Extracto
La evidencia acumulada sugiere que la metformina, una biguanida clase de medicamentos anti-diabéticos, posee propiedades anti-cáncer. Sin embargo, la mayor parte de los estudios para evaluar la eficacia terapéutica de metformina haber estado en el cáncer primario. No existe información disponible si la metformina podría ser utilizado de manera efectiva para el cáncer recurrente, específicamente cáncer colorrectal (CCR) que afecta hasta el 50% de los pacientes tratados con quimioterapias convencionales. Aunque las razones de recurrencia no se entienden completamente, se cree que es debido a la re-emergencia de las células madre del cáncer resistente a la quimioterapia /tallo-como (los CAC /CSLCs). Por lo tanto, el desarrollo de estrategias de tratamiento no tóxicas dirigidas a las CSC sería de beneficio terapéutico significativo.
En la presente investigación, hemos examinado la eficacia de la metformina, en combinación con 5-fluorouracilo y oxaliplatino (FUOX), la pilar de la terapéutica del cáncer de colon, en la supervivencia de células de cáncer de colon de quimioterapia resistente que están altamente enriquecidas en CSC /CSLCs. Nuestros datos muestran que la metformina actúa sinérgicamente con FUOX para (a) inducir la muerte celular en la quimioterapia (CR) HT-29 y HCT-116 células de cáncer de colon resistentes, (b) inhibir la formación de colonospheres y (c) mejorar colonospheres desintegración.
in vitro
estudios en cultivos celulares han demostrado, además, que el tratamiento combinatorio inhibe la migración de células de cáncer de colon CR. Estos cambios se asociaron con mayor miRNA 145 y la reducción de miRNA 21. vía de señalización /β-catenina Wnt fue también el regulado que indica su papel fundamental en la regulación del crecimiento de las células de cáncer de colon CR. Los datos de los ratones SCID modelo de xenoinjerto de CR HCT-116 y las células HT-CR 29 muestran que la combinación de metformina y FUOX es muy eficaz en la inhibición del crecimiento de los tumores de colon como se evidencia por la inhibición de ~ 50% en el crecimiento después de 5 semanas de tratamiento de combinación , en comparación con los controles tratados con vehículo. Nuestros datos actuales sugieren que la metformina junto con la quimioterapia convencional podría ser un régimen de tratamiento eficaz para el cáncer recurrente colorrectal (CCR)
Visto:. Nangia-Makker P, Yu Y, Vasudevan A, L Farhana, Rajendra SG, Levi E, et al. (2014) La metformina: Un posible agente terapéutico para el cáncer de colon recurrente. PLoS ONE 9 (1): e84369. doi: 10.1371 /journal.pone.0084369
Editor: Shrikant Anant, Universidad de Kansas Facultad de Medicina de los Estados Unidos de América
Recibido: 18 Octubre, 2013; Aceptado 22 de noviembre de 2013; Publicado: 20 de enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Nangia-Makker et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por subvenciones del NIH (AG014343) y el Departamento de Asuntos de Veteranos (I101BX001927). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
comprensión reciente de la distribución heterogénea de las células cancerosas en un tumor se ha puesto de manifiesto la presencia de los CAC /CSLCs [1], [2], que presentan características de auto-renovación, capacidad para iniciar tumor desde un número pequeño de células que son altamente resistentes a la quimioterapia-[3] - [7]. recurrencia de carcinoma es en parte debido a que la quimioterapia convencional sólo se refiere a las células que se dividen rápidamente que forman mayor parte del tumor, pero respeta las CSC /CSLCs [8]. La proporción de células madre cancerosas se informa a aumentar después de la quimioterapia convencional [9]. Por lo tanto, la presencia de células madre cancerosas resistentes a la quimioterapia /CSLCs en el tumor primario puede ser en parte responsable de un fracaso de la erradicación completa del tumor que resulta en su recurrencia en los sitios primarios y secundarios. Desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, que se dirigen específicamente a CSC /CSLCs está, por lo tanto, justifica.
La metformina, (clorhidrato de 1,1-dimetilbiguanida) un aprobado por la FDA medicamento antidiabético biguanida, se deriva de la lila francesa (
Galega officinalis
), una planta utilizada en la medicina popular desde hace varios siglos. Además de su función como un supresor de la gluconeogénesis, la metformina recientemente se ha demostrado que poseen fuertes propiedades anti-cáncer. En pacientes diabéticos tipo 2 metformina se ha demostrado que suprimir la carcinogénesis de mama, páncreas y pulmón, y para disminuir la mortalidad relacionada con el cáncer (revisado en [10], [11]. En una serie de estudios preclínicos, la proliferación metformina reducida, la apoptosis inducida, causó la detención del ciclo celular y la reducción de la incidencia y el crecimiento de los tumores experimentales
in vivo
[12] - [18] Algunos informes también indican que la metformina mejoró la respuesta de los xenoinjertos de tumores de mama humanos a la quimioterapia convencional mediante la erradicación de células madre cancerosas en. el tumor [19], [20].
Muchos investigadores han descrito el papel fundamental de la vía de señalización /β-catenina en la regulación de células madre epiteliales auto-renovación [21], [22], y su desregulación se ha implicado en muchos tumores malignos, incluyendo el cáncer colorrectal (CRC) [23], [24]. en CRC, como resultado de la inactivación del gen APC, la fosforilación coordinada y destrucción de β-catenina se interrumpe. como resultado, β-catenina se acumula en el citoplasma, complejos con proteínas de unión al ADN de la familia TCF /LEF y se transloca al núcleo [25], [26]. Una vez allí, se activa la transcripción de sus genes diana como ciclina D1, c-myc, MMP-7, MT1-MMP, axin1 etc. [27]. Muchos de estos genes diana están implicados en la proliferación de células madre intestinales y la carcinogénesis [28]. Recientemente hemos demostrado que la vía Wnt /β-catenina desempeña un papel crítico en el crecimiento y mantenimiento de colonospheres, que están altamente enriquecidas en células /CSL CSC [29]. Aumento de los niveles de β-catenina en colonospheres se asociaron con la inducción de la activación de la transcripción de TCF /LEF, que se disminuyó cuando β-catenina fue silenciado usando siRNA [29].
una nueva clase de ARNs cortos no codificante , llamado miRNAs ha surgido como un regulador de la traducción del ARNm. A miARN puede actuar como un supresor de tumor o un oncogen en función de sus objetivos en diferentes tejidos y tipos de células [30]. un amplio análisis de los patrones de expresión de los genes miARN en los cánceres humanos han revelado que los diferentes tipos de cáncer tienen distintos patrones de expresión de los genes miARN [31] .Hemos informado de que miR21, que ha demostrado ser hasta reguladas en el CCR [32], induce la troncalidad en la quimioterapia células (CR) de cáncer de colon resistentes [33]. miR21 se ha demostrado que regulan las propiedades de crecimiento, la migración, invasión y apoptosis relacionados de células de cáncer [34]. Baja regulación de miR21 por CDF, un análogo de la curcumina [35], dio como resultado la normalización de eje PTEN /Akt en CR HCT-116 y CR células HT-29 y la reducción del crecimiento [36]. La sobreexpresión de la miR21in células HCT-116 dio lugar a una actividad β-catenina aumento de [33]
.
se llevó a cabo la presente investigación para examinar si la metformina podría ser utilizado en conjunción con la quimioterapia convencional para inhibir el crecimiento de la quimioterapia resistentes a las células de cáncer de colon y la regulación de este proceso. En este documento, hemos demostrado que la metformina actúa sinérgicamente con FUOX, una combinación de 5-FU y oxaliplatino, el pilar en la quimioterapia del cáncer de colon para inhibir el crecimiento de células de colon CR
in vitro
y
in vivo
así como su migración a través de la regulación negativa miR21and la inhibición de la vía de señalización /β-catenina vía.
Materiales y Métodos
líneas celulares y reactivos
células de cáncer de colon humano HT-29 y HCT-116 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (4,5 g /I de D-glucosa) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Invitrogen, Grand Island, NY) y 1% de antibiótico /antimicótico en incubador humidificado a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire y 5% diaoxide carbono. se generaron 5-fluorouracilo + Oxaliplatino (FUOX) células resistentes (células CR) como se describe anteriormente [37] - [39] en nuestro laboratorio. Las células CR se mantuvieron en medio de cultivo normal que contiene 2 × FUOX (50 mM 5 FU + 1,25 M Ox). Las células endoteliales fueron un regalo del Dr Dipak Banerjee, Universidad de Puerto Rico y mantuvieron en medio esencial mínimo de Earle suplementado con 10% de suero fetal bovino (Hyclone) como se ha descrito anteriormente [40]. El medio se cambió dos veces a la semana, y las células se pasaron usando 0,05% de tripsina /EDTA (Invitrogen). El uso de líneas celulares fue aprobado por el Comité de Investigación Humana de la Universidad Estatal de Wayne, Detroit, MI. El clorhidrato de metformina se adquirió de Sigma Chemical Co. Una solución 2 M se preparó en agua destilada estéril y se almacenó a -20 ° C. FU y Ox se obtuvieron de Sigma Chemical Co.
Determinación del crecimiento celular
El crecimiento de las células de cáncer de colon se evaluó por la reducción mitocondrial dependiente de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il ) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) (Sigma) a formazán tal como se describe anteriormente [41]. Brevemente, las células (5 × 10
3) se sembraron por cuadruplicado en placas de cultivo de 24 pocillos. Se añadió después de 24 horas, un nuevo soporte de varias concentraciones de metformina y /o FUOX. Después de 72 horas, la proliferación celular se determinó mediante el ensayo de MTT. Brevemente, se retiró el medio y se incubaron las células a 37 ° C con MTT (0,5 mg /ml) durante 4 hr. El medio se aspiró y las células se solubilizó en HCl 0,04 N en isopropanol. La densidad óptica (DO) se midió a 570 y 630 nm.
El análisis de la interacción entre la metformina y FUOX
índices de combinación (IC) del método adaptado para
in vitro
drogas las pruebas se empleó para determinar la naturaleza de la interacción entre la metformina y FUOX. Este método utiliza múltiples ecuación efecto del fármaco derivado originalmente de método de cinética enzimática, donde la salida se representa como CI y /o análisis de isobolograma analysis.CI se llevó a cabo mediante la utilización de software Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO). Sobre la base de valores de CI, se determina el alcance de sinergismo /anatogonism. En general, los valores de CI por debajo de 1 indican sinergia, mientras que los valores de CI por encima de 1 indican antagonismo entre los medicamentos. valores de CI en el rango de 0,9 a 1,10 serían principalmente indicar efectos aditivos: las que existen entre 0,9-0,85 sugieren una ligera sinergia, y los valores en el rango de 0,7-0,3 son indicativos de sinergia moderada. Cualquier valor de menos de 0,3 sugeriría fuertes interacciones sinérgicas entre los fármacos.
Formación y diferenciación de colonospheres
La capacidad de las células para formar esferas en suspensión se evaluó como se ha descrito por Liu et al [42 ], con ligeras modificaciones [29], [43]. Brevemente, colonospheres se generaron por incubación de un número limitado de células parentales y CR HCT-116 y HT-29 a una concentración de 100 células por 200 l de medio de suero de células exento de vástago (SCM) que contienen DMEM /F12 (01:01) suplementado con (tecnologías de la vida, Gaithersberg, MD) B27 factor de 20 ng /ml de crecimiento epidérmico (Sigma, St. Louis, MO), 10 ng /ml de factor de crecimiento de fibroblastos (Sigma) y antibiótico /antimicótico en placas de 24 pocillos en presencia de metformina sola o en combinación con FUOX. Los colonospheres formaron después de 8 días se evaluaron por su tamaño y número con el microscopio óptico. En un conjunto de experimentos, los colonospheres formadas en medio normal fueron tratados con metformina y /o FUOX para analizar su efecto sobre la diferenciación esfera y el apego.
Extreme dilución limitante análisis
Extreme análisis de dilución limitante (ELDA) se realizó como se describe por Hu y Smyth [44]. Brevemente, la suspensión de una sola célula obtenida a partir de células adherentes previamente con metformina y /o FUOX para 72 hr se sembraron a una concentración de 100, 10 y 1 célula por 100 μLSCM (24 así para cada dilución) en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 8 días . Al final de 8 días, se contó el número de pocillos que muestran formación de colonospheres. La frecuencia de células formadoras de esfera se determinó utilizando ELDA herramienta web en http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda.
La migración de células de ensayo
Este ensayo se realizó con un Boyden cámara (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD) como se describió anteriormente [41], [45]. En la cámara baja de 100 mg /ml de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) solos o mezclados con metformina y /o se le añadió FUOX. células HT-29 o CR HT-29 (5 × 10
4) las células fueron cargados en la cámara superior. Las dos cámaras se separaron mediante un filtro de policarbonato de 8 μ de tamaño de poro y se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos 37 ° durante 16 horas, después de lo cual se retiró el filtro, las células en la parte superior del filtro fueron eliminados y las células migradas fueron fijo, teñidas utilizando Protocolo Hema 3 conjunto de manchas (Fisher Scientific Company, Pittsburgh, PA). Las células migradas fueron fotografiados utilizando Olympus 45 microscopio de soporte una cámara Idea Spot y se contaron las células que migraron por campo. Cada ensayo se llevó a cabo tres veces y 6 pocillos se utiliza para cada tratamiento.
En la siguiente serie de experimentos, se midió la migración de las células de cáncer de colon hacia las células endoteliales. En esta investigación, las células enodothelial o HT-29 /CR células HT-29 (2,4 x 10
4) fueron pre-marcado con tinción viable DiO o DiI respectivamente (Invitrogen), se lavó dos veces con medio completo y se sembraron en cada cámara del inserto de cultivo celular (ibidi GmbH). Después de 24 horas, el inserto de cultivo celular se retiró y se observó la migración de los co-cultivos hacia la otra para la curación de heridas. En algunas culturas, la metformina y /o FUOX se añadió en el momento de la retirada del inserto. Las células se fotografiaron a los 0, 24 y 48 hr después de la eliminación de la inserción.
análisis de transferencia de Western
análisis de transferencia Western se realizó de acuerdo con el protocolo estándar [46]. Brevemente, las células se solubilizaron en tampón de lisis (Tris HCl 50, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 1% de Triton X100, 0,5% de NP40, 25 mg /ml cada uno de aprotinina, leupeptina y pepstatina, 1 × fosfatasa cóctel inhibidor (Sigma). Después de la clarificación a 10.000 g durante 30 min, el sobrenadante se utilizó para el análisis de proteínas. la concentración de proteína determinada por el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad ((Bio-Rad, Hercules, CA) y las alícuotas que contienen 25 mg de proteína se separaron mediante SDS-poliacrilamida electroforesis en gel. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Millipore) mediante electrotransferencia y se sometieron a análisis de transferencia Western con la dilución recomendada de anticuerpo primario. Después de lavados las manchas se hicieron reaccionar con la mezcla de anticuerpo secundario que contiene 1:2500 diluciones del anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante apropiada (Amersham Biosciences). las bandas de proteínas se visualizaron usando un kit de quimioluminiscencia mejorado disponible comercialmente (Amersham Biosciences). Las transferencias se también inmuno-reaccionar con una dilución 1:5000 de anticuerpo monoclonal de ratón anti-actina (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) para normalizar la variación en la carga de proteínas.
Aislamiento de ARN y cuantitativa Reacción en cadena de la polimerasa análisis
ARN total fue extraído a partir de células parentales y CR tratados con metformina y /o FUOX durante 48 horas usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El ARN total se trató con Dnase1 para eliminar la contaminación de ADN genómico, posteriormente purificado utilizando miRNAeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). La concentración de ARN se midió a una densidad óptica de 260 nm
.
Para cuantificar el miR-21 y miR-145, la primera síntesis de ADNc se realizó utilizando Taqman MicroARN kit de transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Los cebadores miARN RT-PCR para miR21, miR145 y el control endógeno RNU6B se compraron de Applied Biosystems. en tiempo real el análisis de QRT-PCR se realizó usando Applied Biosystems 7500 sistema en tiempo real PCR. La mezcla de PCR que contiene Taqman 2 × PCR Universal Master Mix se procesaron de la siguiente manera: 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 60 seg. La señal se recogió en el punto final de cada ciclo. La expresión de los genes? C
valores de T para cada muestra se calcula mediante la normalización con RNU6B control interno, y los valores de cuantificación relativa se representaron.
El análisis de citometría de flujo
Las suspensiones de células individuales de metformina y /o FUOX tratada o células CR HT-29 no tratadas fueron sometidas a tinción por inmunofluorescencia directa seguido por análisis de citometría de flujo de acuerdo con el protocolo estándar [38]. Brevemente, las células se recogieron y se lavaron con PBS. Medio millón de células se suspendieron en 90 l de PBS que contiene 0,5% de BSA. Después de 10 min de incubación a temperatura ambiente, se añadió 10 fluoróforo l (PE-Cy7 o PerCP-Cy5) conjugado CD44 ant-anticuerpo humano o CD166 y se incubó durante 30 min en oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se lavaron y se analizaron usando una diva FACS (BD, San José, CA). Las células teñidas con IgG2b (control de isotipo negativo) sirvieron como control de compuerta. La proporción de CD44
+ /CD166
+ células /baja se determinó sobre la base de la intensidad de fluorescencia-espectros.
El crecimiento del tumor en ratones SCID
Para determinar si la combinación de metformina y FUOX sería una estrategia terapéutica eficaz para los tumores de colon, se utilizó SCID modelo de xenoinjerto de ratones de tumor de colon. Para generar los tumores de colon, cuatro semanas de edad ratones SCID hembra, adquirido de Laboratorio Taconic, se inyectaron s.c. ya sea con 1 × 10
6 células HCT-116 CR o CR HT-29 en suspensión en 100 l de Matrigel. Luego se dividen en 2 subgrupos de 4 ratones y se inició el tratamiento con metformina 7 días después de la inoculación de las células en un subgrupo. La metformina (Riomet 500 mg /5 ml; Ranbaxy Laboratories, Princeton, NJ) se disolvió en 100 ml de agua potable para alcanzar la dosis de 200 mg /kg de peso. El agua se cambia todos los días y se midió la ingesta de agua. El tratamiento con metformina se continuó durante 5 semanas hasta que se sacrificaron los ratones. grupo metformina también se inyectó IP con una mezcla de 25 mg /kg 5-fluorouracilo y 2 mg /kg una vez a la semana oxaliplatino durante 3 semanas. Los tumores se midieron una vez a la semana y los volúmenes tumorales se calcularon usando la fórmula: volumen del tumor = longitud x anchura x anchura /2. Los ratones fueron monitorizados regularmente para detectar cualquier signo de malestar. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Atención Institucional de la Universidad Estatal de Wayne Animales y el empleo (IACUC) aprobó el protocolo#A02-02-13. Animal Welfare Aseguramiento#A3310-01.
aislamiento de células individuales desde el xenoinjerto
Las porciones pequeñas (5-10 mg) de tumor, generada en ratones SCID por CR HCT-116 y CR HT -29 células, como se describe a continuación se lavaron extensamente en 1 × PBS que contiene 10% de antibiótico /antimicótico (AB /AM) y posteriormente se incubaron durante la noche en medio de Dulbecco mínimo esencial (DMEM /F12) que contiene 5% de antibiótico /antimicótico a 4 ° C. El tejido se cortó en trozos finos usando bisturí estéril y luego se digirió con 1,5 mg /ml de colagenasa I (Sigma-Aldrich) y 20 mg /ml de hialuronidasa I (Sigma Aldrich) bajo agitación suave durante 2-3 horas a 37 ° C. El tejido digerido se filtra a través de 40 μ de filtro y se centrifugó a 1200 rpm durante 5 min. El sobrenadante (que contiene células muertas así como las células de grasa) se desechó y las células (pellet) se lavaron tres veces con medio DMEM /F12 que contenía 5% AB /AM. Las células se suspendieron en medios de células madre previamente definido.
El análisis estadístico
tres veces All
in vitro
experimentos se repitieron por triplicado. El análisis estadístico se realizó utilizando Microsoft Excel. Los valores de p se calcularon utilizando 2 muestra de t-test, suponiendo varianzas desiguales. Valores & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
La metformina y la terapia combinada FUOX inhibe el crecimiento de las células resistentes a la quimioterapia HT-29 y HCT-116
El sinérgicamente
Para examinar. si la metformina actúa sinérgicamente con FUOX para inhibir el crecimiento de células de quimioterapia resistente, las células fueron tratadas con dosis crecientes de metformina y FUOX, cada combinación solo o en. Después de 72 h, el crecimiento celular se determinó mediante el ensayo de MTT. curvas de respuesta de dosis Fig 1A & Amp; B muestran que mientras que la metformina 10 mM o 8 × (200 FU mu M y 5 M oxaliplatino) FUOX solo causó ~ 40 y 60% de inhibición, juntos causó una inhibición de ~ 70% y el 80% en CR HT-29 y CR HCT- 116 células respectivamente. Los resultados muestran que la combinación de metformina y FUOX actúa de forma sinérgica para inhibir el crecimiento tanto de CR HCT-116 y las células HT-29 CR. Todos los experimentos posteriores se llevaron a cabo utilizando una de las líneas celulares de cáncer de colon de quimioterapia resistente.
(A) y CR células HT-29 (B) producidas por el método de proporción fija. Fracción de células afectadas por combinación de los dos fármacos (proporción fija) fue mayor que cualquier agente solo. Fa representa la fracción de las células afectadas en respuesta al tratamiento. valores de FA se utilizaron para realizar un análisis de la sinergia por el software Calcusyn como se describe en Materiales y Métodos. C. La supervivencia relativa de las células RC HT-29 en presencia de dosis crecientes de metformina con y sin 2 × FUOX. El tratamiento combinado es más eficaz en todas las concentraciones. Veh: vehículo solo. Cada tratamiento se realizó por cuadruplicado, barras representan la media ± desviación estándar. * Valor de p. & Lt; 0,05
Las fracciones de células afectadas en respuesta a cada tratamiento, se utilizó para realizar el análisis de la sinergia con el software Calcusyn. El CI tal como fue formulada por el software, valores que indican la interacción sinérgica moderada entre los dos agentes en células CR HCT-116 en dosis de metformina 5 mM y superior y una fuerte sinergia a las 10 y metformina 20 mM en las células CR HT-29 (Tabla reveló 1). No sinergismo se observó en las células parentales (datos no mostrados). Como se mantienen las células de quimioterapia resistente en 2 × FUOX (50 M FU, 1,25 M oxaliplatino), al lado se estudió el efecto de la dosis de metformina que van desde 0,6 hasta 20 mM en combinación con 2 × FUOX sobre el crecimiento de CR HT- 29 células. Los resultados muestran que en todas las concentraciones utilizadas, la terapia de combinación fue más eficaz en la inhibición de crecimiento de las células que la metformina sola (Fig. 1C). Las células de quimioterapia resistente eran más resistentes a la FUOX y más sensibles a la terapia de combinación en comparación con las células parentales (datos no mostrados).
metformina y la terapia de combinación FUOX inhibe la formación de colonosphere (número de células madre /vástago como las células)
se informó de que las células supervivientes FUOX se enriquecen en CSC /CSLCs que crecen como grandes, redondos no unidas flotantes colonias esferoides (colonospheres) cuando se cultivan en un medio libre de suero de células madre a una densidad relativamente baja [38] [29]. Figs. 2A y B (panel izquierdo) muestran que en presencia de 2 × FUOX, concentraciones crecientes de metformina disminuyó el número y tamaño de colonospheres. La metformina también indujo apego y se desintegró los colonospheres (Fig. 2A y B (panel derecho)) Cuando los colonospheres se trataron con tripsina y se sembraron en presencia de metformina + FUOX, aumentando el número de esferas pierde sus propiedades madre similares a como se ven a adjuntar a la parte inferior del plato
a & amp; B:. Formación de colonospheres primaria en presencia de metformina y FUOX (panel izquierdo). La inducción de la diferenciación y la fijación de colonospheres en presencia de metformina /FUOX (panel derecho). A: representación gráfica de los números B: fotomicrografías de esferas representativas. C:. El análisis de citometría de flujo de células CD44 y CD166 positivas después del tratamiento con metformina /FUOX
También evaluaron las propiedades de células madre del cáncer de las células tratadas mediante la realización de un extremo ensayo de dilución limitante (ELDA). CR células HT-29 fueron tratadas con metformina + FUOX durante 72 horas y se sembraron en medio de células madre normal. Mientras que la metformina sola redujo la frecuencia para formar colonospheres por 1.5-2 pliegues, el tratamiento combinado redujo por 7-8 pliega la del control no tratado (Tabla 2).
Para determinar si y en qué medida las estrategias actuales de tratamiento afectaría a la proporción de CSC /CSLCs, el flujo se realizó el análisis de citometría siguiente metformina y /o tratamiento FUOX de células HT-29 CR. Los resultados revelaron una reducción (~ 65%) en CD44
/CD166
población de células fenotipo bajo alta, en comparación con los controles tratados con FUOX. Por el contrario, la proporción de CD44
CD166
células de alta /baja aumentó desde 5,12 hasta 7,34% en presencia de FUOX, lo que podría, en parte, deberse a la muerte de las células sensibles FUOX. El tratamiento de combinación redujo la proporción de CD44
alta /CD166
células de baja hasta el 2,8% (Figura 2C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la combinación de metformina y FUOX no sólo disminuye CR de colon CSC población /CSLC, sino que también disminuye sus propiedades de células madre.
terapia de combinación de metformina y FUOX inhibe la migración de células
migración celular se determinó mediante cámara de Boyden (Fig 3A) y los ensayos de curación de heridas (Fig 3B). ensayo de cámara de Boyden indica que mientras que las células parentales HT-29 muestran la migración limitada, CR células HT-29 exhiben fuerte migración hacia Matrigel. Sin embargo, se encontró que la metformina para inhibir la migración de una manera dependiente de la dosis, y la terapia de combinación provocó una reducción adicional: en metformina + FUOX 10 mM, ~ 6 doblez se observó una inhibición de la migración en CR células HT-29 (Fig 3A)
la metformina tratamiento /FUOX reduce la migración de las células HT-29 CR. Cada punto representa una media de 6 lecturas. Las barras representan la media ± desviación estándar (A). Cicatrización de heridas ensayo utilizando endotelial (arriba /rojo) y CRC (inferior /verde). Panel superior izquierdo: herida a 0 h; Panel inferior izquierdo: completa curación de la herida a las 48 horas en CR células HT-29; Panel superior derecho: la curación de heridas parcial en células HT-29 a las 48 h; Panel inferior derecho: la curación de heridas incompleta en células HT-29 CR en presencia de metformina 5 mM /FUOX a las 48 horas (B). Western blot de metformina /FUOX células tratadas CR H29 indican una disminución en los niveles de pAkt (C); cambios relativos en la fosfo-Akt (pAkt) se calcularon como una relación de pAkt /Akt después de la normalización de ß-actina, que se utilizó como control de carga. * P & lt;.
0,05
Herida ensayo de curación se realizó para estudiar la migración de las células HT-29 y CR parentales hacia las células endoteliales. Higo. 3B mostró CR HT-29 y células endoteliales migran hacia la otra. Por 48 horas, la herida se curó completamente por las células del colon CR, mientras que las células parentales mostró sólo ~46% de cierre de la herida (figura 3B). El tratamiento con metformina + FUOX ralentizó el proceso de cicatrización de la herida. Mientras que se observó 54% y el cierre completo de la herida en células HT-29 CR no tratadas a las 24 y 48 horas, respectivamente, la metformina + tratamiento FUOX resultaron en un cierre de la herida 46 y 77% a las 24 y 48 horas respectivamente. Estos resultados confirman además que la metformina + combinación FUOX es eficaz en la contención de las propiedades tumorigénicas /migratorias /invasivo de las células de cáncer de colon de quimioterapia resistente.
Se ha informado de que Akt es un elemento esencial de destino corriente abajo de PI3K para la remodelación de los filamentos de actina para aumentar la migración celular [47]. Esto nos llevó a analizar la expresión /Akt en pAkt metformina y FUOX células tratadas. Western blot reveló disminución de los niveles de pAkt en las células tratadas, en comparación con los controles (Fig. 3). Sugerimos que la vía de señalización PI3K /Akt puede jugar un papel en la regulación de la metformina /inhibición inducida por FUOX de la migración celular.
La metformina y la terapia combinada FUOX disminuye y aumenta la expresión miRNA21 miR145
A la vista de la noción de que el miR-21 es oncogénico, mientras que miR-145 es supresora de tumores, se han analizado sus niveles en células de cáncer de colon quimio-resistentes. Encontramos los niveles de miR21 a ser mayor en las células de cáncer de colon CR [33] y miR145 a ser menor, si se compara con los controles parentales correspondientes (datos no publicados). Los resultados del análisis de PCR cuantitativa en tiempo real mostraron, mientras metformina ya sea solo o junto con FUOX causó una marcada reducción de miR-21expression, indujo miR-145, en comparación con sus respectivos controles (Fig. 4). Baste mencionar que los valores de QRT-PCR para el miR-21 y miR-145 se normalizaron a los niveles de RNU6B
C:. Metformina /tratamiento FUOX de las células HCT CR-116 inhibe la actividad transcripcional de TCF /LEF. D: Western blot se muestra una expresión reducida de β-catenina y c-myc en metformina /FUOX células tratadas CR HCT-116. ß-actina se utilizó como control de carga. * P & lt;.
0,05
A medida que la señalización Wnt /β-catenina desempeña un papel fundamental en la regulación de la proliferación de células madre del cáncer de colon, el próximo estudió el efecto del tratamiento con metformina sobre la actividad de β-catenina, su expresión y los niveles de su proteína diana c-myc. El tratamiento de combinación de metformina y FUOX causada ~ 50% de disminución en la actividad transcripcional de TCF /LEF en células CR HCT-116, en comparación con los controles no tratados (Fig 4C). El análisis de transferencia Western mostró una marcada disminución en los niveles totales de β-catenina, así como la expresión de c-myc en células CR HCT-116. En conjunto, los resultados sugieren una inhibición de la señalización /β-catenina Wnt en células de cáncer de colon de quimioterapia resistente en respuesta a la terapia de combinación de metformina y FUOX.
terapia de combinación de metformina y FUOX retarda el crecimiento de tumores en ratones SCID
Para examinar la eficacia terapéutica de la combinación de metform y FUOX, se utilizó el modelo de xenoinjerto de ratones SCID de tumor de colon. CR HCT-116 o células CR HT-29 se inyectaron por vía subcutánea en la región de flanco de ratones SCID. Después se formaron tumores palpables, un grupo fue alimentado con la metformina en el agua de bebida y también se inyectó (i.p.) con FUOX, una vez a la semana durante 3 semanas. El crecimiento tumoral se mide calculando el volumen del tumor durante 34 días. Los xenoinjertos formados por células CR HCT-116 mostraron un crecimiento lineal hasta 27 días, después de lo cual el crecimiento del tumor más lento. Un patrón de crecimiento similar se observó en la metformina /FUOX ratones tratados, aunque el crecimiento fue significativamente menor en comparación con los controles. Por día 34 después de la inyección, no hubo una reducción estadísticamente significativa (casi 50%) en el tamaño del tumor en metformina /FUOX ratones tratados (Fig 5A panel de la izquierda). CR células HT-29 ratones inyectados mostraron una tasa de crecimiento del tumor lento inicialmente. Sin embargo, una etapa de crecimiento se observó en los animales de control después de 27 días. Por otra parte, la metformina /FUOX ratones tratados mostraron una rápida disminución en el volumen del tumor después de 27 días.
Las barras representan la media ± error estándar. * P & gt; 0,05. PCR en tiempo real cuantitativa en ARN extraído de células aisladas de la CR HT-29 tumor (B). los niveles de CD44 disminuyeron y los niveles de CK20 aumentaron en metformina /xenoinjertos FUOX tratados. formación Colonosphere en las células aisladas de CR-HT-29 xenoinjertos (C).
Se recogieron las tumores, y suspensiones de células individuales se cultivaron en medio de células madre. En tiempo real se realizó un análisis qPCR, que mostró una disminución significativa en CD44 y el aumento de los niveles de ARNm de CK20 en las células tumorales forman /los ratones tratados con FUOX metformina (Fig 5B).