imágenes post-tratamiento. El intestino delgado y el colon se retiraron, rojo de PBS, seccionadas en sentido longitudinal, extendidos hacia fuera, y se fijaron en formalina al 10% durante 24 horas. Los tejidos se almacenaron en 70% de etanol, se procesan, embebidos en parafina, y se cortaron en secciones 5 micras. Cada décima sección se tiñó con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para su revisión histológica. La inmunohistoquímica se realizó utilizando el kit de Histomouse ™ Max de amplio espectro (DAB) según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) y como se describe anteriormente [9]. La inmunofluorescencia se realizó utilizando un protocolo similar con los siguientes cambios: la leche 5% en PBS se utiliza para bloquear los tejidos. Todos los pasos después de la incubación con el anticuerpo primario y el lavado se omitieron y reemplazaron con lo siguiente: se incubaron con AlexaFluor 488 de cabra anti-IgG de conejo fluorescente anticuerpo secundario (1:1000, Invitrogen) durante una hora, se lavaron en PBS, y se montaron usando el ProlongGold Reactivo antifade con DAPI (Invitrogen). Los anticuerpos primarios fueron: anti-pAKT (Ser473, 1:100, Señalización Cell Technology, Beverly, MA), anti-ps6 (1:200, Señalización Celular Tecnología), anti-Ki67 (1:1000, Señalización Celular Tecnología) y ratón anti-β-catenina (1:200, BD Biosciences - Clone 14, San Diego, CA).
Análisis de Western Blot
Las muestras de tejido fueron extirpados y se congelaron rápidamente. Después de 24 horas, las muestras se sometieron a ultrasonidos en T-PER tejido reactivo de extracción de proteínas (Thermo Scientific, Pittsburg, PA), proteasoma inhibidor de cóctel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, Sigma-Aldrich) . proteína extraída fue luego en Ejecutar como se describe anteriormente [9]. Los anticuerpos primarios contra p110α, pAKT (Ser473), AKT (pan, 11E7), el total de tuberina /TSC2 (D93F12), pmTOR (Ser2448), pS6K1 (S6 quinasa p70, Thr389), ps6 (Ser235 /236), Total S6 (5G10 ), caspasa 3 escindida, pERK1 /2 (Thr202 /Tyr 204) y ERK total de medio (Cell Signaling Technology) se incubaron en albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich) en una proporción 1:1000 durante 16 horas. anticuerpo anti-GAPDH (Señalización Celular) se utilizó como control de carga en una proporción de 1:5000.
FC PIK3CA
* Los ratones desarrollen cánceres de colon proximal que se pueden seguir longitudinalmente para estudios sobre el tratamiento
FC PIK3CA *
ratones desarrollan rápidamente adenocarcinomas mucinosos moderadamente invasivos [9]. Es importante destacar que para este estudio, los tumores en estos ratones pueden ser detectados por doble híbrido
18 F-FDG o
18 F-FLT PET /CT colonografía (Figura S3
Un
y
B
, respectivamente). En nuestra reciente descripción de este modelo, se evaluó el desarrollo de tumores en el colon con el tiempo [9]. adenocarcinomas invasivos se identificaron en el 75% de los ratones a tan sólo 40 días de edad. La gran mayoría de los ratones están moribundos con sólo 60 a 80 días de edad. Dado el objetivo de este estudio para medir el efecto de la rapamicina sobre los cánceres de colon pre-existentes con una PI3K predominantemente activo, colocamos en nuestro estudio terapéutico 22
FC PIK3CA *
los ratones a los 55 días de edad, una edad en la la mayoría han pre-existente cáncer, pero todavía no se han convertido en moribunda. Los ratones fueron estratificados en grupos basados en el tamaño del tumor y el tratamiento previo de género según la estimación de la línea de base de doble híbrido
18 F-FDG PET /CT colonografía. Un volumen de 50 mm
3 fue utilizado como un punto de corte para determinar grandes frente a los tumores pequeños. Estos ratones fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos de tratamiento, recibieron placebo o que la rapamicina por sonda oral. Las características basales se muestran en la Tabla 1.
FCPIK3ca * Los ratones tolerar el tratamiento rapamicina
La rapamicina se administró a
FC PIK3CA *
ratones a una dosis de 6 mg /kg /día por sonda oral durante un total de 14 días consecutivos, que había sido previamente demostrado ser tolerable a los ratones [13]. Los
FC PIK3CA *
ratones también toleran bien este tratamiento (Tabla 1). No se observó ningún cambio significativo en el nivel de actividad o de peso entre las cohortes de tratamiento y placebo durante todo el período de estudio. Dos ratones en el grupo de placebo se convirtieron moribundos debido a la obstrucción del colon de los tumores grandes de colon proximal y se sacrificaron antes de la finalización del ciclo de tratamiento previsto. Ambos de estos ratones tenían tumores de gran tamaño en las imágenes de la línea de base con un volumen de más de 80 mm
3.
La rapamicina induce una respuesta significativa del tumor en
FC PIK3CA *
ratones
Después 14 días de tratamiento, los ratones, tanto en el placebo y los brazos de rapamicina se obtuvieron imágenes de un segundo tiempo para evaluar la eficacia del tratamiento. Después de la normalización de los datos de imagen, una respuesta dramática se observó en los ratones tratados con rapamicina, en comparación con los controles (Figura 1, Figura S4, y en la Tabla S1). En muchos animales, la actividad de la FDG en consonancia con el tejido tumoral no se pudo encontrar después del tratamiento rapamicina. Las imágenes de PET /CT se utilizaron para la localización del tumor y se estimaron los volúmenes basados en las mediciones de estas imágenes (figura S2). En el grupo tratado con placebo, el volumen del tumor casi se duplicó en tamaño desde la línea de base con un incremento respecto al valor inicial del 96%. Este cambio espectacular se esperaba ya que estos cánceres crecen muy rápidamente en este modelo. En la cohorte de rapamicina, hubo una marcada reducción en el volumen del tumor, con sólo el 16,9% de todavía estar presente en promedio la masa de referencia (Figura 1
B
y en la Tabla S1). No todos los tumores respondieron en el mismo grado, aunque ninguno de los tipos de cáncer en el brazo de la rapamicina, se mostró a aumentar de tamaño durante el tratamiento. Dado que estas lesiones son muy sensibles a la inhibición de mTOR de rapamycin, esto indica, además, que dependen de la cascada de señalización PI3K /Akt /mTOR.
Un grupo de 22
FC PIK3CA *
ratones se obtuvieron imágenes con doble híbrido
colonografía 18F-FDG PET /CT y estratificado en función del tamaño del tumor. Los ratones se trataron luego con un placebo (etanol disuelto en el agua potable) o rapamicina 6 mg /kg /día por sonda oral durante 14 días. Tras la finalización del ciclo de tratamiento, PET /CT colonografía se repitió para evaluar la respuesta del tumor. En los ratones que recibieron placebo, los tumores aumentaron de tamaño durante el periodo de tratamiento de 14 días (
A, izquierda
). En el brazo de la rapamicina se observó una respuesta significativa (
A, derecha
). Proyección y vistas axiales se presentan en la parte superior y la parte inferior, respectivamente. Los tumores se localizaron en las imágenes de PET y los volúmenes se midieron a partir de datos tomografías computarizadas. El porcentaje de cambio en el volumen del tumor para cada tumor se muestra en un diagrama de cascada (
B Opiniones).
Para confirmar los datos de respuesta adquiridos con la colonografía PET /CT, se realizó la necropsia después de la adquisición de imágenes. Una respuesta significativa se observó también en la necropsia (Figura 2). El uso de un análisis, cecal por intención de tratar y /o tumores de colon fueron manifiestamente presente en 10 de los 11 ratones en el grupo de placebo, pero estaban presentes en sólo 5 de 11 ratones en el brazo de la rapamicina (Figura 2
C
, p = 0,021), lo que indica un efecto significativo del tratamiento con la terapia de la rapamicina como agente único. En el grupo placebo, 8 de 11 ratones tenían tumores de colon, mientras que los cánceres estaban presentes en sólo 3 de 11 ratones tratados con rapamicina (Figura 2
C
, p = 0,034). Ambos grupos tuvieron un número igual de tumores cecales, con 2 de 11 ratones tenerlos en cada brazo. Uno de los
FC PIK3CA *
ratones del grupo de control con un tumor cecal también desarrollaron la enfermedad metastásica con la extensión del cáncer en el tejido mesentérico se apoya en el bazo y el páncreas (Figura 2
D y E
). No se detectó ninguna evidencia de enfermedad metastásica en los ratones tratados con rapamicina.
Después de imágenes post-tratamiento, se realizó la necropsia. El colon se extirpó y se divide longitudinalmente. tumores submucosos grandes se observaron en los ratones tratados con placebo (
A
). Se observó una respuesta dramática en la necropsia en la cohorte tratada con rapamicina (
B Opiniones). Hiperproliferación fue disminuida en el colon proximal normal y se identificó tumor residual mínima. 10 de 11
FC PIK3CA *
ratones en la cohorte placebo tenían tumores identificables mientras que sólo 5 de 11 ratones en el grupo de rapamicina tenían tumores identificables (
C
). Se encontró un ratón en la cohorte de placebo que tienen cáncer metastásico de un tumor cecal (
D
). Un gran lesión en el mesenterio se identificó a tope el bazo y el páncreas (
D, flecha
). En el corte histológico una morfología similar se observó entre el depósito y metastásico del tumor primario dentro del ciego (
E
).
FC PIK3CA
* Demostrar tumores P110 * Expresión y activación de la vía PI3K que se disminuyeron con el tratamiento rapamicina resultante en la respuesta tumoral y reducido proliferación
Tras la necropsia, se aislaron y se prepararon para el seccionamiento histológico los tumores de colon. H & amp; E tinción demostraron tejido epitelial hiperplásico y moderadamente diferenciados adenocarcinomas mucinosos invasivos como se esperaba en la cohorte placebo (Figura 3
Un
, izquierda). En los ratones tratados con rapamicina, se observó una reducción significativa de la hiperplasia del tejido epitelial, y se redujo el tamaño del tumor (Figura 3
A
, España derecha). Las células malignas columnares típicamente que rodean los lagos mucinosos habían desaparecido en la mayoría de los tumores, lo que resulta en un menor número de células con tinción fuertemente para pAKT y PS6 en los tumores de los ratones tratados con rapamicina en comparación con los controles (Figura 3
B y C
, España, respectivamente). La disminución de la proliferación celular se observó después del tratamiento con rapamicina como se demuestra por una disminución de la tinción de Ki67 (Figura 3
D
).
Tras la necropsia, el tejido tumoral del colon con el tejido epitelial del colon adyacente fue fijado en formalina, parafina incrustado, y se les realizó el seccionamiento histológico. El tejido se tiñeron con H & amp; E (
Un
). En comparación con el placebo, una disminución notable en el tamaño se observó en los tumores de los ratones tratados con rapamicina. El tumor en la foto en
A,
rapamicina es de un ratón FC3K tratada en un piloto de este estudio y elegido para esta figura debido a la respuesta dramática parcial observada. Además, el epitelio columnar maligna que rodea los lagos mucinosos fue disminuida después del tratamiento rapamicina, en comparación con el control. No se observaron células Menos pAKT y PS6-positivos en los tumores de los ratones tratados con rapamicina en comparación con los tumores de los ratones que recibieron placebo (
B Opiniones y
C, España, respectivamente). la proliferación tumoral, medida por Ki67, también se redujo en los tumores de ratones tratados con rapamicina en comparación con los tratados con placebo (
D
). bar Tamaño:
Un
, 1 mm.
B-D ¿Cuáles son ~ 3 × ampliaciones.
Tras el tratamiento con rapamicina, la activación aguas arriba de la vía PI3K se mantuvo imperturbable como se esperaba (Figura 4). En la necropsia, algo de tejido tumoral se congelaron antes de la preparación de proteína y cuantificación. El P110 proteína *, la forma activa dominante de PI3K utilizado en este modelo, se expresó en los tumores y el epitelio normal del colon proximal en todos los animales independientemente del tratamiento. pAKT expresión significativa se observó también en los tumores y el tejido normal de colon proximal. El nivel de pAKT no parece ser afectada por la rapamicina tratamiento. Las proteínas pmTOR, pSK61, y PS6 se redujeron en respuesta al tratamiento rapamicina en la mayoría de los tejidos, aunque algunos tumores claramente demostró continuaron la activación de estas proteínas. Los tumores con señalización ps6 persistente tenían menos de una respuesta al tratamiento con rapamicina como se indica en la imagen PET.
Todo
FC PIK3CA *
tumores de colon y tejido hiperplásico demostrado la expresión de P110 *, activa el dominante subunidad catalítica de PI3K en este modelo. Esto dio como resultado un aumento de la fosforilación de AKT
9. Los niveles de pAKT y AKT total que no se alteraron en respuesta al tratamiento rapamicina. los niveles totales de TSC2 también no variaron. Los niveles de pmTOR, pSK1, y ps6, sin embargo, varían con el tratamiento rapamicina. En los tumores de la cohorte de placebo (-), se observaron altos niveles de PS6. En los tumores que fueron tratados con rapamicina (+), disminución de los niveles de PS6 se observaron en la mayoría de los tumores y se correlacionó con el aumento de la respuesta de formación de imágenes PET. El aumento de pERK1 /2 se observó en algunos tipos de cáncer tratados con placebo y también el tumor tratado con rapamicina con la señalización ps6 persistente.
FC PIK3CA *
tumor y el tejido hiperplásico había aumentado exfoliados caspasa 3 debido a un aumento del recambio celular. Una reducción de la caspasa 3 escindida fue identificado en los tumores que poseen aumentó pERK1 /2 de señalización que indica que los tumores con un aumento de pERK pueden ser resistentes a la rapamicina tratamiento a través de la apoptosis disminuido. GAPDH se utilizó como control de carga.
Resistencia al tratamiento de rapamicina
FC PIK3CA *
ratones podría ser mediada a través de Perk Up-regulación y persistente ps6 señalización conducen a la apoptosis Disminución
Algunos tumores tenían una respuesta limitada al tratamiento rapamicina. La hipótesis de que esto podría estar relacionado con la regulación de la Raf /MEK /ERK cascada de señalización o señalización ps6 persistente. ERK1 /2 sobre regulación previamente se ha descrito en la respuesta al tratamiento rapamicina [14], [15]. Los niveles de pERK1 /2 se evaluaron en el tejido normal de colon, tumores de colon proximales, y los tumores cecales (Figura 4). pERK1 /2 se encontró que era dramáticamente hasta reguladas en un ratón de cada grupo de tratamiento. En un grupo de diez tumores de
FC PIK3CA *
los ratones no tratados, seis mostraron algún grado de pERK1 /2, que indica un posible mecanismo (s) para la resistencia intrínseca (Figura S5
Un
). Además, todos los tejidos tratados con rapamicina hicieron mostrar un aumento de pERK1 /2 sobre los controles. Estos datos indican que una subpoblación de
FC PIK3CA *
tumores poseen la activación de la señalización de ERK. Esta señalización puede ser responsable de un cierto grado de resistencia a la inhibición de mTOR, ya que la vía de ERK no se inhibe con esta estrategia de tratamiento. Esta resistencia puede ser intrínseca al tumor o inducido secundario al tratamiento.
Para confirmar que la señalización Wnt no es aberrante en estos tumores, como se describió anteriormente [9], se realizó un análisis histológico para examinar pruebas de β nuclear catenina. Sin β-catenina nuclear se observó en los tumores de control (Figura S5
B
). Además, también se examinaron los restos tumorales de ratones tratados con rapamicina para aberrante de señalización para determinar si la inducción de esta vía puede ser un mecanismo adicional que reduzca la sensibilidad de estos tumores a la rapamicina WNT. No hay evidencia de β-catenina nuclear se demostró en los tumores de los ratones tratados con rapamicina (Figura S5
B
).
El examen histológico de un representante de la rapamicina resistente
FC PIK3CA *
tumor demostró una morfología similar a los cánceres de los controles (Figura 5). Además, no hay diferencias en la proliferación o niveles de pAKT celular se observaron (Figura 5
C
). En un tumor de un ratón control, PS6 se observó en la hiperplasia de la mucosa, así como el tejido del tumor, como se esperaba (Figura 5
D
, abajo). Sin embargo, en el tumor de un ratón tratado con rapamicina, se observó una disminución en PS6 en el tejido epitelial normal, pero la señal PS6 persistió en el tejido de cáncer restante (Figura 5
D
, parte superior, la Figura S6
Una
). La cantidad de PS6 presente en estas células de cáncer resistentes supera lo que se ve en el cáncer de responder en la Figura 3. Esto indica una respuesta diferencial en el tejido normal en comparación con el tejido tumoral y podría ser un mecanismo de resistencia a la inhibición de mTOR en esta configuración.
un tumor resistente a la rapamicina (primeros de cada panel) y un tumor de un tratado con placebo
FC PIK3CA *
ratón (parte inferior de cada panel) estaban integrados en el mismo bloque histológico. Una tasa de fenotipo y la proliferación similares se observaron en H & amp; E y tinción Ki67, respectivamente (
Un
y
B Opiniones). No hay diferencia significativa en pAKT se observó entre los tumores de la placebo y los ratones tratados con rapamicina (
C
). En el tejido del ratón tratado con placebo, aumentó PS6 se observó en el tejido tumoral y el tejido hiperplásico superpuesta como se esperaba (
D
). Curiosamente, en el tejido de la rapamicina tratados
FC PIK3CA *
ratón, disminuyó PS6 se observa en el tejido hiperplásico, pero aumentó de señalización PS6 permanece en el tejido tumoral resistente a pesar de la rapamicina tratamiento. Esto indica que la persistencia de ajuste PS6 dentro de los tumores puede ser el mecanismo de la resistencia del tumor. Este mismo patrón de tinción se observó en todos los tumores (3/3) con algunas células neoplásicas restantes después del tratamiento con rapamicina que se examinaron. Las barras de tamaño:
Un
,
C
y
D
, 1 mm;
B Opiniones, 500 micras.
Discusión
Orientación de las vías oncogénicas ha llevado a los recientes avances emocionantes en múltiples tipos de cáncer, incluyendo vemurafenib en
BRAF
melanoma mutante, erlotinib en
EGFR mutante
cáncer de pulmón de células no pequeñas, y crizotinib en el cáncer de pulmón con la translocación EMLA4-ALK [16] - [18]. Estos agentes se utilizan en la fijación de alteraciones genéticas específicas que codifican proteínas oncogénicas. La orientación de estas proteínas conductor da como resultado una alta tasa de respuesta a agentes dirigidos contra ellos. Este enfoque permitió la evaluación conveniente y aprobación de la FDA de estos agentes para estas indicaciones [19]. El desarrollo de estos agentes en los entornos moleculares específicos ha llevado a la realización de que cada tipo histológico de cáncer es en realidad una colección de numerosos subtipos raros. Estos subtipos se diferencian por cada uno su perfil de mutaciones
.
La vía PI3K /AKT es el alterados genéticamente cascada de señalización más común en el cáncer. interés clínico significativo en la orientación de la vía PI3K /Akt /mTOR continúa aumentando a medida que nuevos inhibidores de esta vía continúa con la evolución. La inhibición de la vía PI3K en los cánceres que posee
PIK3CA mutaciones
ha demostrado beneficio clínico en cáncer de mama y tumores malignos ginecológicos, pero la presencia de estas mutaciones por sí sola no predecir la sensibilidad a estos enfoques [20]. La subpoblación de pacientes que tienen más probabilidades de beneficiarse del desarrollo continuo de nuevos inhibidores de la vía PI3K sigue sin estar clara.
Hasta hace poco, no se había investigado los efectos de una PI3K activada en el intestino de los mamíferos. Fuimos los primeros en describir el desarrollo de adenocarcinomas mucinosos invasivos avanzados en desarrollo en el colon proximal como resultado de la expresión de una PI3K activa dominante [9]. Curiosamente, estos tumores se desarrollan rápidamente, sin un componente luminal significativa o aberraciones en la señalización de WNT, lo que indica un mecanismo no canónica de la iniciación del tumor. Aquí, se demuestra que los tumores se forman en
FC PIK3CA *
ratones dependen en gran medida de la vía PI3K. En este modelo, una PI3K activa dominante se expresa en el colon resulta en la iniciación del tumor. Estos tipos de cáncer son muy agresivos y son capaces de ser seguido en sentido longitudinal con doble híbrido
colonografía 18F-FDG PET /CT. Después de sólo dos semanas de tratamiento con rapamicina se observó una respuesta significativa con las imágenes y confirmó en la autopsia. Estos resultados indican que
FC PIK3CA *
tumores dependen de esta vía. Si los tumores similares están presentes en los seres humanos, la inhibición de la vía PI3K podría resultar en un beneficio clínico significativo para pacientes apropiados.
Se postula que una subpoblación de tumores humanos se forman como consecuencia de una PI3K activo dominante y que estos tumores dependen de esta vía. En una serie reciente patológica, la activación de mutaciones en
PIK3CA
se observa con mayor frecuencia en los cánceres de colon mucinosos en los seres humanos, similar a nuestro modelo, y se asocia con un deterioro del pronóstico [21]. La activación de mutaciones en
PIK3CA
se asociaron inversamente con la translocación de β-catenina [21]. La translocación de β-catenina sería de esperar si estos tumores se iniciaron por la señalización de Wnt aberrante como parte de los mecanismos descritos anteriormente canónicas de la tumorigénesis en los cánceres de colon [22]. En conjunto, estas observaciones indican que un subgrupo de cánceres de colon humanos surgen en el contexto de PI3K se activa, similar a lo que se ve en nuestro modelo. Sólo un pequeño número de tumores han sido interrogados por las aberraciones en la señalización de WNT y mutaciones en
PIK3CA
, por tanto, las investigaciones adicionales están garantizados para caracterizar mejor esta población de pacientes. Con base en estos estudios previos, creemos que esto probablemente representa el 1-5% de todos los cánceres de colon.
Incluso con las respuestas significativas observados en este estudio, se identificó resistencia a la terapia rapamicina. Aumento de pERK1 /2, PS6, o ambos se observaron en los tumores que persisten a pesar de la rapamicina tratamiento. Estos mecanismos de resistencia pueden ser intrínsecas a los tumores o inducida secundaria al tratamiento rapamicina. La rapamicina es conocida para inhibir quinasas S6 ribosomal (S6K1 y S6K2) a través de su interacción con mTOR [23]. La inhibición de la fosforilación S6Ks disminuye aguas abajo del S6 en la Ser
240/244 y Ser
235/236 [24]. Estudios en fibroblastos embrionarios de ratón S6K2 nulo S6K1 /confirmaron que estos S6Ks fueron las principales quinasas que afectan a S6, pero también demostraron un mecanismo dependiente de MEK1 /2 de la fosforilación S6 en Ser
235/236 [25]. Además, ERK1 /2 se ha demostrado para activar la p90 ribosomal S6 quinasa (RSK), que posteriormente puede fosforilar S6 en Ser
235/236 independiente de mTOR señalización (Figura S7) [26]. En todos los tumores de
FC PIK3CA *
ratones, se observa fosforilación de S6 cree que está relacionada a la activación de la vía PI3K. En un subgrupo de tumores, observamos también aumentamos pERK1 /2 y persistente ps6. Estos datos indican que la fosforilación de S6 alternativa mediada por ERK1 /2 activación de RSK podría ser un mecanismo por el que estos tumores son resistentes a la rapamicina. Las combinaciones de terapias dirigidas probablemente serán necesarias en algunas circunstancias para superar estos mecanismos de resistencia. PI3K y Raf /MEK /ERK regímenes de combinación inhibidor de la vía siguen siendo un área activa de investigación preclínica y clínica [27] - [29].
A pesar de la rapamicina es un conocido inhibidor de mTOR y la vía PI3K, nuevos agentes continúan siendo desarrollados para orientar esta vía.